轉染效率的檢測方法有哪些

『壹』 如何用流式細胞儀檢測轉染細胞的效率

1. 陰性對照最好用轉染無GFP載體的細胞，因為轉染可能會改變細胞的自發熒光本地

2. 確保陰性對照和實驗細胞的濃度相同，具體多少倒是無所謂，不要太稀釋就好

3. 上機前，用細胞濾網過濾掉大塊未消化的雜質

4. 不要固定，GFP固定後熒光強度會下降。
   

『貳』 如何鑒定細胞的轉染效率

通常是帶上一個報告基因，比如綠色熒光蛋白，然後在鏡下觀察看發光的和不發光的細胞比

『叄』 轉染效率檢測方法

除了直接在熒光顯微鏡下觀察計數，現在很多細胞計數儀也有相應功能，推薦瑞沃德的熒光細胞計數儀，上樣之後就能直接查看相應結果。

『肆』 如何鑒定細胞的轉染效率

IF\ FCM 等方法。

『伍』 用那種方法可以提高RAW 264.7細胞轉染效率

在6孔板中用Zeta Life Advanced DNA RNA轉染試劑高效率轉染RAW 264.7細胞方法總結。

實驗方案如下：

一、質粒DNA准備

1、質粒DNA濃度700ng/ul（注意：①溶解於無菌雙蒸水或超純水；②無內毒素），

二、操作流程

1、先將細胞接種到6孔板細胞培養板，細胞匯合度在70%左右，再進行轉染。

2、復合物制備：將質粒DNA與Zeta Life Advanced DNA RNA AD600150轉染試劑按照1:1（12ug:12ul）關系直接混合，用移液器吹吸10-15次混勻，室溫靜止10-15分鍾。

3、將復合物加入完全培養基的細胞培養板，並輕輕混勻，放入培養箱中繼續培養（不建議把復合物加入到無血清的培養基裡面，後期會進一步摸索此條件）。

4、轉染24小時後對細胞進行正常換液。

5、質粒DNA轉染48小時後熒光檢測轉染效率

下圖是轉染raw 264.7細胞的熒光和明場圖片

三、RAW 264.7細胞簡述：

RAW 264.7小鼠單核巨噬細胞白血病細胞. 此細胞株源自雄性Abelson鼠科白血病病毒誘導的腫瘤。 sIg-, Ia-抗原、Thy-1.2表面抗原陰性。此細胞株不分泌可檢測到的病毒顆粒，XC斑點形成試驗陰性。 可以胞飲中性紅並吞噬乳膠顆粒與酵母聚糖。 可以抗體依賴性地分解綿羊紅血球與腫瘤靶細胞。

『陸』 是否瞬轉成功如何檢測

博凌科為解答：可以先使用有熒光蛋白的空載體驗證整個系統的轉染效率，用流式檢測就可以了，非常方便。確定轉染效率沒有問題後可以轉染帶有目的基因的質粒。對於轉染效果的驗證主要取決於你的目的蛋白的性質。主要是mRNA和蛋白水平的驗證。mRNA水平可以使用普通PCR或者定量PCR，前者是定性， 後者定量。但是最主要的還是蛋白水平的檢測，如果是膜蛋白，那麼流式檢測最方便，如果是胞外分泌型那麼可以用上清做ELISA或者Western都可以， 如果是胞漿分泌型的那麼就用Western或者流式都可以。

『柒』 siRNA實驗方法和設計常見問題解答

Q:如何選擇轉染方法和轉染試劑？

A:我們的siRNA適用於各種轉染方法。轉染方法和轉染試劑的選擇，需要根據細胞來選擇，對於容易轉染的細胞，常用的轉染方法是脂質體轉染。

Q:對於難轉染的細胞，應該如何提高其轉染效率？轉染效率又該如何確定？

A:1)對於貼壁細胞，推薦採用轉染試劑轉染即可；2)對於難轉染的細胞的轉染，如何提高轉染效率的問題也是目前研究的技術難題。一般建議使用電轉的方法，但是由於電轉的方法對細胞損傷比較大，該方法也未必是最佳的。

轉染效率的確定，常用的是使用熒游標記的siRNA，通過熒光顯微鏡，共聚焦顯微鏡，流式細胞儀檢測的方法。具體可以參考我們的產品說明書。

Q:細胞的轉染效率是否與siRNA序列相關？

A:轉染效率的高低取決於與細胞自身及轉染方法，而於siRNA的序列並沒有直接關系。因此，siRNA在不同的細胞轉染效率可能不一樣。

Q:轉染siRNA時候的細胞密度多少為宜？

A:依不同的轉染方法或轉染試劑而定。如使用lipofectamine 2000作為轉染試劑，單獨轉染siRNA，30%～50%密度較佳；而siRNA與質粒共轉染，密度可以到80%-90%。

Q:siRNA轉染時的培養基要求，可否含血清？

A:不同的轉染試劑可能有不同的要求，對於lipofectamine 2000，在配製siRNA和lipofectamine 2000混合物時不能含有血清，但細胞培養基可以含有血清，但不能含有抗生素。

Q:siRNA的儲存液體濃度和工作濃度有何區別？

A:siRNA的貯存濃度就是保存的最佳濃度，銳博推薦的貯存液濃度為20 μM；而siRNA的工作濃度就是使siRNA能夠達到最佳沉默效果的轉染濃度，一般10～100 nM范圍內，銳博生物推薦的轉染濃度是50nM。

Q:轉染時該如何分組？分組的目的是什麼？

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Q:為什麼說陽性對照在RNA干擾實驗中很重要？

A:陽性對照作為一個實驗系統檢查是很重要的。也就是說，當您看到siRNA陽性對照的預期實驗結果時，您能確保在您的實驗方法中您的轉染、RNA提取物和檢測方法是可靠的。

Q:陽性對照及其陰性對照在RNAi實驗中的作用？如何選擇？

A:陽性對照指的是已經驗證的針對看家基因或報告基因有效的siRNA，用於監測實驗體系和實驗方法的可行性。我們可以提供的陽性對照siRNA有針對GAPDH，ACTB，GFP/EGFP有效的siRNA作為陽性對照，客戶可以根據具體的實驗需要選擇。陰性對照往往是非特異的siRNA，主要用於說明siRNA作用的特異性。陰性對照的選擇可以是通用的序列（universal）或是隨機打亂的序列（scramble），客戶可以根據實驗要求選擇。

Q:用熒光對照siRNA如何檢測轉染效率？是不是每次實驗都必須做？

A:我們提供的轉染對照siRNA帶有Cy3或Cy5熒游標記，可以通過熒光顯微鏡，共聚焦顯微鏡，流式細胞儀等熒光檢測儀器檢測。 除此之外，還應該通過陽性對照實驗進一步確定。轉染效率的高低主要與細胞自身相關，同等實驗條件下，每次轉染細胞轉染效率應該是相近的，因此可以不必每次都做。但如果每次實驗都做一個熒光對照組，將會更加便於排除一些實驗問題。

Q:siRNA熒光染料的最大吸收率和發射率各在哪個波段？

A:FAM在495nm處有最大吸收率，在520nm處有最大發射率。

Cy3在550nm處有最大吸收率，在565nm處有最大發射率。

Cy5在643nm處有最大吸收率，在667nm處有最大發射率。

Q:轉染後出現細胞死亡是什麼原因？如何優化轉染條件？

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Q:到了轉染時間發現細胞密度太低，該如時轉染還是讓細胞多長一天再轉染？

A:細胞生長需要一定的密度，而轉染試劑對細胞有一定的毒性，如果轉染時細胞密度過低，細胞可能會因此生長異常甚至死亡。轉染前要求良好的細胞狀態和細胞活性，一般也不建議用生長幾天的細胞做轉染。

Q:siRNA的作用效果應該如何檢測？

A:通常可以從三個方面來相互驗證siRNA的作用效果

3）根據目的基因的功能，從細胞表型的水平檢測。

Q:siRNA在細胞內可以作用多長時間？什麼時候才是最好的檢測時間？

A:siRNA介導的RNAi屬於瞬時現象，不能穩定傳代，一般其作用時間不可能維持很長時間，通常建議在轉染後3 4天內完成檢測。最佳檢測時間，因細胞、目的基因而異，多在轉染後24 48小時之間檢測。

Q:為什麼要強調mRNA水平檢測？可以直接檢測蛋白和功能嗎？

A:siRNA直接作用於mRNA，因此mRNA水平檢測是最直接在指標。

很多客戶認為，mRNA的降解直接的結果應該是對應蛋白質含量的下降，因此蛋白水平的檢測結果也應該可以作為有效性的檢測指標。事實上，很多情況下往往出現，mRNA下降水平與蛋白下降水平不對應的現象。其可能原因有：

Q:干擾效率多高才是好的靶點？

A:沒有明確的界定，干擾效率高低因不同的細胞類型和不同的基因而異。不同細胞類型的轉染效率也不盡相同，不同基因的表達水平也相差較大，主要看干擾效果而定。

Q:沉默效果不理想，應該如何處理？

A:最常見的影響沉默效果的兩個原因是：轉染效率低和siRNA序列設計的效果不理想。如果您初次使用siRNA或採用了新的細胞系，並發現沉默效果不佳，我們建議您對轉染效率進行檢測，並選擇優化轉染條件。如果您已經對實驗轉染條件進行優化但是問題依然存在，我們建議您換用另一種轉染試劑或是採用其他技術，這也許能提高轉染效率。如果已經提高了轉染效率但是沉默效果仍然未達到要求，可能是因為siRNA序列設計的效果不理想。

Q:siRNA反而使得目的基因表達上調了，這是什麼原因？該怎麼解決？

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Q:我從陰性對照實驗中得到和特異性RNAi相同的結果，這說明了什麼？

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Q:各組陰性對照的檢測結果是否應該一樣？如果偏差很大該怎麼辦？

A:正常情況下，各組陰性對照的檢測結果應該是相近的。如果偏差過大，只需考慮實驗結果的准確性。另外，對於一些特定的基因，比如與細胞難受壓力相關的基因，又如參與細胞免疫的基因，可能會對外界壓力比較敏感，使得各組對照的基因表達發生變化不一致。

Q:用100nM 的siRNA轉染時只得到50%沉默效率，我可以把siRNA的濃度增加到200nM甚至400nM嗎？

A:當干擾效率不佳時，可以在一定范圍內適當優化轉染濃度，通常優化的范圍是10~150nM，但不宜過大，高濃度的siRNA將可能增加非特異性作用的可能性並對細胞產生毒性。

Q:同樣的siRNA，為什麼在細胞A很有效，在細胞B則沒有效果？

A:不同細胞的轉染效率不一樣、基因表達水平也不一樣，這些都與siRNA的作用效率有關
siRNA實驗方法和設計常見問題解答- 答疑集錦- 非編碼RNA研究策略-銳博技術專題專題—丁香園會議頻道 (dxy.cn)

『捌』 如何用流式細胞術測定細胞轉染率

轉染成功一般都會表達GFP蛋白,這個蛋白在流式上面可以用FL1通道檢測到.轉染成功的有表達,不成功的沒表達,很容易算出細胞轉染率.