內生菌純化方法有哪些

⑴ 內生菌的純種分離最適宜用什麼方法，操作中還應注意什麼（比如儀器，操作環境等） 新手求問啊

內生菌分為內生細菌、真菌、放線菌。三種菌的分離方法各不相同。內生菌分離過程中最重要的是消毒方法的建立，這個要根據你的樣品設計，參考一下文獻，看一下別人用什麼消毒，一般是酒精和次氯酸鈉。自己摸索好消毒時間和濃度，因為不同的樣品，所要求的消毒時間不同。
消毒方法確立後，再就是培養基的選擇，這個你可以參考文獻，根據目的不同設計培養基。
純化過程中最好每天固定時間看一下菌落生長情況，及時再次純化。

⑵ 分離植物內生菌，可以用什麼表面消毒方法

：１）在無菌工作台內，將欲分離內生菌的宿主樣品用無菌水清洗；２）選用消毒後的密封容器，使上述清洗後的宿主樣品完全浸沒於所述密封容器內的無菌水中；３）然後將上述密封容器放入超聲波消毒機的水槽內進行消毒，所述超聲波消毒機的工作頻率為１５～２５ＫＨｚ、功率為５０～２００Ｗ、時間為１０～３０分鍾。採用本發明的消毒方法，既能充分消滅宿主表面的雜菌，又能最大限度減少宿主內生菌的損傷。

⑶ 如何純化菌種

菌種在分離、保藏和生產過程中，極易遭致雜菌污染，因此必須對染有雜菌的菌種進行提純，方能用於生產。根據污染的類型和程度，需採用不同的純化措施。
（1）排除細菌或酵母菌污染
在菌種培養中，用肉眼仔細觀察培養基表面，不難發現被細菌或酵母菌污染的分離物常出現黏稠狀的菌落。取被純化物接種在無冷凝水、硬度較高（瓊脂用量2.3%～2.5%）的斜面上，再降低培養溫度至15～20℃，利用某些大型真菌在較低的溫度下，菌絲生長速度比細菌蔓延速度快的特點，用尖細的接種針切割菌絲的前端，轉接到新的試管斜面培養基中培養，連續2～3次就能獲得所要的純菌絲。也可打破試管，挑取內部長有基內菌絲的瓊脂塊，移入無冷凝水的培養基上，該法適於被好氣性細菌污染的母種。
（2）排除黴菌污染
黴菌和細菌不同，它和食用菌菌絲很相似，也有氣生菌絲和基內菌絲。分離的方法主要是抑制雜菌生長，拉大食用菌菌絲生長和雜菌菌絲生長的范圍差，從食用菌菌落前端切割，移植入新培養基。雜菌發現越早，分離的成功率越大。嚴格地說，在斜面培養基上的非接種部位發現的白色菌絲，應認為是雜菌菌落，應馬上提純。若有色孢子已出現，一方面易使分生孢子飄散，另一方面其基內菌絲早已蔓延，可能和食用菌菌絲混生一起。如黴菌剛出現孢子且尚未成熟、變色，則可採用前端菌絲切割法提純。轉管時先將菌絲接種在斜面尖端，當長滿斜面後，及時將原接種點連同培養基一起挖掉；如黴菌菌落顏色已深，說明孢子已成熟，稍一振動孢子就會飄滿培養基，若再行上法意義不大。如菌絲蔓延范圍較大，可將0.2%升汞溶液或1%多菌靈處理過的濕濾紙塊覆蓋在黴菌的菌落上，可抑制黴菌生長，防止孢子擴散，後用滅菌接種鏟將表層鏟掉，隨之用接種針鉤取基內菌絲移入新的培養基，如此2～3次。
（3）限制培養
取直徑7～10毫米、高4～6毫米的玻璃環或不銹鋼環，經酒精燈火焰灼燒後趁熱放到斜面培養基中央，將環的一半嵌入培養基內，然後將染有細菌的接種塊放入環內進行培養。細菌生長會被限制在環內，而食用菌菌絲則可越過環而長到環外的培養基上，轉管後即可得到純化。
（4）覆蓋培養
在污染了細菌的食用菌菌絲斜面上傾注一層厚約2毫米的培養基，培養一段時間，當食用菌菌絲透過培養基形成新的菌落時，即可切割轉管。最好進行二次覆蓋。
（5）基質菌絲純化培養
對棉塞長有黴菌的試管斜面，可將試管打碎，取出培養基，用0.1%升汞浸泡2分鍾，用無菌水淋洗，再用無菌濾紙吸干。取一段2厘米的培養基從中部切開，在斷面上用無菌刀片切成米粒大小的塊，移入新的斜面上進行培養。
（6）葯物處理
菌種提純時，可向培養基中注入選擇性強的抗菌制劑，如加入 5～10毫克/升的多菌靈（MBC）、涕必靈（TBZ）或托布津等，可有效地防止菌霉混生；在每毫升培養基中加入30～40毫克鏈黴素、20～30毫克四環素、金黴素，或50毫克高錳酸鉀，可以有效地防止細菌混生；加入灰黃黴素（20單位/毫升），可抑制真菌生長。
（7）破碎菌絲
從試管中取出已污染的培養基，放在0.1%升汞水中處理2分鍾，用無菌水沖洗，無菌紙吸干，再放入有玻璃珠的無菌水內，經組織破碎，稀釋後注入平板培養，取其單個菌落純化培養。

⑷ 分離純化乳酸菌的方法

（1）分離純化乳酸菌時，首先要用無菌水對泡菜濾液進行梯度稀釋．泡菜濾液中乳酸菌的濃度高，直接分離很難分離到單個菌落，因此需要對泡菜濾液進行梯度稀釋．
（2）在分離純化所用的培養基中加入碳酸鈣的作用是中和乳酸菌代謝過程中產生的乳酸和利於乳酸菌的識別和分離；分離純化時應挑選出在平板上有透明圈的菌落作為候選菌．
（3）若該同學採用稀釋塗布平板法來檢測泡菜濾液中乳酸菌的含量，先將lmL泡菜濾液稀釋100倍，在3個平板上用塗布法分別接入0．lmL稀釋液，經適當培養後，3個平板上的菌落數分別為39、38和37．據此可得出每毫升濾液中的活菌數為=（39+38+37）÷3÷0.1×100=3.8×10 ⁴ 個．
（4）若對篩選得到的乳酸菌進一步純化，宜採用的純化方法是平板劃線法．乳酸菌在20℃長期保存時，菌液中常需要加入一定量的甘油．
故答案為：
（1）泡菜濾液中乳酸菌的濃度高，直接分離很難分離到單個菌落（為了聚集在一起的微生物分散成單個細胞，從而能在培養基表面形成單個菌落）
（2）鑒別乳酸菌 具有透明圈
（3）3.8×10 ⁴
（4）平板劃線法 甘油

⑸ 分離純化微生物的方法有哪些各方法適用分離什麼菌種

主要有：劃線法、倒平板法、塗布法，根據分離的菌種選擇不同的培養基。

稀釋混合倒平板法、稀釋塗布平板法、平板劃線分離法、稀釋搖管法、液體培養基分離法、單細胞分離法、選擇培養分離法等。其中前三種方法最為常用，不需要特殊的儀器設備，分離純化效果好。

從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物分離與純化。在分子生物學的研究及應用中，不僅需要通過分離。

分離技術

主要是稀釋和選擇培養，稀釋是在液體中或在固體表面上高度稀釋微生物群體，使單位體積或單位面積僅存留一個單細胞，並使此單細胞增殖為一個新的群體。最常用的為平板劃線法。

如果所要分離的微生物在混雜的微生物群體中數量極少或者增殖過慢而難以稀釋分離時，需要結合使用選擇培養法，即選用僅適合於所要分離的微生物生長繁殖的特殊培養條件來培養混雜菌體，改變群體中各類微生物的比例，以達到分離的目的。為保證分離到的微生物是純培養，分離時必須用。

以上內容參考：網路-微生物分離純化

⑹ 植物內生真菌的鑒定方法步驟有哪些

來源鑒定、性狀鑒定、顯微鑒定及理化鑒定等方法。
（一）來源鑒定法
又稱基原鑒定法，是應用植（動、礦）物分類學的知識，對中葯的來源進行鑒定，確定其正確的學名，以保證應用品種准確無誤。
1．來源鑒定的內容：包括原植（動）物的科名、植（動）物名、拉丁學名、葯用部位，礦物葯的類、族、礦石名或岩石名。
2．原植物鑒定的步驟：①觀察植物形態；②核對文獻；③核對標本。
中葯的原植物鑒定，除經典分類學方法外，還可使用化學分類學、細胞分類學、數值分類學、DNA分類學方法和技術。
（二）性狀鑒定法
就是用眼看、手摸、鼻聞、口嘗、水試、火試等十分簡便的方法來鑒別葯材的外觀性狀，這些方法積累了豐富的傳統鑒別經驗，具有簡單、易行、迅速的特點。 性狀鑒定的內容包括形狀、大小、色澤、表面特徵、質地、折斷面的特徵、氣、味、水試、火試等。
1． 葯材 ：
⑴ 形狀 ：葯材的形狀與葯用部位有關，每種葯材的形狀一般比較固定。
⑵ 大小 ：指葯材的長短、粗細（直徑）和厚度。
⑶ 色澤 ：葯材的顏色與成分有關，顏色是否符合要求，是衡量葯材質量好壞的重要因素之一。一般應在自然光下觀察葯材的顏色，如用兩種色調復合描述色澤時，應以後一種色調為主色。
⑷ 表面特徵 ：指葯材表面是光滑還是粗糙，有無皺紋、皮孔、鱗片、毛茸或其它附屬物等。
⑸ 質地 ：指葯材的輕重、軟硬、堅韌、疏鬆（或泡松）、緻密、黏性、粉性、油潤、角質、綿性、柴性等特徵。
⑹ 斷面特徵：包括自然折斷面和橫切面。
⑺ 氣 ：「氣」是由於葯材含有揮發性物質的緣故，也是葯材的重要鑒定特徵之一。
⑻ 味：葯材的味感是由其所含的化學成分決定的，每種葯材的味感是比較固定的。味感也是衡量葯材品質的標准之一。
⑼ 水試 ：有些葯材放入水中，能產生特殊的現象，如沉浮、溶解情況、顏色、透明度、有無黏性、膨脹度、旋轉與否及有無熒光等。
⑽ 火試 ：有些葯材用火燒之，能產生特殊的香氣或臭氣，會有顏色、煙霧、閃光或響聲等現象出現，可據此鑒別其真偽甚至優劣。
三）顯微鑒定法
是利用顯微鏡來觀察葯材的組織構造、細胞形狀以及內含物的特徵，礦物的光學特性，以及利用顯微化學方法，確定細胞壁及細胞內含物的性質或某些品種有效成分在組織中的分布，用以鑒定葯材的真偽和純度甚至品質，以及對中成葯是否按處方規定投料進行鑒定。
1．顯微製片方法
包括有橫切片或縱切片、表面製片、粉末製片、解離組織片、花粉粒與孢子製片、磨片製片、含粉末葯材的制劑顯微製片等。
2．植物細胞壁和內含物的鑒別
3．顯微測量
目鏡測微尺先用鏡台測微尺標化，然後在顯微鏡下測量細胞及細胞內含物的大小。通常是在高倍物鏡下進行測量，但欲測量較長的纖維、非腺毛等的長度時，則在低倍物鏡下測量，記錄最大值與最小值。
4．顯微常數測定
常見的顯微常數主要有用於葉類鑒別的氣孔數、氣孔指數、柵表比、脈島數和脈端數等。這些顯微常數常因植物種類不同而異，而同種植物則較為恆定，對於葉類、某些帶葉的全草類和花類葯材的品種鑒定有重要意義。
5．常用封藏試液
⑴ 蒸餾水、稀甘油：適用於觀察澱粉粒、油滴、樹脂等細胞內含物及細胞壁的顏色。
⑵ 甘油醋酸試液：使澱粉粒不膨脹，特別適宜澱粉粒的觀察與顯微測量。
⑶ 水合氯醛試液：可使皺縮的細胞膨脹；可溶解多種色素，如葉綠素及樹脂、澱粉粒、蛋白質、菊糖、揮發油，而各種晶體不溶解；有清凈、透明作用，使細胞、組織透明，便於觀察細胞形狀和組織構造及細胞內含的各種結晶體。
6．掃描電子顯微鏡和偏光顯微鏡的應用
⑴ 掃描電子顯微鏡：解析度高，可達3nm，放大倍數一般可達幾十萬倍，圖像富有立體感。
⑵ 偏光顯微鏡：主要用於觀察和分析礦物類中葯的光學性質，也可用於研究動物和植物類中葯的組織及細胞內含物，如澱粉粒、草酸鈣簇晶等。對於透明礦物，一般使用透射光源的偏光顯微鏡；對於不透明礦物則使用放射光源的偏光顯微鏡。
（四）理化鑒定法
1．物理常數的測定
包括相對密度、旋光度、折光率、硬度、黏稠度、沸點、凝固點、熔點等的測定。這對揮發油類、油脂類、樹脂類、液體類葯（如蜂蜜等）和加工品類（如阿膠等）葯材的真實性和純度的鑒定，具有特別重要的意義。
2．一般理化鑒別
⑴ 化學定性分析：利用葯材中的化學成分能與某些試劑產生特殊的氣味、顏色、沉澱或結晶等反應來鑒別中葯的真偽。
⑵ 微量升華：利用中葯中所含的某些成分，在一定溫度下能升華的性質獲得升華物，在顯微鏡下觀察其結晶性狀、色澤，或取升華物加試液觀察反應。
⑶ 熒光分析：利用中葯中所含的某些化學成分在紫外光或常光下能產生一定顏色的熒光的性質進行鑒別。紫外光燈的波長為365nm，如用短波（254～265nm）時應加以說明。
⑷ 顯微化學分析：將葯材的切片、粉末或浸出物等置於載玻片上，加某些化學試劑後產生沉澱或結晶，在顯微鏡下觀察其形狀和顏色進行鑒別。利用顯微和化學方法確定中葯有效成分在中葯組織構造中的部位，稱為顯微化學定位試驗。
⑸ 泡沫指數和溶血指數：利用皂苷的水溶液振搖後能產生持久性的泡沫和溶解紅血球的性質，可測定含皂苷類成分葯材的泡沫指數或溶血指數作為質量指標。
3．檢查
⑴ 水分測定法：2005年版《中國葯典》水分測定法有四種，即烘乾法、甲苯法、減壓乾燥法和氣相色譜法。
⑵ 灰分測定法：2005年版《中國葯典》灰分測定法包括總灰分測定法和酸不溶性灰分測定法。
⑶ 膨脹度的測定：膨脹度是葯品膨脹性質的指標，系指按乾燥品計算，每1g葯品在水或其它規定的溶劑中，在一定的時間與溫度條件下膨脹後所佔有的體積（ml）。主要用於含黏液質、膠質和半纖維素類的天然葯品。
⑷ 酸敗度：是指油脂或含油脂的種子類葯材，在貯藏過程中發生復雜的化學變化，產生游離脂肪酸、過氧化物和低分子醛、酮類分解產物，因而出現臭味，影響葯材的感觀性質和內在質量。
⑸ 色度檢查：利用比色鑒別法檢查葯材在貯藏過程中有色雜質的限量，如白術。
⑹ 有害物質的檢查：中葯中的有害物質主要有內源性的有害物質和外源性的有害物質。
①內源性的有害物質：
②外源性有害物質：
4．色譜法
⑴ 薄層色譜法：是用於定性鑒別最多的色譜法之一。
⑵ 高效液相色譜法
⑶ 氣相色譜法：適用於含揮發油及其它揮發性組分的中葯及中成葯的分析。
⑷ 蛋白電泳色譜法：用於動物葯、果實種子類及根莖類等含蛋白質及氨基酸的葯材的真偽鑒別。
⑸ 高效毛細管電泳
5．分光光度法
包括紫外－可見分光光度法、紅外分光光度法和原子吸收分光光度法。常用波長范圍為：200～400nm的紫外光區；400～760nm的可見光區；2.5～25um（按波數計為4000～400cm－1）的紅外光區。
6．色譜－光譜聯用儀分析法
7．浸出物測定
對某些中葯的有效成分尚未清楚或尚無精確定量方法的中葯，一般可根據已知成分的溶解性質選用溶劑進行浸出物的測定。通常選用水、一定濃度的乙醇（或甲醇）、乙醚作浸出物測定。有冷浸法和熱浸法。測定前供試品需粉碎，使能過二號篩。
8．含量測定
⑴ 含量測定方法：既有經典分析方法（容量法、重量法等）又有現代儀器分析法（如紫外－可見分光光度法、氣相色譜法、薄層掃描法、高效液相法等）。
⑵ 揮發油含量測定方法有兩種：①甲法適用於測定相對密度在1.0以下的揮發油；②乙法適用於測定相對密度在1.0以上的揮發油。
（五）新技術和新方法簡介
1．DNA分子遺傳標記技術
2．中葯指紋圖譜鑒定技術

⑺ 植物內生菌分離方法

植物內生放線菌是一類大有開發潛力的微生物資源。目前使用的分離條件和技術尚不完善，容易被外源菌和內生真菌、細菌污染，因此內生放線菌尤其是稀有內生放線菌的選擇性分離技術至少是今後一段時間研究的重點。介紹了植物內生放線菌選擇性分離方法並提出值得研究的問題。 (

⑻ 植物的內生菌怎麼提取具體的實驗步驟怎麼做

這個實驗已經有人做過了，不管是實驗設計還是濃度確定，都有經典實驗了，參照現成的就可以。

具體參見文獻「超積累植物龍葵內生菌強化鎘植物修復的初步研究」

實驗設計具體參見原始文獻「BarzantiR,OzinoF,BazzicalupoM,etal.

.MicrobialEcology,

2007,53:306-316」

知網上都有.

⑼ 急急急~請問哪位高人知道植物內生真菌的分離方法

從元江仙人掌的莖中分離到一株產廣譜、高活性抑菌物質的內生真菌，經測定對細菌、植物病原真菌和皮膚致病真菌共21種病原微生物有較為明顯的抑製作用。形態特徵表明，該菌株與麴黴屬（Aspergillus）中的土生麴黴（Aspergillus terreus）的特徵基本一致，18SrDNA序列分析顯示本菌株與土生麴黴的同源性高於99％，但該菌株的分生孢子梗上有明顯的瘤狀突起，不同於模式菌株。因此認為該菌株為土生麴黴的一個變種，命名為土生麴黴雲南變種（Aspergillus terreus vat．yunnanensis）。並對其活性物質的生產條件進行了初步摸索，確定用查氏培養基為最佳種子培養基，PDA培養基為最佳發酵培養基，4d為最適發酵時間。

⑽ 純化菌種，為了得到單菌落，常採用的接種方法有嗎些

常採用的接種方法有兩種：一個是平板劃線法，另一個是稀釋塗布平板法。這倆種最為常用且操作相對簡易。