生物大分子濃縮的主要方法有哪些

❶ 如何利用透析法進行脫鹽濃縮蛋白

二、蛋白質的分離純化
蛋白質的分離純化方法很多，主要有：
（一）根據蛋白質溶解度不同的分離方法
1、蛋白質的鹽析
中性鹽對蛋白質的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質的溶解度增加，此稱鹽溶；當鹽濃度繼續升高時，蛋白質的溶解度不同程度下降並先後析出，這種現象稱鹽析，將大量鹽加到蛋白質溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的SO4和NH4)有很強的水化力，可奪取蛋白質分子的水化層，使之「失水」，於是蛋白質膠粒凝結並沉澱析出。鹽析時若溶液pH在蛋白質等電點則效果更好。由於各種蛋白質分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調節混合蛋白質溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質分段沉澱。
影響鹽析的因素有：（1）溫度：除對溫度敏感的蛋白質在低溫（4度）操作外，一般可在室溫中進行。一般溫度低蛋白質溶介度降低。但有的蛋白質（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25度）比0度時溶解度低，更容易鹽析。（2）pH值：大多數蛋白質在等電點時在濃鹽溶液中的溶介度最低。（3）蛋白質濃度：蛋白質濃度高時，欲分離的蛋白質常常夾雜著其他蛋白質地一起沉澱出來（共沉現象）。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質含量在2.5-3.0%。
蛋白質鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。
其中應用最多的硫酸銨，它的優點是溫度系數小而溶解度大（25度時飽和溶液為4.1M，即767克/升；0度時飽和溶解度為3.9M，即676克/升），在這一溶解度范圍內，許多蛋白質和酶都可以鹽析出來；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質變性。硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間，當用其他pH值進行鹽析時，需用硫酸或氨水調節。
蛋白質在用鹽析沉澱分離後，需要將蛋白質中的鹽除去，常用的辦法是透析，即把蛋白質溶液裝入秀析袋內（常用的是玻璃紙），用緩沖液進行透析，並不斷的更換緩沖液，因透析所需時間較長，所以最好在低溫中進行。此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽，所用的時間就比較短。
2、等電點沉澱法
蛋白質在靜電狀態時顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小，各種蛋白質的等電點有差別，可利用調節溶液的pH達到某一蛋白質的等電點使之沉澱，但此法很少單獨使用，可與鹽析法結合用。
3、低溫有機溶劑沉澱法
用與水可混溶的有機溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數蛋白質溶解度降低並析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質較易變性，應在低溫下進行。
（二）根據蛋白質分子大小的差別的分離方法
1、透析與超濾
透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質分開。
超濾法是利用高壓力或離心力，強使水和其他小的溶質分子通過半透膜，而蛋白質留在膜上，可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質。
2、凝膠過濾法
也稱分子排阻層析或分子篩層析，這是根據分子大小分離蛋白質混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠（Sephadex
ged）和瓊脂糖凝膠（agarose gel）。
（三）根據蛋白質帶電性質進行分離
蛋白質在不同pH環境中帶電性質和電荷數量不同，可將其分開。
1、電泳法
各種蛋白質在同一pH條件下，因分子量和電荷數量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳，這是利用一種兩性電解質作為載體，電泳時兩性電解質形成一個由正極到負極逐漸增加的pH梯度，當帶一定電荷的蛋白質在其中泳動時，到達各自等電點的pH位置就停止，此法可用於分析和制備各種蛋白質。
2、離子交換層析法
離子交換劑有陽離子交換劑（如：羧甲基纖維素；CM-纖維素）和陰離子交換劑（二乙氨基乙基纖維素；DEAE?FONT
FACE="宋體"
LANG="ZH-CN">纖維素），當被分離的蛋白質溶液流經離子交換層析柱時，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質被吸附在離子交換劑上，隨後用改變pH或離子強度辦法將吸附的蛋白質洗脫下來。（詳見層析技術章）
（四）根據配體特異性的分離方法－親和色譜法
親和層析法（aflinity
chromatography）是分離蛋白質的一種極為有效的方法，它經常只需經過一步處理即可使某種待提純的蛋白質從很復雜的蛋白質混合物中分離出來，而且純度很高。這種方法是根據某些蛋白質與另一種稱為配體(Ligand）的分子能特異而非共價地結合。其基本原理：蛋白質在組織或細胞中是以復雜的混合物形式存在，每種類型的細胞都含有上千種不同的蛋白質，因此蛋白質的分離（Separation），提純（Purification）
和鑒定（Characterization）是生物化學中的重要的一部分，至今還沒的單獨或一套現成的方法能移把任何一種蛋白質從復雜的混合蛋白質中提取出來，因此往往採取幾種方法聯合使用。
細胞的破碎
1、高速組織搗碎：將材料配成稀糊狀液，放置於筒內約1/3體積，蓋緊筒蓋，將調速器先撥至最慢處，開動開關後，逐步加速至所需速度。此法適用於動物內臟組織、植物肉質種子等。
2、玻璃勻漿器勻漿：先將剪碎的組織置於管中，再套入研桿來回研磨，上下移動，即可將細胞研碎，此法細胞破碎程度比高速組織搗碎機為高，適用於量少和動物臟器組織。
3、超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震盪破裂，此法多適用於微生物材料，用大腸桿菌制備各種酶，常選用50-100毫克菌體/毫升濃度，在1KG至10KG頻率下處理10-15分鍾，此法的缺點是在處理過程會產生大量的熱，應採取相應降溫措施。對超聲波敏感和核酸應慎用。
4、反復凍融法：將細胞在-20度以下冰凍，室溫融解，反復幾次，由於細胞內冰粒形成和剩餘細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結構破碎。
5、化學處理法：有些動物細胞，例如腫瘤細胞可採用十二烷基磺酸鈉（SDS）、去氧膽酸鈉等細胞膜破壞，細菌細胞壁較厚，可採用溶菌酶處理效果更好。

無論用哪一種方法破碎組織細胞，都會使細胞內蛋白質或核酸水解酶釋放到溶液中，使大分子生物降解，導致天然物質量的減少，加入二異丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或減慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺醯氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酥活力，但不是全部，還可通過選擇pH、溫度或離子強度等，使這些條件都要適合於目的物質的提取。
濃縮、乾燥及保存
一、樣品的濃縮
生物大分子在制備過程中由於過柱純化而樣品變得很稀，為了保存和鑒定的目的，往往需要進行濃縮。常用的濃縮方法的：
1、減壓加溫蒸發濃縮
通過降低液面壓力使液體沸點降低，減壓的真空度愈高，液體沸點降得愈低，蒸發愈快，此法適用於一些不耐熱的生物大分子的濃縮。
2、空氣流動蒸發濃縮
空氣的流動可使液體加速蒸發,鋪成薄層的溶液，表面不斷通過空氣流；或將生物大分子溶液裝入透析袋內置於冷室，用電扇對准吹風，使透過膜外的溶劑不沁蒸發，而達到濃縮目的，此法濃縮速度慢，不適於大量溶液的濃縮。
3、冰凍法
生物大分子在低溫結成冰，鹽類及生物大分子不進入冰內而留在液相中，操作時先將待濃縮的溶液冷卻使之變成固體，然後緩慢地融解，利用溶劑與溶質融點介點的差別而達到除去大部分溶劑的目的。如蛋白質和酶的鹽溶液用此法濃縮時，不含蛋白質和酶的純冰結晶浮於液面，蛋白質和酶則集中於下層溶液中，移去上層冰塊，可得蛋白質和酶的濃縮液。
4、吸收法
通過吸收劑直接收除去溶液中溶液分子使之濃縮。所用的吸收劑必需與溶液不起化學反應，對生物大分子不吸附，易與溶液分開。常用的吸收劑有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝膠等，使用聚乙二醇吸收劑時，先將生物大分子溶液裝入半透膜的袋裡，外加聚乙二醇復蓋置於4度下，袋內溶劑滲出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水飽和後要更換新的直至達到所需要的體積。
5、超濾法
超濾法是使用一種特別的薄膜對溶液中各種溶質分子進行選擇性過濾的方法，不液體在一定壓力下（氮氣壓或真空泵壓）通過膜時，溶劑和小分子透過，大分子受阻保留，這是近年來發展起來的新方法，最適於生物大分子尤其是蛋白質和酶的濃縮或脫鹽，並具有成本低，操作方便，條件溫和，能較好地保持生物大分子的活性，回收率高等優點。應用超濾法關鍵在於膜的選擇，不同類型和規格的膜，水的流速，分子量截止值（即大體上能被膜保留分子最小分子量值）等參數均不同，必須根據工作需要來選用。另外，超濾裝置形式，溶質成份及性質、溶液濃度等都對超濾效果的一定影響。Diaflo
超濾膜的分子量截留值：
膜名稱分子量截留值孔的大的平均直徑
XM－300300，000140
XM－200100，00055
XM－5050，00030
PM－30 30，00022
UM－2020，00018
PM－1010，00015
UM－21，00012
UM05500 10

用上面的超濾膜製成空心的纖維管，將很多根這樣的管攏成一束，管的兩端與低離子強度的緩沖液相連，使緩沖液不斷地在管中流動。然後將纖維管浸入待透析的蛋白質溶液中。當緩沖液流過纖維管時，則小分子很易透過膜而擴散，大分子則不能。這就是纖維過濾秀析法，由於透析面積增大，因而使透析時間縮短10倍。

❷ 生物大分子分離方法和理論依據

一般的有:
層析
電泳
離子交換器

❸ 生物大分子制備主要步驟是什麼

生物大分子的制備通常可按以下步驟進行：
①確定要制備的生物大分子的目的和要求，是進行科研、開發還是要發現新的物質。
②建立相應的可靠的分析測定方法。主要有兩類：即生物學和物理、化學的測定方法。生物學的測定法主要有酶的各種測活方法、蛋白質含量的各種測定法、免疫化 學方法、放射性同位素示蹤法等；物理、化學方法主要有比色法、氣相色譜和液相色譜法、光譜法、電泳法、以及核磁共振等。
③通過文獻調研和預備性實驗，掌握生物大分子目的產物的物理化學性質。
④生物材料的破碎和預處理。
⑤分離純化方案的選擇和探索，這是最困難的過程。制備生物大分子的分離純化方法多種多樣，如鹽析、有機溶劑沉澱、層析和結晶、電泳、離心、超濾等。目前純 化蛋白質等生物大分子的關鍵技術是電泳、層析和高速與超速離心。在實際工作中往往要綜合運用多種方法，才能制備出高純度的生物大分子。
⑥生物大分子制備物的均一性（即純度）的鑒定。蛋白質和酶製成品純度的鑒定最常用的方法是：SDS－聚丙烯醯胺凝膠電泳和等電聚焦電泳，如能再用高效液相 色譜（HPLC）和毛細管電泳（CE）進行聯合鑒定則更為理想，必要時再做N－末端氨基酸殘基的分析鑒定。核酸的純度鑒定通常採用瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯 醯胺凝膠電泳，但最方便的還是紫外吸收法，即測定樣品在pH 7.0時260nm與280nm的吸光度（A260和A280），從A260/A280的比值即可判斷核酸樣品的純度。
⑦產物的濃縮，乾燥和保存。

❹ 常有的蛋白濃縮方法有哪些

蛋白濃縮方法基本有： 丙酮沉澱法；免疫沉澱法；三氯醋酸沉澱法；硫酸銨沉澱法；（低溫）有機溶劑沉澱法；聚乙二醇沉澱法；超濾法；透析法；離子交換層析和冷凍乾燥法…… 1.丙酮沉澱法；三氯醋酸沉澱法 試驗要求的儀器簡單，但是常常導致蛋白質變性。 2.免疫沉澱法：得有特異性抗體！ 3.硫酸銨沉澱法：利用高濃度鹽將蛋白質析出（鹽析），選擇硫酸按是因為：鹽析有效性，pH范圍廣，溶解度高，溶液散熱少，經濟！ 4.（低溫）有機溶劑沉澱法：強調低溫（0-4度以下）是因為10度時蛋白會在有機溶劑中變性，可用乙醇，丙酮……注意：Mg2+離子，pH值 5.聚乙二醇沉澱法：使用PEG時旨在個別情況下才會是蛋白質稍有變性！他溶解是散熱低，形成沉澱的平衡時間短，通常達到30%時蛋白質就會達到最大量的沉澱！ 6.超濾法：主要針對小體積蛋白質溶液（幾ml）此法更不易引起變性！不過得有濃縮器，不是哪個實驗室都有的！ 7.透析法：主要用於更換蛋白質的緩沖液！的有透析袋！不需要特殊的儀器！ 8.離子交換層析：可用陰離子交換樹脂進行濃縮！ 9.冷凍乾燥法：在冷凍狀態下讓揚品種的液體升華 參考網址on http://www.bio1000.com/experiment/biochemical/351804.html

❺ PEG聚乙二醇濃縮的原理

蛋白質濃縮

濃縮

生物大分子在制備過程中由於過柱純化而樣品變得很稀，為了保存和鑒定的目的，往往需要進行濃縮。常用的濃縮方法的：

減壓加溫蒸發濃縮
通過降低液面壓力使液體沸點降低，減壓的真空度愈高，液體沸點降得愈低，蒸發愈快，此法適用於一些不耐熱的生物大分子的濃縮。
空氣流動蒸發濃縮 空氣的流動可使液體加速蒸發,鋪成薄層的溶液，表面不斷通過空氣流；或將生物大分子溶液裝入透析袋內置於冷室，用電扇對准吹風，使透過膜外的溶劑不沁蒸發，而達到濃縮目的，此法濃縮速度慢，不適於大量溶液的濃縮。
冰凍法 生物大分子在低溫結成冰，鹽類及生物大分子不進入冰內而留在液相中，操作時先將待濃縮的溶液冷卻使之變成固體，然後緩慢地融解，利用溶劑與溶質融點介點的差別而達到除去大部分溶劑的目的。如蛋白質和酶的鹽溶液用此法濃縮時，不含蛋白質和酶的純冰結晶浮於液面，蛋白質和酶則集中於下層溶液中，移去上層冰塊，可得蛋白質和酶的濃縮液。
吸收法 通過吸收劑直接收除去溶液中溶液分子使之濃縮。所用的吸收劑必需與溶液不起化學反應，對生物大分子不吸附，易與溶液分開。常用的吸收劑有聚乙二醇，聚乙稀吡咯酮、蔗糖和凝膠等，使用聚乙二醇吸收劑時，先將生物大分子溶液裝入半透膜的袋裡，外加聚乙二醇復蓋置於4度下，袋內溶劑滲出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被水飽和後要更換新的直至達到所需要的體積。
超濾法 超濾法是使用一種特別的薄膜對溶液中各種溶質分子進行選擇性過濾的方法，不液體在一定壓力下（氮氣壓或真空泵壓）通過膜時，溶劑和小分子透過，大分子受阻保留，這是近年來發展起來的新方法，最適於生物大分子尤其是蛋白質和酶的濃縮或脫鹽，並具有成本低，操作方便，條件溫和，能較好地保持生物大分子的活性，回收率高等優點。應用超濾法關鍵在於膜的選擇，不同類型和規格的膜，水的流速，分子量截止值（即大體上能被膜保留分子最小分子量值）等參數均不同，必須根據工作需要來選用。另外，超濾裝置形式，溶質成份及性質、溶液濃度等都對超濾效果的一定影響。Diaflo 超濾膜的分子量截留值
膜名稱
分子量截留值
孔的大的平均直徑

XM －300
300，000
140

XM－200
100，000
55

XM－50
50，000
30

PM－30
30，000
22

UM－20
20，000
18

PM－10
10，000
15

UM－2
1，000
12

UM05
500
10

用上面的超濾膜製成空心的纖維管，將很多根這樣的管攏成一束，管的兩端與低離子強度的緩沖液相連，使緩沖液不斷地在管中流動。然後將纖維管浸入待透析的蛋白質溶液中。當緩沖液流過纖維管時，則小分子很易透過膜而擴散，大分子則不能。這就是纖維過濾秀析法，由於透析面積增大，因而使透析時間縮短10倍。

❻ 抗原濃縮的名詞解釋是什麼 急急急

抗原的濃縮
濃縮是低濃度溶液通過除去溶劑(包括水)變為高濃度溶液的過程，在制備生物大分子及各種生化產品時，常在提取後和結晶前進行濃縮，有時也貫穿在整個制備過程中。沉澱(包括鹽析和有機溶劑沉澱)，廣義上來說也是一種濃縮方法，經過沉澱再溶解，濃度可大大提高，但有時提取液很稀，體積又很大或結晶前除去少量溶劑，則常用其他方法濃縮。
1．蒸發法液體在任何溫度下都在蒸發，蒸發是溶液表面的溶劑分子獲得動能脫離液面逸向空間的過程。當溶液受熱，液體中溶劑分子動能增加，蒸發過程加快。蒸發的快慢和溫度、蒸發面積、液體表面積、液面蒸汽分子密度，即蒸汽壓大小有關。各種液體在一定溫度下都具有一定飽和蒸氣壓，當液面上的溶劑蒸氣分子密度很小，經常處於不飽和的低壓狀態，液相與氣相的溶劑分子為了維持其分子密度的動態平衡狀態，溶液中的溶劑分子就必須不斷地氣化逸出空間，以維持其一定的飽和蒸氣壓力。因此，根據上述原理，蒸氣濃縮裝置常按照加熱、擴大液體表面積、低壓和加速空氣流動等因素而設計的。
2．冰凍法冰凍法也是生物大分子及其他有機化合物濃縮的一種有效方法。生物大分子在冰凍時，水分結成凍，鹽類及生物大分子不進入冰內而留在液相中。操作時先將待濃縮的溶液冷卻使之變成固體，然後緩慢地融解，利用溶劑與溶質融解點的差別而達到除去大部分溶劑的目的。如蛋白質和酶的鹽溶液，用此法濃縮時，不含蛋白質和酶的純冰結晶浮於液面，蛋白質和酶則集中於下層溶液中，移去上層冰塊，可得蛋白質和酶的濃縮液。
吸收法 是一種通過吸收劑直接吸收溶液中的溶劑分子使溶液濃縮的方法。使用的吸收劑必須與溶液不起化學反應，對生物大分子不起吸附作用，易與溶液分開，吸收劑除去溶劑後能重復使用。實驗室中最常用的吸收劑有聚乙二醇、聚乙烯吡咯酮、蔗糖和凝膠等。使用凝膠時，首先選擇凝膠粒度大小恰好溶劑及低分子物質能滲入凝膠內，而生物大分子卻完全排除於凝膠之外的，然後將洗凈和乾燥的凝膠直接投入待濃縮的稀溶液中，凝膠親水性強，在水中溶脹時，溶劑及小分子被吸收到凝膠內，生物大分子留下剩餘的溶液中，離心或過濾除去凝膠顆粒，即得已濃縮的生物大分子溶液。凝膠溶脹時吸收水分及小分子物質可同時起到濃縮及分離純化兩種作用，對生物大分子結構和生物活性都沒有影響。是近年來生物化學及分子生物學日益廣泛使用的濃縮和分離方法之一。
使用聚乙二醇等其他吸收劑時，需先將生物大分子溶液裝入半透膜的袋裡，扎緊袋口，外加聚乙二醇復蓋，袋內溶劑滲出即被聚乙二醇迅速吸去，聚乙二醇被溶劑飽和後，可更換新的，直到濃縮至所需的濃度為止。用完一次以後的聚乙二醇經過加熱除去溶劑便可再次使用。
4．超濾法超濾法是使用一種特製的薄膜對溶液中各種溶質分子進行選擇性過濾的方法。當溶液在一定壓力下(外源氮氣壓或真空泵壓)通過膜時，溶液和小分子透過，大分子受阻保留於原來溶液中，其原理如圖2—2所示。這一近年發展起來的新方法是適於生物大分子尤其是蛋白質和酶的濃縮或脫鹽，並具有成本低、操作方便、條件溫和、能較好地保持生物大分子生理活性、回收率高等優點。除去濃縮、脫鹽外，並可應用生物大分子的分離純化，是目前民展較快且為人們所採用的生化技術之一。
圖2-2超濾法示意圖
通過超濾法，蛋白質和酶的稀溶液一般可濃縮到10%～15%濃度，回收率高達90%。超濾法應用關鍵在於膜選擇。不同類型的規格的膜、水的流速(在規定壓力下以ml/cm2/h或分表示)、分子量截止值(即大體上能被膜保留分子最小分子量數值)等參數均不同，必須根據工作的需要來選用。此外，超濾裝置形式、溶質成分及性質、溶液濃度及粘度都對超濾的效果有一定影響。
製品濃縮到一定程度，即可貯存，如有必要可採用低溫乾燥(冰干)的方法除去製品中溶劑，使之成乾粉。
製品的貯存可分干態貯存和液狀貯存。但不論是何種方法貯存，都要避免長期暴露在空氣中，防止微生物的污染。溫度對生物活性物質的活性影響很大，在絕大多數情況下應採取低溫保存。
干態儲藏：乾燥的製品一般比較穩定，如製品含水量很低，在低溫情況下，生物大分子活性可在數個月甚至數年沒有顯著變化。儲藏方法也很簡單，只將乾燥後的樣品置於乾燥器內(內裝有乾燥劑)密封，保持0～4℃冰箱中即可。有時為了取樣方便和避免取樣時樣品吸水和污染，可先將樣品分裝成許多小瓶中，每次用時，只取一小瓶。
液態儲藏：液態儲藏的優點是使樣品減去乾燥這一步驟，生物大分子的生理活性和結構破壞較少，缺點是需要較嚴格的防腐措施，儲藏時間不能太長。如樣品量大時封裝運輸不方便，實驗室常採取少量安瓿封存方法。液態儲藏注意事項如下：
樣品不能太稀，必須濃縮至一定濃度後才能封裝儲藏，樣品太稀時容易引起生物大分子變性作用。
一般需加入防腐劑和穩定劑，常用防腐劑有甲苯、苯甲酸、氯仿等。蛋白質和酶常用的穩定劑有蔗糖、甘油等，如酶也加入底物和輔酶以提高其穩定性，此外鈣、鋅、硼酸等鹽溶液對某些酶也具有一定保護作用。核酸大分子一般保存在氯化鈉或檸檬酸與氯化鈉的標准緩沖液中。

❼ 常用的濃縮方法有哪些如何選擇合理的濃縮途徑

常用的濃縮方法就是加熱蒸發法，使水分蒸發，使溶液濃縮。

利用透析袋濃縮蛋白質溶液是應用最廣的一種。將要濃縮的蛋白質溶液放入透析袋扎緊，把高分子[分子量(MW)：6 000～12 000]聚合物如聚乙二醇或蔗糖等撒在透析袋外即可。但在使用聚乙二醇時在個別情況下會使蛋白質稍有變性。

透析袋濃縮法：

而優點是形成的平衡時間較短，通常到達30%時蛋白質就會達到最大量的沉澱。另外也可將吸水劑配成30%～40%濃度的溶液，將裝有蛋白液的透析袋放入即可。操作時應在4℃環境中，以免蛋白質變性。吸水劑用過後，可放入烘箱中烘乾反復使用。

❽ 濃縮DNA方法有哪些(至少三種)

鄙視樓上的答非所問！
三種方法：
1，沉澱後復溶；
2，吸附後洗滌；
3，凍干

❾ 研究生物大分子的基本方法有哪些

生物大分子的基本制備技術有：鹽析，透析，超濾和濃縮冷凍乾燥

❿ 細胞生物學11

蛋白質、酶和核酸這三大類物質都是生物大分子，它們都具有十分重要的生理功能。酶是生物催化劑，核酸是遺傳信息的攜帶者，蛋白質是生命現象的基礎。因此對生物大分子的結構與功能的研究，具有十分重要的理論和實踐意義。而這研究的首要條件是制備高純度的生物大分子，否則對其結構與功能的研究就無從談起。

2．制備方法的分類：

依理化性質，分離、純化生物大分子的方法可分四個類型：

(1)按分子大小和形態：採用高速離心、過濾、分子篩、透析等方法。

(2)按溶解度：採用鹽析、溶劑抽提、分配層析、逆流分配、結晶等方法。

(3)按電荷差異：採用電泳、電滲析、等電點沉澱、離子交換層析、吸附層析等方法。

(4)按生物功能專一性：採用親和層析法。

3．制備的總體思路：

一般可分為六個階段：

(1)材料選擇與預處理：動物、植物和微生物都是制備生物大分子的材料，選什麼材料主要依靠實驗的目的而定，選材料時應注意以下幾個問題：

①使用的目的：從科學實驗的特殊需要出發，選材時需求能符合實驗預定目標即可。

②材料的生理狀態差異：選材時要注意植物的季節性，微生物的生長期和動物的生理狀

態。如：微生物生長的對數期，酶與核酸的含量較高。

材料選定後，通常要進行預處理，如動物組織要剔除結締組織，脂肪組織等非活性部位，植物種子先行去殼、除脂、微生物需將菌體和發酵液分離開，暫時不用材料尚需冰凍保存。

（2）細胞的破碎及細胞器的分離

①細胞的破碎：除了提取液和細胞外某些多肽激素、蛋白質和酶不需破碎細胞膜，對於細胞內和多細咆生物組織中各種生物大分子的分離提純都需要事先將細胞和組織破碎，使生物大分子充分釋放到溶液中，不同生物體，或同一生物體的不同組織，其細胞破碎難易不一致，因此使用方法也不完全相同，通常兩種方法共同使用。

A． 高速組織搗碎機

玻璃勻漿器

研磨

機械切力的作用

物理方法：

反復凍融法

冷熱交替法

超聲波處理法

加壓破碎法

物理因素的作用

B．化學及生物化學法

自溶法

溶菌酶處理法

表面活性劑處理法

改變細胞膜透性法

但是，不管採用哪種方法，都需要在一定稀鹽溶液或緩沖溶液中進行，且需加某些保護劑，以防止生物大分子的變性及降解。

②細胞器的分離：制備某種生物大分子時，往往需要採用細胞中某一部分為材料；或者為了純化某一特定細胞器上的生物大分子，通常破碎細胞後，先分離各組分，以防干擾，這對制備—些高難度和高純度的生物大分子是必要的，細胞器的分離，一般採用差速離心法，此法是利用細胞各組分質量大小不同，在離心管不同區域沉降的原理，分離出所需組分，分離得到的細胞器，其純度可採用電子顯微鏡法、免疫學法或測定標志酶活力法進行鑒定。

(3)提取：

提取又稱抽提或萃取，其作用是將經過處理或破碎了的細胞置於一定的條件和溶劑中，讓被提取的生物大分子充分地釋放出來，提取效果如何，取決於該物質在溶劑中溶解度的大小和該物質的分子結構及使用溶劑的理化性質。原則地說，極性物質易溶於極性溶劑，非極性物質易溶於非極性有機溶劑；鹼性物質易溶於酸性溶劑，酸性物質易溶於鹼性溶劑中；溫度高時，一般溶解度相應增大，在遠離生物大分子等電點的pH值時溶解度增加，從細胞中提取生物大分子也受擴散作用的影響和分配定律的支配。由於影響因素較多，在實際制備時應根據經驗並結合具體實驗條件靈活地加以應用。

(4)分離純化

從細胞中提取出來的生物大分子是不夠純凈的，常含許多同類的或異類的物質，必需進一步分離純化才能獲得純品。生物大分子制備工作中，分離純化這一步既重要又復雜，主要方法可歸納為兩類：

①對異類物質的分離：常採用專一性酶水解，有機溶劑抽提，選擇性分部沉澱和液固相轉化透析分離等方法。

②對同類物質的分離：常採用鹽析、有機溶劑沉澱、等電點沉澱、結晶、電泳、超離心、柱層析和吸附等方法。

(5)濃縮與結晶

①濃縮是指低濃度溶液通過除去溶劑(包括水)變為高濃度溶液的過程，常在提取後結晶

前進行，有時也貫穿在整個制備過程中。濃縮的方法常採用：

A．蒸發法：薄膜蒸發濃縮，減壓加溫蒸發濃縮，空氣流過蒸發濃縮。

B．冰凍法。

C．吸收法。

D．超濾法。

②結晶是指使溶質呈晶態從溶液中析出的過程。結晶除作為生化制備一種純化手段外，其結晶化合物還常常是生物大分子結構的分析研究的材料，常用以下幾種方法進行結晶。

A，鹽析法：加固體鹽法、加飽和鹽溶液法、透析法。

B．有機溶劑法。

C．等電點法。

D．脫鹽結晶法。

E．加金屬離子結晶法。

(6)乾燥與保存：

乾燥是指將潮濕的固體、半固體或濃縮液中的水分(或溶劑)蒸發除去的過程，最常用的方法是真空乾燥和冷凍乾燥。

保存是指樣品如何存放的問題，保存方法與生物大分子的穩定性密切相關，常採用干態貯藏和液態貯藏的方法。干態貯藏法就是將乾燥後的樣品置於乾燥器內(內裝有乾燥劑)密封，保持0—4℃冰箱中即可；液態儲藏法，首先免去煩雜的乾燥過程，生物大分子的活性和結構破壞較少，但應注意樣品不能太稀，必須濃縮到一定濃度才能封裝儲藏，必需加入防腐劑和穩定劑。常用的防腐劑有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。蛋白質和酶常用的穩定劑有硫酸銨糊、蔗糖、甘油等。另外要求儲藏溫度較低，大多數在0℃左右冰箱保存，有的則要求更低的溫度。但不管採用哪種方法，都必須避免長期暴露在空氣中，以防微生物的污染。

(二)鑒定

經過一系列的分離純化，所得到的物質是不是我們所需要的，樣品的純度如何，都需要進行進一步的鑒定，包括純度鑒定、性質與功能鑒定，結構鑒定等，鑒定的方法也很多，具體實驗中可根據研究的需要選擇某些方法。

1．純度鑒定

(1)電泳法：純的蛋白質、核酸樣品在它穩定的范圍內，在一系列不同的PH條件下進行電泳時，都以單一的泳動速度移動，因此在區帶電泳中，它的電泳圖譜只有一個條帶，蛋白質一般採用聚丙烯醯胺凝膠電泳、醋纖薄膜電泳等，核酸樣品一般採用瓊脂糖電泳。

(2)沉降分析法：純的蛋白質、核酸樣品在離心力的影響下，以單一的沉降速度運動，離心後只能得到一個條帶。

(3)恆溶度法：純的蛋白質在一定的溶劑系統中具有恆定的溶解度，而不依賴於存在於溶液中未溶解固體的數量。在嚴格規定的條件下，以加入的固體蛋白質的量為橫座標，以溶解的蛋白質的量為縱座標作圖，如果蛋白質樣品是純的，那麼溶解度曲線只呈現一個折點，在折點之前，直線的斜率為l，在折點以後，斜率為零，不純的蛋白質的溶解度曲線常常呈現兩個或兩個以上的折點。

2．性質與功能鑒定

(1)分子量測定：蛋白質、核酸樣品都可以通過適當的實驗方法，測定出樣品的分子量。蛋白質可以採用滲透壓法、沉降分析法、通透層析法、SDS-PAGE電泳法等，核酸樣品可採用瓊脂糖電泳法、聚丙烯醯胺凝膠電泳法等。

(2)蛋白質等電點測定：可通過等電聚焦電泳法。

(3)功能鑒定：具有酶或激素性質的樣品可以利用它們的酶活性或激素活性來測定含量，

而不具有酶或激素活性的蛋白質，可以先用來免疫適當動物，一般會產生抗體，利用抗原—抗體反應，也可以測定某一特定蛋白質的含量，這些生物學方法的測定和總蛋白質測定配合起來，可以用來研究蛋白質分離過程中某一特定蛋白質的提純程度，提純程度常用這一特定成分與總蛋白之比來表示，提純工作一直要進行到這個比例不再增加為止。

3．結構鑒定

(1)末端測定：可採用DNS—氨基酸或DNP—氨基酸聚醯胺薄膜層析法測定。

(2)組成分析：把樣品完全水解後進行氨基酸或核苷酸的組成分析，並計算出各種氨基酸或核苷酸的分子比。

(3)「指紋」分析：將制備的樣品與標准樣品在相同條件下用蛋白酶或核酸內切酶進行部分水解，再進行電泳，通過電泳圖譜的比較，可以判斷所分離到的樣品是否是所需要的成分。

(4)序列測定。

(5)探針技術：把電泳分離的組分從凝膠轉移至一種固相支持體，然後用已放射性標記或酶標記的針對特定氨基酸序列或核苷酸序列的特異性試劑作為探針檢測之。探針技術特異性強，靈敏度高，而且樣品無需經過復雜的分離純化即可進行鑒定，因此在分子生物學中得到了廣泛的應用。目前主要有三種技術：

①Southern blotting：1975年由Southern提出的轉移技術，通常用來對DNA特定序列進行定位、鑒定。先將DNA樣品通過瓊脂糖凝膠電泳按大小分離，隨後使DNA在原位發生變性，並從凝膠轉移至一固相支持體(通常是硝酸纖維膜或尼龍膜)上。DNA轉移至固相支持體的過程中，各個DNA片段的相對位置保持不變，用放射性標記的DNA或RNA片段作為探針與固著在固相支持體上的DNA進行雜交，經放射自顯影後可以確定與探針互補的DNA片段的電泳條帶的位置。

②Northern blotting：1977年由Alwine等提出的轉移技術，可用於測定總RNA或poly

(A)+RNA樣品中特定mRNA分子的大小和豐度。 RNA分子在變性瓊脂糖凝膠中按其大小不同而相互分離，隨後將RNA轉移至活化纖維素、硝酸纖維膜、玻璃或尼龍膜，用放射性標記的與待測RNA分子互補的DNA或RNA探針進行雜交和放射自顯影，以對待測的RNA分子進行作圖。

③Western blotting：1979年由Towbin等人提出的蛋白質轉移技術，用於對非放射性標

記蛋白組成的復雜混合物中的某些特定蛋白質進行鑒別和定量。通常使用的探針是抗體，它可與附著於固相支持體的靶蛋白所呈現的抗原表位發生特異性反應，先將待測樣品溶於含有去污劑和還原劑的溶液中，經過SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳後被轉移到固相支持體上(常用硝酸纖維濾膜)然後可被染色，隨後濾膜可與抗靶蛋白的非標記抗體反應，最後結合上的抗體可用多種放射性標記或酶偶聯的二級免疫學試劑進行檢測。