提取質粒方法有哪些

1. 質粒dna提取實驗中的實驗方法有哪些

質粒小，復性容易， 而染色體DNA大 ，不易復性；這導致兩種DNA提取採用完全不同的策略。質粒dna提取，為了區分於DNA，都採用首先從混合物中分離出來，然後逐步純化；而染色體DNA提取的策略則為逐步去除其他雜質，最後剩下的就是DNA了。質粒DNA提取方法有幾種，最常見的鹼裂解法利用鹼變形（加溶液II）後用醋酸溶液快速復性（溶液III），這樣使得質粒DNA可以復性而溶解，而GenomeDNA不能復性而沉澱，從而將他們分開。而後面的純化如除蛋白（酚 、氯仿），除鹽（75%酒精），沉澱（酒精、異丙醇等）兩者類似。當然兩者都有很粗略的簡易提法，那就完全大相徑庭啦。

2. 質粒的提取

本文主要以OMEGA試劑盒（產品編號#D6950）為例，講述下提質粒（去內毒素）的注意事項。

DNA在化學性質上是懶惰的，但是在物理結構上是易碎的。因為在化學上其潛在的反應基團隱藏在中央螺旋部位，並經氫鍵緊密連接，同時鹼基外側受磷酸鍵和戊糖形成的強大環層的保護，這種保護因內在的鹼基堆積力而進一步加強；在物理上，其長而彎曲，側面不穩定，更容易受到柔和剪切力的破壞。雙鏈DNA在溶液中隨機捲曲，並由於鹼基之間的堆積作用和DNA骨架上磷酸基團之間的靜電排斥力而變得粘稠，所以在移液、震盪或攪拌引起的液流中，在粘滯的盤繞物上產生的拖拉力，很容易切斷雙鏈DNA。DNA越長，破壞其所需的力越小，大於150kb的DNA分子在常規分離基因組DNA過程中易於斷裂。

一般DNA分離提純可以簡單分為三步：
裂解宿主細胞。如，
離子去污劑，如SDS
從細胞中釋放DNA，去除與DNA結合的蛋白質並快速使胞內核酸酶失活。如，
酶水解蛋白和RNA
層析液中吸收、釋放DNA
利用乙醇或者異丙醇沉澱DNA去除鹽離子。

菌液在高PH條件下，加入強離子去污劑（如，SDS）能夠破壞細胞壁，是蛋白質與染色體DNA變形，並將質粒DNA釋放到上清液中。但是在實驗中關鍵是動作要快，因為長時間暴露在變形條件下會對閉環DNA造成不可逆性。這種變性的折疊捲曲DNA不容易被限制性內切酶切割，它的瓊脂糖電泳速率是線形、超螺旋和環狀等天然結構DNA電泳速率的2倍，並且不容易被嵌入染料染色。鹼裂法在制備治理過程中常會產生不同數量折疊形式的DNA。上述這種方法適用於15kby以下的質粒，大於15kb的質粒在提取過程中很容易斷裂，可用等滲蔗糖溶液裂解細菌，並用溶菌酶和EDTA（乙二胺四乙酸）去除細胞壁，可解決受損。產生的原生質球可通過加入去污劑（如SDS）被裂解。

試劑盒一般採用DNA選擇性吸附穩定固相（通常是二氧化硅或者硅酸鹽）的特性進行DNA純化。在高PH、高鹽緩沖液中，DNA會吸附到二氧化硅介質上面，在低鹽濃度下可被洗脫下來。玻璃表面的陽性粒子隨後可以在DNA骨架中磷酸負電基團和硅醇負電基團（Si-OH）之間形成鹽橋，結合強度與成橋離子類型有關。一旦DNA與介質結合，他就會與其他的生物多聚物（如RNA和糖）分開。得率由DNA大小決定，片段越小，與二氧化硅結合越緊密，得率越低。

實驗開始前，最主要的是細菌培養。試劑說明書建議使用DH5α，DH1，C600，都可以，XL1-Blue雖然長
的很慢但是也可以使用。其次培養基的使用建議採用LB培養基，其他的均不建議。

開始細菌培養前，最好塗板調菌培養，這樣可以保持菌的活性，甘油保存的菌可能會產量低或者質粒丟失。
當挑取單菌落後放入37℃，300rpm，培養12~16h。

為了獲得最佳質粒產率，起始培養體積應基於培養細菌密度。 建議使用OD600的2.0和3.0之間的細菌提取質粒。 使用富含營養素的介質時，應注意確保細菌密度不超過3.0的OD600，最後菌液OD600為0.4。 在推薦的OD范圍之外使用高密度培養可能會超過純化體系。

注意：
曝氣是很重要的，LB培養基的體積應該是容器的1/4
隨著培養時間的加長，由於細菌的死亡和裂解，DNA的產量開始下降。

3. 質粒的分離操作

從細菌中分離質粒 DNA 的具體操作 一、材料
含PBS的E.coliDH5α或JM系列菌株，1.5ml塑料離心管（又稱eppendorf管），離心管架。
二、設備
微量取液器（20μl，200μl，1000μl），台式高速離心機，恆溫振盪搖床，高壓蒸汽消毒器（滅菌鍋），渦旋振盪器，電泳儀，瓊脂糖平板電泳裝置和恆溫水浴鍋等。
三、試劑
1、LB液體培養基（Luria-Bertani）：稱取蛋白腖（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeastextract）5g，NaCl10g，溶於800ml去離子水中，用NaOH調pH至7.5，加去離子水至總體積1升，高壓下蒸氣滅菌20分鍾。
2、LB固體培養基：液體培養基中每升加12g瓊脂粉，高壓滅菌。
3、氨苄青黴素（Ampicillin，Amp）母液：配成50mg/ml水溶液，-20℃保存備用。
4、溶菌酶溶液：用10mmol/LTris·Cl（pH8.0）溶液配製成10mg/ml，並分裝成小份（如1.5ml）保存於-20℃，每一小份一經使用後便予丟棄。
5、3mol/lNaAc（pH5.2）：50ml水中溶解40.81gNaAc·3H2O，用冰醋酸調pH至5.2，加水定容至100ml，分裝後高壓滅菌，儲存於4℃冰箱。
6、溶液1:50mmol/L葡萄糖，25mmol/ L T r i s. Cl（pH8.0），10mmol/LEDTA（pH8.0）。溶液Ⅰ可成批配製，每瓶100ml，高壓滅菌15分鍾，儲存於4℃冰箱。
7、溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH（臨用前用10mol/LNaOH母液稀釋），1%SDS。
8、溶液Ⅲ：5mol/LKAc60ml，冰醋酸11.5ml，H2O28.5ml，定容至100ml，並高壓滅菌。溶液終濃度為：K+3mol/L，Acˉ5mol/L。
9、RNA酶A母液：將RNA酶A溶於10mmol/LTris·Cl（pH7.5），15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml
的溶液，於100℃加熱15分鍾，使混有的DNA酶失活。冷卻後用1.5mleppendorf管分裝成小份保存於-20℃。
10、飽和酚：市售酚中含有醌等氧化物，這些產物可引起磷酸二酯鍵的斷裂及導致RNA和DNA的交聯，應在160℃用冷凝管進行重蒸。重蒸酚加入0.1%的8-羥基喹啉（作為抗氧化劑），並用等體積的0.5mol/LTris·Cl（pH8.0）和0.1mol/LTris·Cl（pH8.0）緩沖液反復抽提使之飽和並使其pH值達到7.6以上，因為酸性條件下DNA會分配於有機相。
11、氯仿：按氯仿：異戊醇=24：1體積比加入異戊醇。氯仿可使蛋白變性並有助於液相與有機相的分開，異戊醇則可起消除抽提過程中出現的泡沫。按體積/體積=1：1混合上述飽和酚與氯仿即
得酚/氯仿（1:1）。酚和氯仿均有很強的腐蝕性，操作時應戴手套。
12、TE緩沖液：10mmo/LTris·Cl（pH8.0），1mmol/LEDTA（pH8.0）。高壓滅菌後儲存於4℃冰箱中。
13、STET：0.1mol/LNaCl，10mmol/LTris·Cl（pH8.0），10mmol/LEDTA（pH8.0），5%TritonX-100。
14、STE：0.1mol/LNaCl，10mmol/LTris·Cl（pH8.0），1mmol/LEDTA（pH8.0）。
15、電泳所用試劑：⑴TBE緩沖液（5×）：稱取Tris54g，硼酸27.5g，並加入0.5MEDTA（pH8.0）20ml，定溶至1000ml。⑵上樣緩沖液（6×）：0.25%溴酚藍，40%（w/v）蔗糖水溶液。 一、細菌的培養和收集
將含有質粒pBS的DH5α菌種接種在LB固體培養基（含50μg/mlAmp）中，37℃培養12-24小時。用無菌牙簽挑取單菌落接種到5mlLB液體培養基（含50μg/mlAmp）中，37℃振盪培養約12小時至對數生長後期。
二、質粒DNA少量快速提取
質粒DNA小量提取法對於從大量轉化子中制備少量部分純化的質粒DNA十分有用。這些方法共同特點是簡便、快速，能同時處理大量試樣，所得DNA有一定純度，可滿足限制酶切割、電泳分析的需要。
（一）、煮沸法
1、將1.5ml培養液倒入eppendorf管中，4℃下12000轉離心30秒。
2、棄上清，將管倒置於衛生紙上幾分鍾，使液體流盡。
3、將菌體沉澱懸浮於120mlSTET溶液中，渦旋混勻。
4、加入10ml新配製的溶菌酶溶液（10mg/ml），渦旋振盪3秒鍾。
5、將eppendorf管放入沸水浴中，50秒後立即取出。
6、用微量離心機4℃下12000g離心10分鍾。
7、用無菌牙簽從eppendorf管中去除細菌碎片。
8、取20ml進行電泳檢查。
[注意]1.對大腸桿菌可從固體培養基上挑取單個菌落直接進行煮沸法提取質粒DNA。2.煮沸法中添加溶菌酶有一定限度，濃度高時，細菌裂解效果反而不好。有時不同溶菌酶也能溶菌。3.提取的質粒DNA中會含有RNA，但RNA並不幹擾進一步實驗，如限制性內切酶消化，亞克隆及連接反應等。
（二）、鹼法
1、取1.5ml培養液倒入1.5mleppendorf管中，4℃下12000g離心30秒。
2、棄上清，將管倒置於衛生紙上數分鍾，使液體流盡。
3、菌體沉澱重懸浮於100μl溶液Ⅰ中（需劇烈振盪），室溫下放置5-10分鍾。
4、加入新配製的溶液Ⅱ200μl，蓋緊管口，快速溫和顛倒eppendorf管數次，以混勻內容物（千萬不要振盪），冰浴5分鍾。
5、加入150μl預冷的溶液Ⅲ，蓋緊管口，並倒置離心管，溫和振盪10秒，使沉澱混勻，冰浴中5-10分鍾，4℃下12000g離心5-10分鍾。
6、上清液移入干凈eppendorf管中，加入等體積的酚/氯仿（1:1），振盪混勻，4℃下12000g離心5分鍾。
7、將水相移入干凈eppendorf管中，加入2倍體積的無水乙醇，振盪混勻後置於-20℃冰箱中20分鍾，然後4℃下12000g離心10分鍾。
8、棄上清，將管口敞開倒置於衛生紙上使所有液體流出，加入1ml70%乙醇洗沉澱一次，4℃下12000g離心5-10分鍾。
9、吸除上清液，將管倒置於衛生紙上使液體流盡，真空乾燥10分鍾或室溫乾燥。
10、將沉澱溶於20μlTE緩沖液（pH8.0，含20μg/mlRNaseA）中，儲於-20℃冰箱中。
[注意]1.提取過程應盡量保持低溫。2.提取質粒DNA過程中除去蛋白很重要，採用酚/氯仿去除蛋白效果較單獨用酚或氯仿好，要將蛋白盡量除干凈需多次抽提。3.沉澱DNA通常使用冰乙醇，在低溫條件下放置時間稍長可使DNA沉澱完全。沉澱DNA也可用異丙醇（一般使用等體積），且沉澱完全，速度快，但常把鹽沉澱下來，所以多數還是用乙醇。
（三）、Wizard少量DNA純化系統
Promega公司的Wizard少量DNA純化系統可快速有效的抽提質粒DNA，整個過程只需15分鍾。提取的質粒可直接用於DNA測序、酶切分析和體外轉錄等。該系統中所含試劑和柱子可以用於50次1-3ml質粒培養液的分離和純化，試劑包括10ml細胞懸浮液，10ml細胞裂解液；10ml中和液，50mlWizard少量DNA純化樹脂，50ml柱洗液（使用前加95%乙醇至120ml）和50支Wizard微型柱。
1、1-3ml過夜培養細胞液4℃下12000g離心1-2分鍾。
2、去除上清液，菌體細胞懸浮於200μl細胞懸浮液中，充分混合，並移入eppendorf管中。
3、加200μl細胞裂解液，顛倒離心管數次，直到溶液變清亮。
4、加200μl中和液，顛倒離心管數次。
5、4℃下12000g離心5分鍾，取上清液於新的eppendorf管中。
6、加1mlWizard少量DNA純化樹脂，顛倒離心管數次以充分混勻。
7、取一次性注射器，取出注塞，並使注射筒與Wizard微型柱連接，用移液槍將上述混合液加入注射筒中，並用注塞輕推，使混合物進入微型柱。
8、將注射器與微型柱分開，取出注塞，再將注射筒與微型柱相連，加入2ml柱洗液，並用注塞輕推，使柱洗液進入微型柱。
9、取出微型柱置於eppendorf管中，離心2分鍾以除去微型柱中的柱洗液。
10、將微型柱放在一個新eppendorf管中，加50μlTE（或水）於微型柱中，靜止1分鍾後，4℃下12000g離心20秒。
11、丟棄微型柱，將eppendorf管中的質粒DNA貯於4℃或-20℃冰箱。
[注意]樹脂使用前應充分混勻，如有結晶，可將樹脂用25-37℃水浴處理10分鍾。
三、質粒DNA的大量提取和純化
在製作酶譜、測定序列、制備探針等實驗中需要高純度、高濃度的質粒DNA，為此需要大量提取質粒DNA。大量提取的質粒DNA一般需進一步純化，常用柱層析法和氯化絕梯度離心法。
（一）、鹼法
1、取培養至對數生長後期的含pBS質粒的細菌培養液250ml，4℃下5000g離心15分鍾，棄上清，將離心管倒置使上清液全部流盡。
2、將細菌沉澱重新懸浮於50ml用冰預冷的STE中（此步可省略）。
3、同步驟1方法離心以收集細菌細胞。
4、將細菌沉澱物重新懸浮於5ml溶液I中，充分懸浮菌體細胞。
5、加入12ml新配製的溶液Ⅱ，蓋緊瓶蓋，緩緩地顛倒離心管數次，以充分混勻內容物，冰浴10分鍾。6、加9ml用冰預冷的溶液Ⅲ，搖動離心管數次以混勻內容物，冰上放置15分鍾，此時應形成白色絮狀沉澱。
7、4℃下5000g離心15分鍾。
8、取上清液，加入50mlRNA酶A（10mg/ml），37℃水浴20分鍾。
9、加入等體積的飽和酚/氯仿，振盪混勻，4℃下12000g離心10分鍾。
10、取上層水相，加入等體積氯仿，振盪混勻，4℃下12000g離心10分鍾。
11、取上層水相，加入1/5體積的4mol/LNaCl和10%PEG（分子量6000），冰上放置60分鍾。
12、4℃下12000g離心15分鍾，沉澱用數ml70%冰冷乙醇洗滌，4℃下12000g離心5分鍾。
13、真空抽干沉澱，溶於500mlTE或水中。
[注意]1.提取過程中應盡量保持低溫。2.加入溶液Ⅱ和溶液Ⅲ後操作應混和，切忌劇烈振盪。3.由於RNA酶A中常存在有DNA酶，利用RNA酶耐熱的特性，使用時應先對該酶液進行熱處理（80℃1小時），使DNA酶失活。
（二）、Wazard大量DNA純化系統
鹼法大量提取DNA往往需要很長的時間.Promega公司的Wiazrd大量DNA純化系統既簡單又快速，只需要離心和真空抽干，這個系統可以從500ml培養液中在3小時以內獲得1mg以上的高質量的質粒DNA（200-20000bp）。該系統不需要酚和氯仿抽提，純化後的DNA溶於水或TE緩沖液中，不含任何鹽份，可以直接用於DNA序列分析和酶切反應，也可以用於在核酸酶抑制劑（如RNasin）存在的條件下進行體外轉錄反應等。該系統中含有的試劑和柱子可以用於10次100-500ml質粒培養液的分離和純化，試劑包括：150ml細胞懸浮液，150ml細胞裂解液，150ml中和液，100mlWizard大量DNA純化樹脂，125mlWizard柱子洗脫溶液和10支Wizard帶有存儲離心管的柱子。
1、100-500ml細胞培養液置離心管中，22-25℃下5000g離心10分鍾，所得細胞沉澱充分懸浮於細胞懸浮液中。
2、加15ml細胞裂解溶液並輕輕混合，可以反復倒置混合，但不能用渦旋振盪，細胞裂解完全時，溶液會變清，這一步需要20分鍾。
3、加15ml中和溶液，立即反復倒置離心管數次，並使之混勻。
4、14000g，22-25℃離心15分鍾。
5、小心地將上清液吸出並移至一個新離心管中。
6、加0.5倍體積的異丙醇，混合均勻，14000g22-25℃下離心15分鍾。
7、棄上清，懸浮DNA沉澱於2mlTE緩沖液中。這一步中也許有的沉澱不能溶解。
8、加10mlWizard大量DNA純化樹脂溶液，並渦旋混合。
9、每一個樣品，使用一支Wizard大量柱子，柱子的頭插在真空器上（Promega產品，與此配套）。
10、將樹脂/DNA混合液轉入柱子中，真空抽取樹脂/DNA混合液。
11、將樹脂/DNA混合液抽干後，加13ml柱子洗脫溶液至離心管中，對管底部的樹脂/DNA進行洗脫（柱子一邊旋轉一邊加入洗脫液），並加入柱子中。
12、真空抽干所加入的洗脫。
13、再加12ml柱子洗脫液進柱子並抽干。
14、加入5ml80%乙醇漂洗柱中的樹脂，柱子真空抽干後將柱子放入用戶提供的離心管
中，2500rpm（1300g）離心5分鍾。
15、取出柱子，真空抽干5分鍾，再將柱子放入系統中所提供的離心管中，2500rpm（1300g）離心5分鍾。
16、在柱子中加入1.5ml65-70℃預熱過的滅菌重蒸水或TE，1分鍾後2500rpm（1300g）離心柱子/離心管5分鍾。
17、取出柱子，離心管中溶液即為提取的質粒DNA，可以直接放在離心管中，蓋上蓋子，儲存在4℃或-20℃備用。
[注意]1.在使用之前，系統所提供的柱子洗脫液按1：1加入125ml95%乙醇。2.純化樹脂必須混勻後再用.
（三）、Sephrose2B柱純化質粒DNA
鹼法提取的質粒DNA即使用RNA酶處理，仍會含有少量RNA。當有些試驗需無RNA污染的DNA製品時，則需進行進一步純化。一般常用Sepharose2B或Sepharose4B進行純化，該方法具有快速，條件溫和，重復性好，載體物質可以再利用等優點，因而已廣泛用於質粒DNA純化。
1、將Sepharose2B經含0.1%SDS的TE（pH8.0）平衡後上柱。
2、將至多1ml的DNA溶液鋪在Sepharase2B柱上。
3、待DNA溶液完全進入柱內後立即在柱的上部連接含有0.1%SDS的TE（pH8.0）貯液瓶。
4、以1ml流出液為1份進行收集。
5、對每一管測定其OD260值，以確定哪些管中含有質粒DNA。通常質粒DNA在柱上流出的第一個峰中。
6、合並所有含質粒的洗脫液，用等體積的酚/氯仿（1:1）抽提，4℃下12000g離心2分鍾，將上層水相轉入新管。
7、加入2倍體積的冰冷無水乙醇，-20℃下沉澱10分鍾，然後4℃下12000g離心10分鍾，棄去上清液。
8、沉澱加70%乙醇洗滌，4℃下12000g離心10分鍾，棄去上清液。
9、沉澱真空抽干，重新溶於TE或無菌水中。
[注意]在裝柱過程中，要防止柱床中出現斷裂或氣泡現象，要使界面保持平整。對新裝成的柱，應用含0.1%SDS的TE平衡，以使柱內的凝膠均勻。

4. 質粒的提取原理

質粒提取是指去除 RNA，將質粒與細菌基因組 DNA分開，去除蛋白質及其它雜質，以得到相對純凈的質粒。

目錄

一、質粒提取原理

質粒是細胞內的一種環狀的小分子DNA，是進行DNA重組的常用載體。作為一個具有自身復制起點的復制單位獨立於細胞的主染色體之外，質粒DNA上攜帶了部分的基因信息，經過基因表達後使其宿主細胞表現相應的性狀。在DNA重組中，質粒或經過改造後的質粒載體可通過連接外源基因構成重組體。

從宿主細胞中提取質粒DNA，是DNA重組技術中最基礎的實驗技能。分離質粒DNA有三個步驟：培養細菌使質粒擴增，收集和裂解細菌，分離和純化質粒DNA。

在質粒提取過程中，由於機械力、酸鹼度、試劑等的原因，可能使質粒DNA鏈發生斷裂。所以，多數質粒粗提取物中含有三種構型的質粒：共價閉合環狀DNA（cccDNA）： 質粒的兩條鏈沒有斷裂；超螺旋開環DNA（ocDNA）： 質粒的一條鏈斷裂；鬆弛的環狀分子線形DNA（lDNA）： 質粒的兩條鏈均斷裂；線性分子質粒DNA的分子構型 。

質粒DNA瓊脂塘凝膠電泳模式圖可分為：鬆弛線性的DNA； 鬆弛開環的OC構型； 超螺旋的SC構型。由於瓊脂糖中加有嵌入型染料溴化乙錠，因此，在紫外線照射下DNA電泳帶成橘黃色。 道中的SC DNA走在最前沿，OC DNA則位於凝膠的最後邊；道中的L DNA 是經核酸內切限制酶切割質粒之後產生的，它在凝膠中的位置介於OC DNA 和 SC DNA 之間。

二、質粒提取方法

質粒DNA的提取方法主要有鹼裂解法、煮沸法、酚氯仿裂解法。跟據不同的實驗目的和儀器設備擇取不同的實驗方案。

(一) 鹼裂解法：

此方法適用於小量質粒DNA的提取，提取的質粒DNA可直接用於酶切、PCR擴增、銀染序列分析。方法如下：

1. 接1%含質粒的大腸桿菌細胞於2ml LB培養基。

2. 37℃振盪培養過夜。

3. 取1.5ml菌體於Ep管，以4000rpm離心3min，棄上清液。

4. 加0.lml溶液I(1％葡萄糖，50mM/L EDTA pH8.0，25mM/L Tris-HCl pH8.0)充分混合。

5. 加入0.2ml溶液 II(0.2 mM/L NaOH，1％ SDS)，輕輕翻轉混勻，置於冰浴5 min 。

6. 加入0.15m1預冷溶液III(5 mol/L KAc，pH4.8)，輕輕翻轉混勻，置於冰浴5 min 。

7. 以10，000rpm離心20min，取上清液於另一新Ep管

8. 加入等體積的異戊醇，混勻後於0℃靜置10min。

9. 再以10，000rpm離心20min，棄上清。

10. 用70％乙醇0.5ml洗滌一次，抽干所有液體。

11. 待沉澱乾燥後，溶於0.05mlTE緩沖液中

(二) 煮沸法：

1. 將1.5ml培養液倒入eppendorf管中，4℃下12000g離心30秒。

2. 棄上清，將管倒置於衛生紙上幾分鍾，使液體流盡。

3. 將菌體沉澱懸浮於120ml STET溶液中，渦旋混勻。

4. 加入10ml新配製的溶菌酶溶液(10mg/ml)， 渦旋振盪3秒鍾。

5. 將eppendorf管放入沸水浴中，50秒後立即取出。

6. 用微量離心機4℃下12000g離心10分鍾。

7. 用無菌牙簽從eppendorf管中去除細菌碎片。

8. 取20ml進行電泳檢查。

(三) 酚氯仿裂解法：

1. 從瓊脂平板上挑取轉化菌陽性克隆，接種到標准LB培養液中（含有卡那黴素30 μg/mL）搖菌12 h；收集1.5 mL菌液，8000 g/min離心3 min，棄上清，沉澱加入200 μL TE，充分混勻；加入400 μL酚氯仿（1∶1體積）混合液，劇烈振動10 s，混勻；12 000 g/min離心5 min，1 mL胰島素注射針收集上清，盡量避免吸入蛋白沉澱層；上清經國產0。22 μm針式濾器過濾1次；向過濾上清液內加入2倍體積無水乙醇，振盪10 s，12 000 g/min離心5 min；沉澱溶於20 μL的RTE溶液中，37℃水浴。

2. 按PstI內切酶說明書進行酶切反應（37℃，1 h）。 酶切產物10 μL，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳。

3. PCR引物根據參考文獻〔1〕設計，預計擴增產物片斷大小為714 bp。

4. 常規制備感受態菌E。coli DH5a，提取質粒DNA常規轉化感受態，塗於含有卡那黴素（30 μ/mL）LB培養平板中，37℃培養，15 h後觀察篩選克隆情況。

三、質粒提取常見問題

(一) 溶液I—溶菌液：

溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌體細胞壁的主要化學成分肽聚糖中的β-1,4糖苷鍵，因而具有溶菌的作用。當溶液中pH小於8時，溶菌酶作用受到抑制。

葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機械剪切力作用而降解。

EDTA：1. 螯合Mg2＋、Ca2＋等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對DNA的降解作用（DNase作用時需要一定的金屬離子作輔基）;2. EDTA的存在，有利於溶菌酶的作用，因為溶菌酶的反應要求有較低的離子強度的環境。

(二) 溶液II－NaOH－SDS液：

NaOH：核酸在pH大於5，小於9的溶液中，是穩定的。但當pH＞12或pH＜3時，就會引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。在溶液II中的NaOH濃度為0.2mo1／L，加抽提液時，該系統的pH就高達12.6，因而促使染色體DNA與質粒DNA的變性。

SDS：SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有：1. 溶解細胞膜上的脂質與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜。2. 解聚細胞中的核蛋白。3. SDS能與蛋白質結合成為R-O-SO3-…R＋-蛋白質的復合物，使蛋白質變性而沉澱下來。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以後的提取過程中，必須把它去除干凈，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA時）受到干擾。

(三) 溶液III--3mol／L NaAc（pH4.8）溶液：

NaAc的水溶液呈鹼性，為了調節pH至4.8，必須加入大量的冰醋酸。所以該溶液實際上是NaAc-HAc的緩沖液。用pH4.8的NaAc溶液是為了把pH12.6的抽提液，調回pH至中性，使變性的質粒DNA能夠復性，並能穩定存在。而高鹽的3mol／L NaAc有利於變性的大分子染色體DNA、RNA以及SDS-蛋白復合物凝聚而沉澱之。前者是因為中和核酸上的電荷，減少相斥力而互相聚合，後者是因為鈉鹽與SDS－蛋白復合物作用後，能形成較小的鈉鹽形式復合物，使沉澱更完全。

(四) 為什麼用無水乙醇沉澱DNA？

用無水乙醇沉澱DNA，這是實驗中最常用的沉澱DNA的方法。乙醇的優點是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會起任何化學反應，對DNA很安全，因此是理想的沉澱劑。

DNA溶液是DNA以水合狀態穩定存在，當加入乙醇時，乙醇會奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易於聚合。一般實驗中，是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合，其乙醇的最終含量佔67％左右。因而也可改用95％乙醇來替代無水乙醇（因為無水乙醇的價格遠遠比95％乙醇昂貴）。但是加95％的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大，尤其用多次乙醇沉澱時，就會影響收得率。折中的做法是初次沉澱DNA時可用95％乙醇代替無水乙酵，最後的沉澱步驟要使用無水乙醇。也可以用0.6倍體積的異丙醇選擇性沉澱DNA。一般在室溫下放置15－30分鍾即可。

(五) 在用乙醇沉澱DNA時，為什麼一定要加NaAc或NaCl至最終濃度達0.1～0.25mol/L？

在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的負電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易於互相聚合而形成DNA鈉鹽沉澱，當加入的鹽溶液濃度太低時，只有部分DNA形成DNA鈉鹽而聚合，這樣就造成DNA沉澱不完全，當加入的鹽溶液濃度太高時，其效果也不好。在沉澱的DNA中，由於過多的鹽雜質存在，影響DNA的酶切等反應，必須要進行洗滌或重沉澱。

(六) 加核糖核酸酶降解核糖核酸後，為什麼再要用SDS與KAc來處理？

加進去的RNase本身是一種蛋白質，為了純化DNA，又必須去除之，加SDS可使它們成為SDS-蛋白復合物沉澱，再加KAc使這些復合物轉變為溶解度更小的鉀鹽形式的SDS-蛋白質復合物，使沉澱更加完全。也可用飽和酚、氯仿抽提再沉澱，去除RNase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到較好效果。

(七) 為什麼在保存或抽提DNA過程中，一般採用TE緩沖液？

在基因操作實驗中，選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩定性及緩沖液成分不產生干擾作用。磷酸鹽緩沖系統（pKa＝7.2）和硼酸系統（pKa=9.24）等雖然也都符合細胞內環境的生理范圍(pH)，可作DNA的保存液，但在轉化實驗時，磷酸根離子的種類及數量將與Ca2＋產生Ca3(PO4)2沉澱；在DNA反應時，不同的酶對輔助因子的種類及數量要求不同，有的要求高離子濃度，有的則要求低鹽濃度，採用Tris-HCl（pKa=8.0）的緩沖系統，由於緩沖液是TrisH+/Tris，不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存DNA時，大都採用Tris-HCl系統，而TE緩沖液中的EDTA更能穩定DNA的活性。

(八) 如何選擇聚乙二醇（6000）的濃度來沉澱DNA？

採用PEG（6000）沉澱DNA，大小不同的DNA分子所用的PEG的濃度也不同，PEG的濃度低，選擇性沉澱DNA分子量大，大分子所需PEG的濃度只需1％左右，小分子所需PEG濃度高達20％。本實驗選擇性沉澱4.3kb的pBR322質粒DNA，每毫升加入0.4毫升的30％ PEG，其最終PEG濃度為12％。PEG選擇性沉澱DNA的解析度大約100bp。

(九) 抽提DNA去除蛋白質時，怎樣使用酚與氯仿較好？

酞與氯仿是非極性分子，水是極性分子，當蛋白水溶液與酚或氯仿混合時，蛋白質分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去，使蛋白失去水合狀態而變性。經過離心，變性蛋白質的密度比水的密度為大，因而與水相分離，沉澱在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開。而酚與氯仿有機溶劑比重更大，保留在最下層。

作為表面變性的酚與氯仿，在去除蛋白質的作用中，各有利弊，酚的變性作用大，但酚與水相有一定程度的互溶，大約10％～15％的水溶解在酚相中，因而損失了這部分水相中的DNA，而氯仿的變性作用不如酚效果好，但氯仿與水不相混溶，不會帶走DNA。所以在抽提過程中，混合使用酚與氯仿效果最好。經酚第一次抽提後的水相中有殘留的酚，由於酚與氯仿是互溶的，可用氯仿第二次變性蛋白質，此時一起將酚帶走。也可以在第二次抽提時，將酚與氯仿混合（1:1）使用。

(十) 為什麼用酚與氯仿抽提DNA時，還要加少量的異戊酵？

在抽提DNA時，為了混合均勻，必須劇烈振盪容器數次，這時在混合液內易產生氣泡，氣泡會阻止相互間的充分作用。加入異戊醇能降低分子表面張力，所以能減少抽提過程中的泡沫產生。一般採用氯仿與異戊酵為24：1之比。也可採用酚、氯仿與異戊醇之比為25：24:1（不必先配製，可在臨用前把一份酚加一份24：1的氯仿與異戊醇即成），同時異戊醇有助於分相，使離心後的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機溶劑相維持穩定。

(十一) 為什麼要用pH8的Tris水溶液飽和酚？呈粉紅色的酚可否使用？如何保存酚不被空氣氧化？

因為酚與水有一定的互溶，苯酚用水飽和的目的是使其抽提DNA過程中，不致吸收樣品中含有DNA的水分，減少DNA的損失。用Tris調節至pH為8是因為DNA在此條件下比較穩定。在中性或鹼性條件下（pH5～7），RNA比DNA更容易游離到水相，所以可獲得RNA含量較少的DNA樣品。

保存在冰箱中的酚，容易被空氣氧化而變成粉紅色的，這樣的酚容易降解DNA，一般不可以便用。為了防止酚的氧化，可加入疏基乙醇和8-羥基喹琳至終濃度為0.1％。8-羥基喹琳是帶有淡黃色的固體粉末，不僅能抗氧化，並在一定程度上能抑制DNase的活性，它是金屬離子的弱螯合劑。用Tris pH8.0水溶液飽和後的酚，最好分裝在棕色小試劑瓶里，上面蓋一層Tris水溶液或TE緩沖液，隔絕空氣，以裝滿蓋緊蓋子為宜，如有可能，可充氮氣，防止與空氣接觸而被氧化。平時保存在4℃或－20℃冰箱中，使用時，打開蓋子吸取後迅速加蓋，這樣可使酚不變質，可用數月。

(十二) 未提出質粒或質粒得率較低？

1. 大腸桿菌老化

請塗布平板培養後，重新挑選新菌落進行液體培養。

2. 質粒拷貝數低

由於低使用低拷貝數載體引起的質粒DNA提取量低，可更換具有相同功能的高拷

貝數載體。

3. 菌體中無質粒

有些質粒本身不能在某些菌種中穩定存在，經多次轉接後有可能造成質粒丟失。

例如，柯斯質粒在大腸桿菌中長期保存不穩定，因此不要頻繁轉接，每次接種時

應接種單菌落。另外，檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。

4. 鹼裂解不充分

使用過多菌體培養液，會導致菌體裂解不充分，可減少菌體用量或增加溶液P1、

P2和P3的用量。對低拷貝數質粒，提取時，可加倍使用溶液P1、P2和P3，可能

有助於增加質粒提取量和質粒質量。

5. 溶液使用不當

溶液P2、P3在溫度較低時可能出現渾濁，應置於37℃保溫片刻直至溶解為清亮的

溶液，才能使用。

6. 吸附柱過載

不同產品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質粒量很大，請分多次提取。若

用富集培養基，例如TB 或2×YT，菌液體積必須減少；若質粒或宿主菌是非常高

的拷貝數或生長率，則需調整LB培養液體積。

7. 質粒未全部溶解（尤其質粒較大時）

洗脫溶解質粒時，可適當加溫或延長溶解時間。

8. 乙醇殘留

漂洗液洗滌後應離心盡量去除殘留液體，樹脂型試劑盒漂洗後應晾乾樹脂，再加

入洗脫緩沖液。

9. 洗脫液加入位置不正確

洗脫液應加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會完全覆蓋硅膠膜的表面達到最大洗脫

效率。

10. 洗脫液不合適

DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫，如洗脫緩沖液EB (10 mM Tris?Cl, pH 8.5)

或水。洗脫效率取決於pH值。最大洗脫效率在pH7.0-8.5間。當用水洗脫時確保

其pH值在此范圍內，如果pH過低可能導致洗脫量低。洗脫時將滅菌蒸餾水或洗脫

緩沖液加熱至60℃後使用有利於提高洗脫效率。

11. 洗脫體積太小

洗脫體積對回收率有一定影響。隨著洗脫體積的增大回收率增高，但產品濃度降

低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。

12. 洗脫時間過短

洗脫時間對回收率也會有一定影響。洗脫時放置一分鍾可達到較好的效果。

(十三) 質粒純度不高？

1. 混有蛋白

不要使用過多菌體。溶液P1、P2、P3處理並離心後溶液應為澄清的，如果還混有

微小蛋白懸浮物，可再次離心去除後再進行下一步驟。

2. 混有RNA

RNase A處理不徹底，請減少菌體用量或加入溶液P3之後室溫放置一段時間。如

果溶液P1已保存6個月以上，請在溶液P1中添加RNase A。

3. 混有基因組DNA

加入溶液P2和P3後應溫和混勻，如果劇烈振盪，可能把基因組DNA剪切成碎片從

而混雜在質粒中。如果加入溶液P2後過於粘稠，無法溫和混勻，請減少菌體用

量。細菌培養時間過長會導致細胞和DNA的降解，不要超過16 小時。

4. P3溶液加入時間過長

P3溶液加入後，放置時間不要太長，否則有可能會產生小片段DNA污染。

5. 含大量核酸酶的宿主菌

宿主菌含大量核酸酶，在質粒提取過程中降解質粒DNA，影響提取質粒DNA的完

整性，最好選用不含核酸酶的大腸桿菌宿主菌，如DH5α和Top10。

6. 裂解時間過長

加入溶液P2後裂解時間不應超過5分鍾。

7. 質粒的二聚體和多聚體形式

質粒復制過程中形成的，與宿主菌相關，電泳可檢測出。

5. 質粒DNA的提取方法總共有哪些，回答的全給高分

(一)鹼裂解法提取質粒
[實驗原理]
鹼裂解法提取質粒是根據共價閉合環狀質粒DNA與線性染色體DNA在拓撲學上的差異來分離它們。在pH值介於12.0~12.5這個狹窄的范圍內,線性的DNA雙螺旋結構解開而被變性,盡管在這樣的條件下,共價閉環質粒DNA的氫鍵會被斷裂,但兩條互補鏈彼此相互盤繞,仍會緊密地結合在一起。當加入pH4.8的乙酸鉀高鹽緩沖液恢復Ph至中性時，共價閉合環狀質粒DNA的兩條互補鏈仍保持在一起，因此復性迅速而准確，在而線性的染色體DNA的兩條互補鏈彼此已完全分開，復性就不會那麼迅速而准確，它們纏繞形成網狀結構，通過離心，染色體DNA與不穩定的大分子RNA、蛋白質-SDS復合物等一起沉澱下來而被除去。
[實驗儀器與設備]
1.恆溫培養箱 2.恆溫搖床
3.台式離心機(最大轉速4000rpm) 4.冷凍高速離心機
5.高壓滅菌鍋 6.超凈工作台
7.微量移液器 8.eppendorf tupe、tip
[實驗材料]
1.葡萄糖 2.三羥甲基氨基甲烷(Tris)
3.乙二胺四乙酸(EDTA) 4.氫氧化鈉
5.十二烷基硫酸鈉(SDS) 6.乙酸鉀
7.冰乙酸 8.氯仿
9.乙醇 10.胰RNA酶
11.氨苄青黴素 12.蔗糖
13.溴酚藍 14.酚
15.β巰基乙醇 16.鹽酸
17.含pUC18質粒的大腸桿菌
附：試劑的配製
1.溶液Ⅰ
50mmol/L 葡萄糖
5mmol/L 三羥甲基氨基甲烷(Tris) Tris·HCl (pH8.0)
10mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)
2.溶液Ⅱ
0.4 mol/L NaOH, 2%SDS, 用前等體積混合
3.溶液Ⅲ
5mmol/L 乙酸鉀 60 ml
冰乙酸 11.5 ml
水 28.5 ml
4.TE緩沖液
10mmol/L Tris·HCl
1 mmol/L EDTA(pH8.0)
5.70%乙醇(放-20℃冰箱中,用後即放回)
6.胰RNA酶
將RNA酶溶於10mmol/L Tris·HCl(pH7.5)、15mmol/L NaCl中，配成10mg/ml的濃度，於100℃加熱15min,緩慢冷卻至室溫，保存於-20℃。
7.終止液:40%蔗糖、0.25%溴藍酚
8.酚
[實驗步驟]
(一) 提取質粒
1.將2ml含相應抗生素的LB液體培養基加入到試管中，接入含質粒的大腸桿菌，37℃振盪培養過夜。
2.取1.5ml培養物倒入微量離心管中，4000rpm，離心2min。
3.吸去培養液，使細胞沉澱盡可能乾燥。
4.將細菌沉澱懸浮於100μl溶液Ⅰ中，充分混勻，室溫放置10 min。
5.加200μl溶液Ⅱ(新鮮配製)，混勻內容物，將離心管放冰上5 min。
6.加入150μl溶液Ⅲ(冰上預冷)，蓋緊管口，顛倒數次使混勻。
7.1200rpm，離心15 min，將上清轉至另一離心管中。
8.向上清中加入等體積酚：氯仿(去蛋白)，反復混勻，12000rpm，離心5min,將上清轉移到另一離心管中.
9.向上清加入2倍體積乙醇,混勻後,室溫放置5-10min。12000rpm離心5min。倒去上清液，把離心管倒扣在吸水紙上，吸干液體。
10.用1ml70%乙醇洗滌質粒DNA沉澱，振盪並離心，倒去上清液，真空抽干或空氣中乾燥。
11.加50μl TE緩沖液，其中含有20μg/ml的胰RNA酶，使DNA完全溶解，-20℃保存。
(二)瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA
[實驗原理]
瓊脂糖凝膠電泳是分離鑒定和純化DNA片段的常用方法。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應，DNA分子在高於等電點的pH溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。由於糖磷酸骨架在結構上的重復性質，相同數量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正極方向移動。不同濃度瓊脂糖凝膠可以分離從200bp至50kb的DNA片段。在瓊脂糖溶液中加入低濃度的溴化乙錠(ethim bromide ,EB)，在紫外光下可以檢出 10ng的DNA條帶，在電場中，pH8.0條件下，凝膠中帶負電荷的DNA向陽極遷移。
瓊脂糖凝膠有如下特點：
(1) DNA的分子大小 在凝膠基質中其遷移速率與鹼基對數目的常用對數值成反比，分子越大遷移得越慢。
(2) 瓊脂糖濃度 一個特定大小的線形DNA分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率(u)的對數與凝膠濃度(t)成線性關系。
(3) 電壓 低電壓時，線狀DNA片段遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場強度的增加，不同分子量DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長，隨著電壓的增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。要使大於2kb的DNA片段的解析度達到最大，所加電壓不得超過5v/cm。
(4) 電泳溫度 DNA在瓊脂糖凝膠電泳中的電泳行為受電泳時的溫度影響不明顯，不同大小的DNA片段其相對遷移速率在4℃與30℃之間不發生明顯改變，但濃度低於0.5%的凝膠或低熔點凝膠較為脆弱，最好在4℃條件下電泳。
(5) 嵌入染料 熒光染料溴化乙錠用於檢測瓊脂糖凝膠中的DNA，染料嵌入到堆積的鹼基對間並拉長線狀和帶缺口的環狀DNA,使其剛性更強,還會使線狀遷移率降低15%。
(6) 離子強度 電泳緩沖液的組成及其離子強度影響DNA電泳遷移率。在沒有離子存在時(如誤用蒸餾水配製凝膠，電導率最小，DNA幾乎不移動，在高離子強度的緩沖液中(如誤加10×電泳緩沖液)，則電導很高並明顯產熱，嚴重時會引起凝膠熔化。
對於天然的雙鏈，常用的幾種電泳緩沖液有TAE、TBE等，一般配製成濃縮母液，室溫保存，用時稀釋。
[實驗儀器與設備]
1. 恆溫培養箱 2. 瓊脂糖凝膠電泳系統
3. 高壓滅菌鍋 4. 紫外線透射儀
[實驗材料]
1.三羥甲基氨基甲烷(Tris) 2.硼酸
3.乙二胺四乙酸(EDTA) 4.溴酚藍
5.蔗糖 6.瓊脂糖
7.溴化乙錠 8.DNA marker
9.DNA樣品
[實驗步驟]
1.緩沖液的配製
① 5×TBE(5倍體積的TBE貯存液)
配1000ml 5×TBE:
Tris 54g
硼酸 27.5g
0.5mol/l EDTA 20ml
Ph8.0
② 凝膠加樣緩沖液(6×)
溴酚藍 0.25%
蔗糖 40%
③溴化乙錠溶液(EB) 0.5μg/ml
2.制備瓊脂糖凝膠
按照被分離DNA的大小,決定凝膠中瓊脂糖的百分含量。可參照下表：
瓊脂糖凝膠濃度 線性DNA的有效分離范圍
0.3% 5-60 kb
0.6% 1-20 kb
0.7% 0.8-10 kb
0.9% 0.5-7 kb
1.2% 0.4-6 kb
1.5% 0.2-4 kb
2.0% 0.1-3 kb
3.膠板的制備
(1) 用高壓滅菌指示紙帶將洗靜、乾燥的玻璃板的邊緣(或電泳裝置所皿備的塑料盤的開口)封住，形成一個膠膜(將膠膜放在工作台的水平位置上，用水平儀校正)。
(2) 配製足夠用於灌滿電泳槽和制備凝膠所需的電泳緩沖液(1×TBE)。准確稱量的瓊脂糖粉。緩沖液不宜超過錐瓶或玻璃瓶的50%容量。 在電泳槽和凝膠中務必使用同一批次的電泳緩沖液，離子強度或pH值的微小差異會在凝膠中形成前沿，從而大大影響DNA片段的遷移率 。
(3) 在錐瓶的瓶頸上鬆鬆地包上一層厚紙。如用玻璃瓶，瓶蓋須擰松。在沸水浴或微波爐中將懸浮加熱至瓊脂糖溶解。注意：瓊脂糖溶液若在微波爐里加熱過長時間，溶液將過熱並暴沸。應核對溶液的體積在煮沸過程中是否由於蒸發而減少，必要時用緩沖液補充。
(4) 使溶液冷卻至60℃。加入溴化乙錠(用水配製成10mg/ml的貯存液)到終濃度為0.5ug/ml，充分混勻。
(5) 用移液器吸取少量瓊脂糖溶液封固膠模邊緣，凝固後，在距離底板0.5-10mm的位置上放置梳子，以便加入瓊脂糖後可以形成完好的加樣孔。如果梳子距玻璃板太近，則拔出梳子時孔底將有破裂的危險，破裂後會使樣品從玻璃板之間滲透。
(6)將剩餘的溫熱瓊脂糖溶液倒入膠模中。凝膠的厚度在3-5mm之間。檢查一下梳子的齒下或齒間是否有氣泡。
(7)在凝膠完全凝固後(於室溫放置30-45分鍾) ，小心移去梳子和高壓滅菌紙帶，將凝膠放入電泳槽中。
低熔點瓊脂糖凝膠及濃度低於0.5%的瓊脂糖凝膠應冷卻至4℃，並在冷庫中電泳。
(8)加入恰好沒過膠面約1mm深的足量電泳緩沖液。
4.加樣
DNA樣品與所需加樣緩沖液混合後，用微量移液器，慢慢將混合物加至樣品槽中。此時凝膠已浸沒在緩沖液中。 一個加樣孔的最大加樣量依據DNA的數量及大小而定，一般為20-30μl樣品。
已知大小的DNA標准，應同時加在凝膠的左凝膠的左側和右側孔內。確定未知DNA的大小。測量未知DNA的大小時，要所有樣品都用相同的樣品緩沖液。
5.電泳
在低電壓條件下,線形DNA片段的遷移速度與電壓成比例關系,但是,在電場增加時,不同相對分子質量的DNA片段泳動度的增加是有差別的。因此，隨著電壓的增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍隨之減小。為了獲得電泳分離DNA片段的最大解析度，電場強度不應高於5V/cm。當溴酚藍指示劑移到到距離膠板下沿約1-2cm處，停止電泳。

6. 質粒抽提的抽提方法

質粒抽提最常用的方法是鹼裂解法，它具有得率高，適用面廣，快速，純度高等特點。關於鹼裂解法的原理，復旦大學生化與分子生物學實驗室的網站有一篇專論，大家可以去看一下。這是一篇美文，非常有趣。文中提到了一個與幾乎所有能查到的資料不同的觀點，也是非常有啟發的。
當然，鹼裂解法也有缺陷：容易導致不可逆的變性；不適合大質粒的抽提。鹼裂解法是很劇烈的方法，質粒在鹼性條件下會變性，時間一長，這種變性就成為不可逆的了 (電泳時在超螺旋前面一點點，如果有一條帶，就是此變性的質粒。)。所以，要降低不可逆的變性，就要控制好鹼裂解的時間。 (似乎可以做這么一個推理：在鹼性條件下，質粒的兩條鏈從一點或者幾個點開始分開，隨著時間的延長，直到完全分開。理論上講，完全分開的兩條鏈要很快地配對復性，成功率肯定不可能是 100%的，而沒有完全分開的兩條鏈卻完全可能 100% 配對復性。) 鹼裂解法不適合大質粒的抽提，原因也是因為該方法太劇烈，使超螺旋比例較低。文獻推薦的抽提大質粒的方法是溫和得多的方法，缺點是得率要低一些。現在得問題是，大質粒的拷貝數本來就低，如果抽提方法得率再不高的話，抽提起來就很費力了。如果注意到在鹼裂解法中，超螺旋比例隨著鹼裂解時間的延長而降低，隨著粘稠度的增加而減低這個現象，完全可以使用鹼裂解法來抽提大質粒的：增加試劑的使用量，使加入 NaOH/SDS 液後，溶液在 1 分鍾內就能變得很清澈；立即加入中和試劑。這個實驗我們沒有做過，但 QIAGEN 抽提大質粒用的就是鹼裂解法。