測定蛋白質等電點有哪些方法

❶ 現有一未知的水溶性蛋白質,如何確定其等電點請設計實驗

摘要 一、目的：

❷ 請問：怎樣知道某種植物蛋白質的等電點

科技名詞定義
中文名稱：等電點 英文名稱：isoelectric point 定義：蛋白質或兩性電解質(如氨基酸)所帶凈電荷為零時溶液的pH，此時蛋白質或兩性電解質在電場中的遷移率為零。符號為pI。 所屬學科： 生物化學與分子生物學(一級學科) ；氨基酸、多肽與蛋白質(二級學科)

等電點聚焦測蛋白質等電點

一、實驗原理

等電點聚集實質就是在穩定的pH梯度中按等電點的不同分離兩性大分子的平衡電泳方

法。在電場中充有兩性載體和抗對流介質，當加上電場後，由於兩性電解載體移動的結果，在兩極之間逐步建立起穩定的PH梯度，當蛋白質分子或其它兩性分子存在於這樣的PH梯度中時，這種分子便會由於其表面電荷在此電場中運動，並最終到達一個使其表面靜電荷為零的區帶，這時的PH則是這種蛋白質的PI。IEF技術的關鍵是得到一定范圍的穩定的PH梯度。也即找到合適的兩性載體。

二．實驗試劑

1．丙烯醯胺單體儲液

丙烯醯胺[Aa]30%[W/V]，甲叉雙丙烯醯胺[Bis]0.8%[W/V]

2．核黃素 0.025%[W/V]

3．Ampholien PH3.5-9 凝膠工作液 Aa：Bis 1ml

甘油 0.25ml

Ampholine PH 3.5-9 0.4ml

雙蒸水 3.25ml

搖勻，用水泵抽氣10分鍾，加入0.025%核黃素0.15ml，搖勻後用滴管灌入玻管中。

4．25%[W/V]蔗糖水溶液，用於配製蛋白樣品

5．10%蔗糖水溶液，用來鋪於樣品層上部。

6．電極液： 上槽 0.02M H3PO4 1000ml

下槽 0.01M NaOH 600ml

7．染色液： 0.01%考馬斯亮藍R-250

5%三氯乙酸

5%磺基水楊酸

三．實驗儀器與器具

玻璃管4×120mm 4支

封口膜

試管架

細長滴管

注射器及長針頭

玻片、刀片

10ml玻璃瓶

微量可調移液器

圓盤電泳槽及電泳儀

四．操作步驟

1．圓柱體凝膠制備，用封口膜將玻管（4×120mm）的一端封口，將玻管套上橡皮塞，加入凝膠混合液至10cm處，輕輕鋪上一層雙蒸水，置於日光燈下待其聚合。

2．聚焦電泳

（1）將電泳下槽注入0.01M NaOH、將套有橡膠塞的玻璃管插入電泳槽（注意塞緊所有的孔，以防電極液下露）。將上槽連同電泳管置於下槽上，此時凝膠下端與電極液接觸，注意排除凝膠下表面的氣泡。

（2）加樣100μl蛋白含量2-5μg。

（3）在樣品上輕輕一層10%的蔗糖，直至頂端，作為隔離層。

（4）上槽注入0.02M H3PO4，注意不要攪混樣品層和隔離層。

（5）接上電源，正極接酸，負極接鹼。恆定在120V，通電16-18小時至電流降至0為止。

3．蛋白質染色及等電點測定：

（1）取膠 將凝膠後的含樣品的凝膠藉助長注射器針頭注水取出。

（2）蛋白樣品的染色由於兩性載體Ampholine可與多種蛋白染色劑結合，並形成不溶性復合物，因此一般需要染色前除去Ampholine。本實驗直接將凝膠置於三氯乙酸中浸泡，立刻可見蛋白帶。

（3）PH梯度測定 取液，分別加入於10隻小玻璃瓶中，將欲測的PH梯度的膠條置於玻璃片上，用刀片切成長的小段，按順序放入有編號的小玻璃瓶中，蓋好橡皮塞，將凝膠段在室溫下浸泡過夜，次日用PH計測每支小瓶中浸泡液PH值。將得到的PH值對凝膠長度作圖，得標准曲線。

（4）樣品的PH值測定。測定出染色蛋白帶的位置，在PH梯度曲線上求出相對應PH值既是此樣品的PI。

五．實驗結果

測定十個小管中膠條的PH分別為7.14、7.86、7.50、6.96、6.38、5.74、5.10、4.49、4.13。以膠條距鹼端的距離為橫坐標，PH值為縱坐標作圖：

經過測量，待測蛋白距鹼端為7.3cm，浸泡後膠的總長度為10.5cm，等比例換算得距離應為6.95，帶入公式得待測蛋白的PI值為：4.64 查表得知與牛血清白蛋白的等電點接近。

六、討論

1、載體兩性電解質含量2％~3%比較適合，能形成好的梯度。

2、制膠用丙稀醯胺最好是重結晶的。過硫酸銨要新配的。所有的水都要用重蒸水。

3、樣品必須無鹽，否則電泳時樣品條帶可能走歪，拖尾或者根本不成條帶。加樣的量要適當，避免過多電泳後條帶不清晰。

4、由於鹼性漂移作用，膠條鹼端最初1cm的pH值過低，故作圖時捨去。

（5）本實驗結果中同時加入待測和以前提取兩種蛋白（未發現條帶,可能樣品含鹽量過大），待測蛋白在三氯乙酸中固定後即可看到明顯的白色條帶，故未用染色液染色即可測量遷移距離。

❸ 蛋白質等電點的測定方法

●方法：平板等電聚焦
●原理：蛋白質分子在含有載體兩性電介質形成的連續而穩定的線性pH梯度中進行電泳。但不自是按照等電點不同被分離。
●儀器：Bio-Rad Model 111Mini IEF Cell
●樣品要求：
●液體：濃度>3mg/ml；體積>200ul；固體：質量>200ug
●樣品純度>90%；含鹽量<3 0mM；分子量：一般要求大於1000Da
●常見影響測試情況:
1、蛋白質純度不足
2、含鹽量過高
3、蛋白質分子量太小，導致無法固定染色

❹ 測定蛋白質等電點的方法的原理是什麼

蛋白質是兩性電解質，蛋白質在鹼性溶液中成陰離子，在酸性溶液中成陽離子；蛋白質分子所帶凈電荷為零時的ph值稱為蛋白質的等電點（pi）。在等電點時，蛋白質分子在電場中不向任何一極移動，而且分子與分子間因碰撞而引起聚沉的傾向增加，所以這時可以使蛋白質溶液的粘度、滲透壓均減到最低，且溶液變混濁。若再加入一定量的溶劑如乙醇、丙酮，它們與蛋白質分子爭奪水分子，竭力減低蛋白質水化層的厚度而使混濁更加明顯。
各種蛋白質的等電點都不相同，但偏酸性的較多，如牛乳中的酪蛋白的等電點是4.7~4.8，血紅蛋白等電點為6.7~6.8，胰島素是5.3~5.4，魚精蛋白是一個典型的鹼性蛋白，其等電點在ph12.0~12.4。近年來蛋白質的等電點可以採用等電聚焦技術加以准確測定，但需一定的實驗條件。本實驗採用蛋白質在不同ph溶液中形成的混濁度來確定，即混濁度最大時的ph值即為該種蛋白質的等電點值，這個方法雖然不很准確，但在一般實驗條件下都能進行，操作也簡便。

❺ 蛋白質等電點的測算方法

等電點：如果調節溶液的PH值使得其中的氨基酸呈電中性，我們把這個PH值稱為氨基酸的等電點：PI。PI是氨基酸的重要常數之一，它的意義在於，物質在PI處的溶解度最小，是分離純化物質的重要手段。等電點的計算：對於所有的R基團不解離的氨基酸而言（即解離只發生在α-羧基和α-氨基上），計算起來非常簡單：PI＝（PK1』+PK2』）/2若是碰到R基團也解離的，氨基酸就有了多級解離，這個公式就不好用了，比如Lys、Glu、Cys等。aaCysAspGluLysHisArgPK』α-羧基1.712.692.192.181.822.19PK』α-氨基8.339.829.678.959.179.04PK』-R-基團10.78（-SH）3.86（β-COOH）4.25（γ-COOH）10.53（ε-NH2）6（咪唑基）12.48（胍基）在這種情況下可以按下面的步驟來計算：<1>由PK』值判斷解離順序，總是PK1』<PK2』<PK3』<…，即誰的PK』值小，誰就先解離。<2>按照解離順序正確寫出解離方程式：簡式，注意解離基團的正確寫法。<3>找出呈電中性的物質，其左右PK』值的平均值就是氨基酸的等電點：PI＝（PK左』+PK右』）/2以Lys為例：在黑板上用簡式演示<3>
等電點的測定：等電聚焦法：這是一種特殊的電泳，其載體上鋪有連續的PH梯度的緩沖液，然後將氨基酸點樣，只要該處的PH與氨基酸的PI不同，則氨基酸就會帶電，PH值>PI時，aa帶-電；PH值<PI時，aa帶+電。通電後，氨基酸就會移動，直到某處的PH＝PI，氨基酸才呈電中性，不再移動，因此，可以測出PI。
等電點沉澱
所有的氨基酸均為兩性物質，亦即它們至少含有一個酸性基（carboxyl）及一個鹼性基（α-amino）。這些可游離的團基在pH變化時，因釋出或接受質子而可充當弱酸或弱鹼，其離子化特性與其它物質一樣遵守Henderson-Hasselbalch方程式：
pH=pKa+log10[未質子化的形式（鹼）]/[已質子化的形式（酸）]
即
pH=pKa+log[A-]/[HA]
氨基酸可以三種形式存在，即正電荷（cation）、兩性離子（zwitterion）或雙極性離子（dipolarion）及負電荷（anion）等三種，若在酸性溶液中帶正電荷，則在鹼性溶液中帶負電荷。若氨基酸在某一pH值下其凈電荷為0，且在電場中不移動時，稱此pH值為它的pI值（等電點）。因為凈電荷為零，凈電斥力不存在的緣故，大部份蛋白質於等電點的pH值下，其溶解度最小。相反的，當溶液的pH值低於或高於pI，所有蛋白質分子所帶凈電荷必為同號，彼此之間有相斥力，不會凝結。所以，將pH調到等電點的大小，則大部份的蛋白質將會沉澱，這種現象可以應用於估算某蛋白質的等電點.

❻ 在蛋白質等電子測定過程中,如何根據實驗現象判斷酪蛋白的等電點

根據實驗現象判斷酪蛋白的等電點的方法：
1）最小溶解度法。蛋白質在不同pH溶液中形成不同的濁度來測定，即最大濁度處的pH值為蛋白質的等電點值。渾濁最嚴重時的pH值，即為酪蛋白的等電點。
2） 等電聚焦法。等電聚焦完成後，切成膠條，測量不同段的pH值，並用三氯醋酸顯色，即可確定酪蛋白的等電點。

❼ 解釋如何蛋白質等電點的測定

一、目的：
了解等電點的意義及其與蛋白質分子聚沉能力的關系。

二、原理：
蛋白質的分子量很大，它能形成穩定均一的溶液，主要是由於蛋白質分子都帶有相同符號的電荷，同時蛋白質分子周圍有一層溶劑化的水膜，避免蛋白質分子之間聚集而沉降。

蛋白質分子所帶的電荷與溶液的pH值有很大關系，蛋白質是兩性電解質，蛋白質在鹼性溶液中成陰離子，在酸性溶液中成陽離子：

蛋白質分子所帶凈電荷為零時的pH值稱為蛋白質的等電點（PI）。在等電點時，蛋白質分子在電場中不向任何一極移動，而且分子與分子間因碰撞而引起聚沉的傾向增加，所以這時可以使蛋白質溶液的粘度、滲透壓均減到最低，且溶液變混濁。若再加入一定量的溶劑如乙醇、丙酮，它們與蛋白質分子爭奪水分子，竭力減低蛋白質水化層的厚度而使混濁更加明顯。
各種蛋白質的等電點都不相同，但偏酸性的較多，如牛乳中的酪蛋白的等電點是4.7~4.8，血紅蛋白等電點為6.7~6.8，胰島素是5.3~5.4，魚精蛋白是一個典型的鹼性蛋白，其等電點在pH12.0~12.4。近年來蛋白質的等電點可以採用等電聚焦技術加以准確測定，但需一定的實驗條件。本實驗採用蛋白質在不同pH溶液中形成的混濁度來確定，即混濁度最大時的pH值即為該種蛋白質的等電點值，這個方法雖然不很准確，但在一般實驗條件下都能進行，操作也簡便。

四、操作步驟：
1．制備蛋白質膠液
（1）稱取酪蛋白3克，放在燒杯中，加入40℃的蒸餾水。
（2）加入50毫升1 mol·L-1氫氧化鈉溶液，微熱攪拌直到蛋白質完全溶解為止。將溶解好的蛋白溶液轉移到500毫升容量瓶中，並用少量蒸餾水洗凈燒杯，一並倒入容量瓶。
（3）在容量瓶中再加入1 mol·L-1醋酸溶液50毫升，搖勻。
（4）加入蒸餾水定容至500毫升，得到略現渾濁的，在0.1mol·L-1 NaAC溶液中的酪蛋白膠體。
2．等電點測定
按下表順序在各管中加入蛋白質膠液，並准確地加入蒸餾水和各種濃度的醋酸溶液，加入後立即搖勻。

觀察各管產生的混濁並根據混濁度來判斷酪蛋白的等電點。觀察時可用+，++，+++，表示渾濁度。

❽ 測定等電點的方法有哪些

交錯分配法。
對一種特定的蛋白質，在不同鹽系統中，pH和其分配系數之間的關系應不同，而在等電點時，得到的均為不帶電時分子的分配系數。對不同的鹽系統，其等電點時的分配系數應相等，兩條pH和分配系數關系的曲線必交於一點，該點所對應的pH值即為該特定蛋白質的等電點。根據這一原則測定蛋白質等電點的方法，稱為交錯分配法

❾ 測定蛋白質等電點的方法的原理是什麼

等電聚焦電泳（IFE,isoelectric focusing electrophoresis）
利用特殊的一種緩沖液（兩性電解質）在凝膠（常用聚丙烯醯胺凝膠）內製造一個pH梯度,電泳時每種蛋白質就將遷移到等於其等電點（pI）的pH處（此時此蛋白質不再帶有凈的正或負電荷）,形成一個很窄的區帶.
還有一種是根據蛋白在等電點時的溶解度來測定,配製一系列不同pH的緩沖液,測定蛋白質的溶解度,溶解度最小的pH就是蛋白的pI.

❿ 測定蛋白質等電點的方法的原理是什麼

蛋白質是兩性電解質，蛋白質在鹼性溶液中成陰離子，在酸性溶液中成陽離子；蛋白質分子所帶凈電荷為零時的ph值稱為蛋白質的等電點（pi）。在等電點時，蛋白質分子在電場中不向任何一極移動，而且分子與分子間因碰撞而引起聚沉的傾向增加，所以這時可以使蛋白質溶液的粘度、滲透壓均減到最低，且溶液變混濁。若再加入一定量的溶劑如乙醇、丙酮，它們與蛋白質分子爭奪水分子，竭力減低蛋白質水化層的厚度而使混濁更加明顯。
各種蛋白質的等電點都不相同，但偏酸性的較多，如牛乳中的酪蛋白的等電點是4.7~4.8，血紅蛋白等電點為6.7~6.8，胰島素是5.3~5.4，魚精蛋白是一個典型的鹼性蛋白，其等電點在ph12.0~12.4。近年來蛋白質的等電點可以採用等電聚焦技術加以准確測定，但需一定的實驗條件。本實驗採用蛋白質在不同ph溶液中形成的混濁度來確定，即混濁度最大時的ph值即為該種蛋白質的等電點值，這個方法雖然不很准確，但在一般實驗條件下都能進行，操作也簡便。