理想的轉染方法有哪些

⑴ 如何選擇不同的轉染方法

市面上的轉染試劑品種很多，商家們還在不斷推出新產品，如此多的選擇難免令人感到無所適從，怎樣才能找到最適合自己的產品呢？轉染試劑的選擇主要取決於細胞類型、細胞種屬和下游實驗。

細胞系不同，它們所需的轉染條件自然也不相同。舉例來說，懸浮培養的鼠類原代細胞，就比貼壁培養的人類細胞更難轉染。此外，神經元和巨噬細胞也令人頗為頭疼，標准方法很難將siRNA轉染進去。

不論是哪種情況，經驗數據都具有無可取代的價值。查閱文獻，與其他研究者多交流都能獲得寶貴的信息。當然，我們也可以在供應商提供的資料中，查看已成功轉染的細胞類型。盡管這些資料中可能並沒有siRNA轉染的專門信息，但了解轉染試劑已經成功轉染了哪些細胞，是很有幫助的。

此外，我們可以向商家索要一點樣品，或者向同事借用一些，對自己的細胞進行試驗。幸運的話，在幾天內就可以鎖定合意的產品。在這里花少許時間，總好過因為實驗結果不理想而要重頭再來吧。

⑵ 如何讓一個細胞過度表達某種基因，來觀察此基因的作用，瞬時轉染和穩定轉染都用什麼方法

轉染的話一般是以克數來規范轉染的質粒數量，所以會有很多質粒。一般轉染的質粒除了帶有需要過表達的基因以外，還需要帶有標記基因。標記基因可以被特定的抗體檢測，從而判斷是否有效表達。如果你要過表達的是某種蛋白，也可以直接通過該蛋白的抗體檢測，對照是沒有轉染的同種細胞，這樣表達效果就可以通過WESTERN BLOT看見了。過表達倒沒什麼標准，每種蛋白表達量也不一致，選擇適合自己的濃度就好。
順轉的話，我們實驗室採用lipo2000，具體步驟網路文庫有，英文的protocol在lipo2000的說明書上也能看到。
穩轉的話一般需要在質粒上構建某個抗性基因，如嘌呤黴素抗性。這樣用抗性培養基多次篩選就可以篩選出穩轉的細胞株，但是比較難。

⑶ 轉染試劑的簡介

哺乳動物的轉染技術在60年代末70年代初即已引入。
目前, 將外源DNA 導入哺乳動物細胞的方法大致可分為兩大類，即生物方法和物理化學方法。物理化學方法中常用的有磷酸鈣法、顯微注射、電穿孔、脂質體介導的轉染，以及最近出現的以高分子聚合物為載體的基因傳遞技術。生物方法則主要是以病毒作為載體,通過病毒感染的方式將外源DNA 導入到細胞中, 其中以逆轉錄病毒及腺病毒轉染系統最為常用。
其中病毒載體的特點是整和效率高, 可使外源基因在宿主細胞中長期表達，缺點是存在潛在的安全危險性。電穿孔法及顯微注射法的特點是轉染率較高，缺點是需要昂貴的儀器，前者對細胞的損傷較大，後者在導入DNA 時需要一個細胞一個細胞地注射，不適合大量細胞研究的需要。
磷酸鈣在良好的轉染條件下，可以在293T等細胞的轉染達到較高的轉染效率。但磷酸鈣轉染有一個突出的問題，非常不穩定，尤其受PH值的影響非常大，在實驗中使用的每種試劑都必須小心校準，保證質量，因為甚至偏離最優條件十分之一個PH都可能導致磷酸鈣轉染的失敗，經常即使最熟練的轉染實驗者也不能保證每次磷酸鈣轉染的成功，他們可能經常為莫名其妙的轉染失敗而沮喪。同時，他們還經常發現，往往小體積的轉染比如6孔板以下的轉染效果比較理想，可一換到大皿，經常轉染效率下降很快。磷酸鈣的先天缺陷往往是實驗梗阻的主要原因。

⑷ 細胞轉染原理

細胞 轉染是指將外源分子如DNA，RNA等導入真核細胞的技術。隨著分子生物學和細胞生物學研究的不斷發展，轉染已經成為研究和控制真核細胞基因功能的常規工具。在研究基因功能、調控基因表達、突變分析和蛋白質生產等生物學試驗中，其應用越來越廣泛。

簡介
轉染 ，是將外源性基因導入細胞內的一種專門技術。隨著基因與蛋白功能研究的深入，轉染目前已成為實驗室工作中經常涉及的基本方法。轉染大致可分為物理介導、化學介導和生物介導三類途徑。電穿孔法、顯微注射和基因槍屬於通過物理方法將基因導入細胞的範例；化學介導方法很多，如經典的磷酸鈣共沉澱法、脂質體轉染方法、和多種陽離子物質介導的技術；生物介導方法，有較為原始的原生質體轉染，和現在比較多見的各種病毒介導的轉染技術。

理想細胞轉染方法，應該具有轉染效率高、細胞毒性小等優點。病毒介導的轉染技術，是目前轉染效率最高的方法，同時具有細胞毒性很低的優勢。但是，病毒轉染方法的准備程序復雜，常常對細胞類型有很強的選擇性，在一般實驗室中很難普及。其它物理和化學介導的轉染方法，則各有其特點。

需要指出的一點，無論採用哪種轉染技術，要獲得最優的轉染結果，可能都需要對轉染條件進行優化。影響轉染效率的因素很多，從細胞類型、細胞培養條件和細胞生長狀態，到轉染方法的操作細節，都需要考慮。

方法
脂質體轉染法
陽離子脂質體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過靜電作用，將DNA分子包裹入內，形成 DNA脂復合物，也能被表面帶負電的細胞膜吸附，再通過融合或細胞內吞進入細胞。脂質體轉染適用於把DNA轉染入懸浮或貼壁培養細胞中，是目前實驗室最方便的轉染方法之一，其轉染率較高，優於磷酸鈣法。由於脂質體對細胞有一定的毒性，所以轉染時間一般不超過24小時。常用細胞類型：cos-7 、BHK、NIH3T3 、Hela等。

電穿孔轉染法
電流能夠可逆地擊穿細胞膜形成瞬時的水通路或膜上小孔促使DNA分子進入胞內，這種方法就是電穿孔。當遇到某些脂質體轉染效率很低或兒乎無法轉入時建議用電穿孔法轉染。一般情況下，高電場強度會殺死50%-70% 的細胞。現在針對細胞死亡開發出了一種電轉保護劑，可以大大的降低細胞的死亡率，同時提高電穿孔轉染效率。

病毒感染
對於脂質體轉染與電穿孔轉染都無法成功轉染的細胞系建議用病毒感染，此法可以快速100%感染，檢測成功率高。

⑸ 什麼是瞬間轉染

轉染(transfection)指真核細胞由於外源dna摻入而獲得新的遺傳標志的過程。哺乳動物的轉染技術在60年代末70年代初即已引入。dna轉染技術的發展對現代分子生物學產生了巨大的影響。基因轉染技術不僅是研究轉基因和基因表達的重要工具，而且是目前基因治療的關鍵步驟。理想的基因轉染試劑應該具有如下特點：1.高效轉染；2.安全；3.低細胞毒性；4.方法簡單；5.省時、經濟。

⑹ 為什麼原代培養的細胞難轉染適合原代細胞轉染的方法有哪些

對原代培養的細胞，可以採用一下方法：
非病毒載體，選擇比較好的轉染試劑，推薦QIAGEN的superfect轉染試劑，對原代細胞還可以。

採用電轉。理論上任何細胞都可以通過電轉，不足之處：需要電轉儀器，緩沖液非常有講究，不同細胞條件要自己摸索，細胞電轉後，狀態很不好。

DEAE-葡聚糖：這是早在1965年出現的轉染方法。帶正電的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚體可以結合帶負電的DNA分子，使得DNA復合物結合在帶負電的細胞表面。通過使用DMSO或甘油獲得的滲透休克，也可能是細胞內吞作用使得DNA復合體進入細胞。DEAE-葡聚糖僅限於瞬時轉染，可重復性好，轉染時要除掉血清。

磷酸鈣共沉澱轉染：最早在1973年開始採用。氯化鈣+DNA+磷酸緩沖液按一定的比例混和，形成極小的磷酸鈣-DNA復合物沉澱黏附在細胞膜表面，藉助內吞作用進入細胞質。沉澱顆粒的大小和質量對於轉染的成功至關重要，pH值、鈣離子濃度、DNA濃度、沉澱反應時間、細胞孵育時間乃至各組分加入順序和混合的方式都可能對結果產生影響，重復性不佳。此法較易得到穩定轉染，但轉染原代細胞比較困難。

電穿孔法：通過短暫的高電場電脈沖處理細胞，沿細胞膜的電壓差異會導致細胞膜的暫時穿孔。DNA被認為是穿過孔擴散到細胞內的。電脈沖和場強的優化對於成功的轉染非常重要，因為過高的場強和過長的電脈沖時間會不可逆地傷害細胞膜而裂解細胞。理論上說電穿孔法可用於各種細胞，且不需要另外采購特殊試劑，但需要昂貴的電轉儀。此法每次轉染需要更多的細胞和DNA，因為細胞的死亡率高。每種細胞電轉的條件都需要進行多次優化。

脂質體法：中性脂質體是利用脂質膜包裹DNA，藉助脂質膜將DNA導入細胞膜內。帶正電的陽離子脂質體則不同，DNA並沒有預先包埋在脂質體中，而是帶負電的DNA自動結合到帶正電的脂質體上，形成DNA-陽離子脂質體復合物，從而吸附到帶負電的細胞膜表面，經過內吞被導入細胞。脂質體法始於1987年，此法的出現使得轉染效率、轉染的穩定性和可重復性大大提高。陽離子脂質體細胞毒性相對較高，對不同的細胞可能會干擾細胞的代謝。

非脂質體的脂質：新一代的脂質體技術，其與DNA結合形成膠束結構而非簡單的雙層膜結構，使DNA的傳遞更有效且細胞毒性明顯降低。

活化的樹狀聚合物：該聚合物的高度樹狀分枝形成球形結構，藉助每個球體無數活化的氨基末端凝聚在DNA上形成較為緻密的結構，並吸附在細胞膜上，經內吞進入細胞。活化的氨基可以調節胞內溶酶體pH值，抑制降解活性，使DNA穩定存在。轉染效率高，毒性低，可重復性好。血清的存在能顯著提高轉染效率。

病毒介導的感染：感染需要將目的基因克隆到特定的病毒體系中，經過包裝細胞的包裝得到改造後的病毒，再進行感染。優點是轉染效率特別高，尤其是難以轉染的原代細胞、活體細胞。

⑺ 懸浮細胞的轉染怎麼做

懸浮細胞的轉染方法：（以下內容轉自生物幫資訊）
DXY721認為：
懸浮細胞和貼壁細胞在轉染過程中差別不大，主要差別在於轉染後的篩選，當然如果你做的是瞬時轉染就不存在篩選的問題了。
其實轉染的過程很簡單，問題是能不能轉的進去的，轉染率能有多少，轉進去是否可以穩定表達目的蛋白等等。
我們也是用脂質體做懸浮細胞的轉染，說明書上都有具體的操作過程，將脂質體和目的基因按比例混合，然後加到細胞懸液里就OK了，說的簡單，實際上還是有一些細節要注意的，比如脂質體和目的基因混合的比例，轉染的細胞數，細胞的代數，細胞的狀態，有的還要求在轉染的前一天傳代一次，不過不要怕，這些在脂質體說明書上都有明確的說明，按照說明書做就可以了。
jinghuanlv認為：
懸浮細胞和貼壁細胞轉染還是有很大不同的。
脂質體轉染的原理基於電荷吸引原理，先形成脂質體-DNA復合物，散布在細胞周圍，然後通過細胞的內吞作用，將目的基因導入細胞內，而脂質體復合物與貼壁細胞的接觸機會比懸浮細胞高出很多倍，所以，脂質體轉染時懸浮細胞的轉染效率要明顯低於貼壁細胞。
我們實驗室轉染懸浮細胞是用的電穿孔法，目前為止，懸浮細胞轉染的最好方法還是電轉，我們實驗室用的電轉儀是Bio-Rad的，使用條件是電壓250V，電容975uF，效果不錯，不妨一用。