定位突變技術包括哪些常用方法

1. 基因定位誘變是啥呀

在DNA水平上產生多肽編碼順序的特異性改變稱為基因的定向誘變。利用這項技術一方面可對某些天然蛋白質進行定位改造，另一方面還可以確定多肽鏈中某個氨基酸殘基在蛋白質結構及功能上的作用，以收集有關氨基酸殘基線性序列與其空間構象及生物活性之間的對應關系，為設計製作新型的突變蛋白提供理論依據。一般而言，含有單一或少數幾個突變位點的基因定向突變可選用下列五種策略，而大面積的定位突變則採取基因全合成的方法。

1 局部隨機摻入法

將待突變的靶基因克隆在一個載體質粒的特定位點上，其上游緊接著兩個酶切位點RE1和RE2，它們分別能產生5』和3』突出的單鏈粘性末端。用大腸桿菌核酸外切酶III末端特異性降解經RE1和RE2雙酶切開的重組質粒3』凹端，並通過酶解反應時間控制新生成的單鏈區域大小（單鏈區域越短，突變精度越高）。終止反應後，單鏈區域用Klenow酶補平，底物除四種正常的dNTP外，還包括一種特殊結構的脫氧核糖核苷酸類似物，在缺口填補過程中，該類似物摻入到DNA鏈的一處或多處。隨後再用S1核酸酶處理單鏈末端，並以T4-DNA連接酶連接成環。重組分子轉化大腸桿菌，在體內復制過程中，由於類似物的鹼基配對非特異性，50%的擴增產物分子內部引入了錯配鹼基，並導致位點突變。由這種方法產生的突變體一般含有幾對取代鹼基，而突變的區域則取決於外切酶III末端降解的程度。

2 鹼基定點轉換法

能導致鹼基定點轉換的最簡單方法是使用某些化學試劑在體外誘變DNA分子。通常將質粒DNA或待突變DNA片段用誘變劑處理後，轉化大腸桿菌，構建突變體文庫。最常見的體外誘變劑為亞硫酸氫鈉，在DNA單鏈的情況下，它能特異性地使胞嘧啶殘基脫氨形成尿嘧啶殘基。處理後的DNA單鏈再由DNA聚合酶體外轉化為雙鏈結構，在復制過程中，原DNA分子上的CG鹼基對便轉換成TA鹼基對。從表面上看這種方法所引入的突變並非定點，但如果合適地控制誘變劑的處理條件，便能做到每個DNA單鏈分子只含單一轉換的鹼基，而且其位點隨機分布，這樣即可在樣本龐大的突變體文庫中挑選出在期望位點上突變的重組分子。
除了上述化學誘變外，還可以藉助於酶促合成對DNA分子進行所有可能的鹼基對轉換。其原理是使單鏈DNA在不理想的反應條件下進行體外復制，如較高或較低的離子強度、不平衡的四種核苷酸底物濃度以及缺少從3』至5』核酸外切活性的DNA聚合酶（Taq）等。在體外DNA聚合反應系統中，如果某種核苷酸底物濃度過低，當模板要求該底物時便有可能為其它三種底物所取代，從而導致序列突變。

3 部分片段合成法

如果在待突變的位點上下游含有合適的限制性內切酶識別序列，尤其當多個待突變位點集中分布在該區域時，可考慮直接化學合成這一片段，在此過程中將欲突變的鹼基設計進去，然後以此人工合成的寡聚核苷酸片段置換重組質粒上對應的待突變區域，即可完成基因的定點突變。部分片段合成法特別適用於系統改變功能蛋白的氨基酸序列，並在體內觀察突變位點對蛋白質生物功能的影響，從而確立突變前這些氨基酸殘基對蛋白質結構和功能的貢獻。例如，在大腸桿菌噬菌體433和P22阻遏蛋白分子中，-螺旋-轉角--螺旋結構域與操作子DNA的結合特性就是用上述方法研究的。

4 引物定點引入法

引物定點引入法實質上是一種寡聚核苷酸介導的定點誘變方法，它能在克隆基因內直接產生各種點突變和區域突變。首先將待突變的目的基因克隆在M13-RF DNA載體上，轉化大腸桿菌，挑選重組噬菌斑，從中分離出重組DNA正鏈；人工合成與待突變區域互補的寡聚核苷酸引物，並在此過程中設計引入突變鹼基，然後在較溫和條件下與重組DNA正鏈退火，經DNA體外復制和連接後，雙鏈分子重新轉化大腸桿菌；以上述合成的寡聚核苷酸片段為探針，在嚴格條件下（如將雜交溫度提高5-10℃）雜交篩選含有突變鹼基的噬菌斑，從中分離純化出RF DNA雙鏈分子進行克隆表達。相似地，若要在DNA特定位點上插入或缺失一段，也可設計合成特殊結構的寡聚核苷酸引物，並將之引入待突變區域。但須注意的是欲插入或缺失的DNA片段應小於引物本身的長度，否則退火操作相當困難。
從理論上來講，在DNA體外復制並克隆後，攜帶突變鹼基的噬菌斑應為重組噬菌斑總數的一半，但由於技術上的原因，這種期望的噬菌斑通常只有1～5%。為了特異性富集突變體便於篩選，可將待突變的重組M13-RF DNA分子首先轉化具有t和ung兩個DNA代謝酶基因缺陷的大腸桿菌受體菌株。前者由於不能合成dUTP水解酶，致使細菌細胞內dUTP含量急劇上升，在DNA體內復制時，dUTP部分取代dTTP摻入到DNA新生鏈中；後者為尿嘧啶糖基化酶基因缺陷，這種變異株喪失了切除DNA鏈中脫氧尿嘧啶核苷酸殘基的能力。由該菌株產生的重組M13 DNA正鏈分子中大約有1%的T為U所取代，經體外復制後，再將雙鏈DNA分子導入正常的大腸桿菌受體細胞中。此時，該菌的尿嘧啶N-糖基化酶除去DNA鏈上的脫氧尿嘧啶核苷酸殘基，使原來的模板鏈降解，而突變鏈因不含U被完整地保留下來。

5 PCR擴增突變法

將待突變的靶基因克隆在一個載體質粒上，重組分子分在含有兩種不同引物的反應管A和B中。在A管內，引物I與克隆基因的區域互補，並含有唯一一個錯配鹼基（即突變位點），引物II則與載體區域完全互補，使得兩個引物的末端位於待突變位點的右側；在B管內，兩個引物均與克隆基因互補，但引物III含有一個錯配鹼基，引物IV則完全互補，兩個引物的末端位於待突變位點的左側。經若干輪PCR擴增反應後，積累的雙鏈DNA產物均為線型平頭分子。將A、B兩管的擴增產物混合變性並退火，只有I-III和II-IV雜合雙鏈呈交叉缺口的環狀結構且含有突變位點，這種分子不經連接可直接轉化大腸桿菌，而其它組合形式的雜合雙鏈則為線型分子，通常難以形成克隆。

2. 如何用基因組學的方法定位一個突變基因

基因組(GENOME)一詞是1920年Winkles從GENes和chromosOEs鑄成的，用於描述生物的全部基因和染色體組成的概念。

1986年美國科學家Thomas Roderick提出了基因組學(Genomics)，指對所有基因進行基因組作圖(包括遺傳圖譜、物理圖譜、轉錄本圖譜)，核苷酸序列分析，基因定位和基因功能分析的一門科學。因此，基因組研究應該包括兩方面的內容:以全基因組測序為目標的結構基因組學(structural genomics)和以基因功能鑒定為目標的功能基因組學(functional

genomics)，又被稱為後基因組(postgenome)研究。

功能基因組學(Functuional genomics)又往往被稱為後基因組學(Postgenomics)，它利用結構基因組所提供的信息和產物，發展和應用新的實驗手段，通過在基因組或系統水平上全面分析基因的功能，使得生物學研究從對單一基因或蛋白質得研究轉向多個基因或蛋白質同時進行系統的研究。這是在基因組靜態的鹼基序列弄清楚之後轉入對基因組動態的生物學功能學研究。研究內容包括基因功能發現、基因表達分析及突變檢測。基因的功能包括:生物學功能，如作為蛋白質激酶對特異蛋白質進行磷酸化修飾;細胞學功能，如參與細胞間和細胞內信號傳遞途徑;發育上功能，如參與形態建成等。採用的手段包括經典的減法雜交，差示篩選，cDNA代表差異分析以及mRNA差異顯示等，但這些技術不能對基因進行全面系統的分析，新的技術應運而生，包括基因表達的系統分析(serial analysis of gene

expression,SAGE)，cDNA微陣列(cDNA microarray)，DNA 晶元(DNA chip)等。

結構基因組學是基因組學的一個重要組成部分和研究領域，是一門通過基因組作圖、核苷酸序列分析確定基因組成、基因定位的科學。

功能基因組學是利用結構基因組所提供的信息，發展和應用新的實驗手段，通過在基因組水平上全面分析基因的功能，使得生物學研究從對單一基因轉向多個基因或蛋白質的研究同時進行系統研究的科學。

3. 基因定向突變的技術的方法和原理

不論是真核生物還是原核生物的突變，也不論是什麼類型的突變，都具有隨機性、稀有性和可逆性等共同的特性。
①隨機性。指基因突變的發生在時間上、在發生這一突變的個體上、在發生突變的基因上，都是隨機的。在高等植物中所發現的無數突變都說明基因突變的隨機性。在細菌中則情況遠為復雜。
②稀有性。突變是極為稀有的，野生型基因以極低的突變率發生突變。
③可逆性。突變基因又可以通過突變而成為野生型基因，這一過程稱為回復突變
。正向突變率總是高於回復突變率，一個突變基因內部只有一個位置上的結構改變
才能使它恢復原狀。
④少利多害性。一般基因突變會產生不利的影響，被淘汰或是死亡，但有極少數會使物種增強適應性。
⑤不定向性。例如控制黑毛a基因可能突變為控制白毛的a+或控制綠毛的a
說白了，隨機性指的是突變的發生是隨機的，何時何地何人是不一定的。
不定向性指的是突變的效果千奇百怪，如同本來是白色的可以變成紅橙黃綠青藍紫等等任何一種顏色都有可能。

4. 蛋白質工程中定點突變技術的原理及流程

通過多聚酶鏈式反應（PCR）等方法向目的DNA片段中引入所需變化（通常是有利的），包括鹼基對的增添、缺失和替換等。定點突變能迅速，高效地改變DNA所表達的目的蛋白，從而影響生物性狀，是基因研究工作中一種非常有用的手段。

定點突變需要設計特定的突變引物。引物長度一般為25-45 bp，建議選擇30-35bp長度的引物p。引物至少要11-12個bp才能與模板搭上，而這種突變PCR要求引物兩邊都能與模板搭上，所以引物的兩邊各設至少12個bp。

定點突變實驗注意事項

1、引物設計時須參照引物設計原則，注意引物中的GC含量，引物長度等，可在引物的兩端選擇G或者C，可以提高引物和模板結合的概率。

2、PCR過程中未得到相應大小條帶或條帶不單一，應適當調整退火溫度，已調整聚合酶和引物的特異性。

3、使用一輪PCR產物進行第二輪PCR時，需等量加入作為模板的PCR產物的mol量。

4、某些特殊的限制性酶切酶處理基因時需要進行65℃滅酶處理（如I-CEUI,PI-SCEI），以使內切酶變性和DNA分離。

5、連接後轉化，注意載體中的抗性基因，可以設置空白對照，已轉化後得到的單菌落數量評估獲取陽性克隆的概率。

5. 常用的基因突變檢測方法有哪些

1、焦磷酸測序法

測序法的基本原理是雙脫氧終止法，是進行基因突變檢測的可靠方法，也是使用最多的方法。但其過程繁瑣、耗時長，靈敏度不高，對環境和操作者有危害，故在臨床應用中存在一定的限制。

焦磷酸測序法適於對已知的短序列的測序分析，其可重復性和精確性能與SangerDNA測序法相媲美，而速度卻大大的提高。

焦磷酸測序技術產品具備同時對大量樣品進行測序分析的能力。為大通量、低成本、適時、快速、直觀地進行單核苷酸多態性研究和臨床檢驗提供了非常理想的技術操作平台。

2、微數字聚合酶鏈反應

該方法為將樣品作大倍數稀釋和細分，直至每個細分試樣中所含有的待測分子數不超過1個，再將每個細分試樣同時在相同條件下聚合酶鏈反應後，通過基因晶元逐個計數。該方法為絕對定量的方法。

3、聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性分析技術

聚合酶鏈式反應（PCR）是一種用於放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加。該法一般用於檢測已知的突變位點。

因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發、皮膚或血液，只要能分離出一丁點的DNA，就能用PCR加以放大，進行比對。這也是「微量證據」的威力之所在。

由1983年美國Mullis首先提出設想，1985年由其發明了聚合酶鏈反應，即簡易DNA擴增法，意味著PCR技術的真正誕生。到如今2013年，PCR已發展到第三代技術。1976年，台灣科學家錢嘉韻，發現了穩定的Taq DNA聚合酶，為PCR技術發展也做出了基礎性貢獻。

PCR是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈，低溫（經常是60°C左右）時引物與單鏈按鹼基互補配對的原則結合，再調溫度至DNA聚合酶最適反應溫度（72°C左右）。

DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈。基於聚合酶製造的PCR儀實際就是一個溫控設備，能在變性溫度，復性溫度，延伸溫度之間很好地進行控制。

4、高效液相色譜法

該方法是基於發生錯配的雜合雙鏈DNA與完全匹配的純合雙鏈DNA解鏈特徵的差異而進行檢測的，可檢測出含有單個鹼基的置換、插入或缺失的異源雙鏈片段。

與測序法相比，該法簡單、快速，不僅可用於已知突變的檢測，還可用於未知突變的掃描。但只能檢查有無突變，不能檢測出突變類型，結果判斷容易出錯。

5、單鏈構象異構多態分析技術

依據單鏈DNA在某一種非變性環境中具有其特定的第二構象，構象不同導致電泳的遷移率不同，從而將正常鏈與突變鏈分離出來。與測序法相比，靈敏性更高。

6. 什麼是基因的定位誘變

定點突變是指通過聚合酶鏈式反應（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因組,也可以是質粒）中引入所需變化（通常是表徵有利方向的變化）,包括鹼基的添加、刪除、點突變等.定點突變能迅速、高效的提高DNA所表達的目的蛋白的性狀及表徵,是基因研究工作中一種非常有用的手段.
體外定點突變技術是研究蛋白質結構和功能之間的復雜關系的有力工具,也是實驗室中改造/優化基因常用的手段.蛋白質的結構決定其功能,二者之間的關系是蛋白質組研究的重點之一.對某個已知基因的特定鹼基進行定點改變、缺失或者插入,可以改變對應的氨基酸序列和蛋白質結構,對突變基因的表達產物進行研究有助於人類了解蛋白質結構和功能的關系,探討蛋白質的結構/結構域.而利用定點突變技術改造基因：比如野生型的綠色熒光蛋白（wtGFP）是在紫外光激發下能夠發出微弱的綠色熒光,經過對其發光結構域的特定氨基酸定點改造,現在的GFP能在可見光的波長范圍被激發（吸收區紅移）,而且發光強度比原來強上百倍,甚至還出現了黃色熒光蛋白,藍色熒光蛋白等等.定點突變技術的潛在應用領域很廣,比如研究蛋白質相互作用位點的結構、改造酶的不同活性或者動力學特性,改造啟動子或者DNA作用元件,提高蛋白的抗原性或者是穩定性、活性、研究蛋白的晶體結構,以及葯物研發、基因治療等等方面.

7. 實時定向基因突變技術是什麼意思

基因定向突變是指通過聚合酶鏈式反應等方法向目的DNA片段中引入所需變化，包括鹼基的添加、刪除、點突變等。

方法原理：基因突變定向誘變利用重組DNA技術使DNA分子在指定位置上發生特定的變化，從而收到定向的誘變效果。

定向突變能迅速、高效的提高DNA所表達的目的蛋白的性狀及表徵，是基因研究工作中一種非常有用的手段。