Ⅰ 基因克隆的策略有哪些
利用計算機來協助克隆的第一步是必須獲得感興趣的EST，在dbEST資料庫中找出EST的最有途徑是尋找同源序列，標准：長度≥100bp，同源性50%以上、85%以下。可通過數個萬維網界而使用BLAST檢索程度實現，其中最常用的如NCBI（National Center for Biotechnology Information）的GenBank、義大利Tigem的ESTmachine（包括EST提取者和EST組裝機器）、THC（Tentative Human Consensus Sequences）資料庫、ESTBlast檢索程序——通過英國人類基因組作圖項目資源中心（Human Genome Mapping Project Resource Center，HGMP—RC）伺服器上訪問。然後將檢出序列組裝為重疊群（contig），以此重疊群為被檢序列，重復進行BLAST檢索與序列組裝，延伸重疊樣系列，重復以上過程，直到沒有更多的重疊EST檢出或者說重疊群序列不能繼續延伸，有時可獲得全長的基因編碼序列。獲得這些EST序列數據後，再與GeneBank核酸資料庫進行相似性檢測，假如鳳有精確匹配基因，將EST序列數據據EST六種閱讀框翻譯成蛋白質，接著與蛋白質序列資料庫進行比較分析。基因分析的結果大致有三種：第一是已知基因，是研究對象為人類已鑒定和了解的基因；第二是以前未經鑒定的新基因；第三是未知基因，這部分基因之間無同種或異種基因的匹配。新基因和未知基因將進一步用於生物學研究。
Ⅱ 從生物體克隆目的基因的方法有哪些
1.PCR擴增克隆法
PCR擴增克隆法是在已知植物基因序列的基礎上，進行基因序列克隆的一種方法。先從基因文庫（genebank）中找到有關基因序列，據此合成一對寡聚核苷酸引物，從植物中提取染色體DNA或RNA，進行PCR擴增。擴增的片段純化後插入合適的質粒載體上，用酶切分析和序列分析檢測重組子，並與已知基因序列比較，以獲得目的基因。
2.功能克隆法
功能克隆（functionalcloning）是根據性狀的基本生化特徵，在鑒定已知基因功能後進行克隆。該法在純化相應的編碼蛋白質後，構建cDNA文庫或基因組文庫。然後從文庫中用下述兩種方法進行基因篩選，其一是將純化的蛋白質進行氨基酸測序，據此合成寡核苷酸探針，從cDNA文庫或基因組文庫中篩選編碼基因；其二是將編碼蛋白質製成相應抗體探針，從cDNA載體表達文庫中篩選相應克隆。實行功能克隆的關鍵步驟是分離出高純度蛋白質。對於產物不明的基因，不能利用這一方法進行克隆。
3.定位（圖位）克隆法
定位（圖位）克隆法（positionalcloning）根據目的基因在染色體上的位置，進而通過染色體步移（chromosomewalking）進行克隆。需預先建立具有目的基因的適宜遺傳分離群體（近等基因系或分離群體），將目的基因精確定位在染色體特定的位置之後，用目的基因兩側緊密連鎖的分子標記（RFLP標記）為探針，篩選基因組文庫，得到陽性克隆，然後以陽性克隆的末端作為探針，獲得含有目標基因的大片段克隆，然後以這些新的DNA為探針，獲得更趨近目的基因的DNA片段，不斷縮小篩選區域，逐步向目的基因靠近，最終克隆到該基因。
4.轉座子標記法
轉座子（transposon）是可從一個基因位置轉移到另一位置的DNA片段，而原來位置的DNA片段（轉座子）並未消失，發生轉移的只是轉座子的拷貝。基因轉座可引起插入突變，使插入位置的基因失活，並誘導產生突變型。通過標記基因就可以檢測出突變基因的位置，進而克隆該突變基因。這樣將轉座子作為基因定位的標記，並通過轉座子在染色體上的插入和嵌合來克隆基因稱為轉座子標記法（transposontagging）。para>5.減法雜交法
該法根據植物表現型差異或基因在不同組織或器官的表達差異來克隆植物基因。特異性表達的基因，其mRNA表現不同。分別從表達特異性基因的植物組織和無特異性基因的組織中提取mRNA，反轉錄為cDNA，兩者雜交。在兩種組織中都表達的基因產物形成雜交分子，而特異mRNA轉錄的cDNA仍保持單鏈狀態，將這種單鏈cDNA分離出來即為差異表達的基因，這一策略被稱作減法雜。
6.mRNA差異顯示法
該法可有效鑒別並克隆差異表達的基因。提取不同的mRNA後可用共同的引物反轉錄成cDNA，進行PCR擴增，獲得差異表達的cDNA序列，作為探針，在cDNA文庫或基因組文庫中篩選基因，並作功能分析。該法可直觀篩選差異表達的基因，比減法雜交操作方便、迅速，需要總RNA量少，效率高，短期內可完成cDNA的擴增、鑒定和克隆。
Ⅲ 基因克隆有哪些步驟，如何篩選陽性克隆
簡單的說一下：
1.
擴增目的基因，比如通過PCR的方法。
2.
PCR擴增的序列可以通過酶切或者TOPO
TA的方法插入到載體質粒。
3.
轉染大腸桿菌
4.
篩選陽性克隆一般常採用藍白克隆方法，就是在載體上，序列的插入位置本來是一個完整編碼β-gal這個酶的序列，如果不被破壞，產生的酶可以降解細菌培養盤上的底物，形成藍色產物。如果有目的序列插入，這個酶就不能表達，形成的克隆就是白色的。
5.
挑取陽性克隆，測序確認無變異和方向後，擴增質粒，提純質粒。
Ⅳ 怎樣克隆一個目的基因
目的基因的克隆是利用一個單一的基因副本的行為。有pcr方法，凝膠電泳方法，色譜法，瓊脂糖凝膠電泳法，質粒法等。具體方法可分別檢索文獻。
常用的植物目的基因克隆技術
1、通過已知基因產物的分析和鑒定
這類技術主要通過生物化學和病理學研究分離鑒定有關基因的蛋白產物，並對蛋白質氨基酸順序進行分析，推斷出編碼該蛋白質的基因序列，然後通過抗體、寡聚核苷酸探針或PCR制備的探針對文庫進行篩選來分離目的基因。如植物抗病蟲基因工程中常用的蘇雲金桿菌殺蟲晶體蛋白基因（Bt基因）、豇豆胰蛋白酶抑制基因（CpTI基因）、病毒外殼蛋白基因（CP基因）等。當其他植物的同類基因已分離到並且核苷酸序列保守性較高時，也可直接用這些已知的基因片段作探針對未克隆到該基因的植物基因文庫進行篩選，也可分離到未知的新基因。
2、通過遺傳表型分析
（1）基因標鑒法。該法是利用轉座子或T-DNA插入植物的基因組中引起某一基因失活產生一些突變體，然後用相應轉座子或T-DNA對突變體文庫進行篩選，以選到的陽性克隆片段為探針，再篩選野生型植物因文庫分離目的基因。如將一株帶有功能的轉位因子系統的植物與另一株在遺傳上有差異的同種植物雜交，在雜交後代中篩選由於轉位因子插入到某一特定基因序列中導致表型破壞或改變的突變株，用該純合突變株構建基因文庫，然後將轉位因子用同位素標記作探針，從該文庫中篩選出帶有同源轉位因子的目的基因。該法主要限於二倍體的自花授粉作物如玉米、金魚草等。應用該法已分離出與玉米種子發育有關的Viviparious-1基因及與金魚草花發育有關的一些基因等。
（2）激發子的寄主受體基因克隆技術。該技術是利用病菌無毒基因（avrgene）編氳募し⒆佑爰鬧骺共』�蟣嗦氳氖芴逯�浯嬖誆磺綴偷幕プ鞴叵擔�圓≡�し⒆擁鞍孜�咚鞣擲牒塗寺〕鮃恍┘付≈士共』�潁�綬�延胛薅凈�騛vr9對應的抗病基因cf9，與avrPto對應的抗病基因pto；擬南芥菜與avrRPS2對應的抗病基因rpS2等。
3、以圖譜為基礎的定位克隆技術
以圖譜為基礎的定位克隆技術在分離未知產物的基因方面有廣闊的應用前景。該法的基本前提是基因定位，然後以緊密連鎖的分子標記如RFLP等為起點，通過染色體步移逐步向目標基因靠近，最終克隆基因。其主要步驟包括：（1）將目標基因定位在高密度的分子標記連鎖群上；（2）利用PFGE將連銷標記的遺傳圖譜距轉換成物理距離；（3）構建YAC文庫，找到含連鎖標記的YAC克隆，並通過克隆的排序獲得目標基因的DNA片段；（4）通過轉化和功能互補試驗證實基因所在的DNA片段。如用該技術已分離出番茄抗根結線蟲mi基因和擬南芥菜抗細菌性莖腐病的RPM1基因等。
Ⅳ 目標基因克隆的主要方法有哪些
基因克隆技術包括了一系列技術，它大約建立於70年代初期。美國斯坦福大學的伯格（P.Berg）等人於1972年把一種猿猴病毒的DNA與λ噬菌體DNA用同一種限制性內切酶切割後，再用DNA連接酶把這兩種DNA分子連接起來，於是產生了一種新的重組DNA分子，從此產生了基因克隆技術。1973年，科恩（S.Cohen）等人把一段外源DNA片段與質粒DNA連接起來，構成了一個重組質粒，並將該重組質粒轉入大腸桿菌，第一次完整地建立起了基因克隆體系。
一般來說，基因克隆技術包括把來自不同生物的基因同有自主復制能力的載體DNA在體外人工連接，構建成新的重組DNA，然後送入受體生物中去表達，從而產生遺傳物質和狀態的轉移和重新組合。因此基因克隆技術又稱為分子克隆、基因的無性繁殖、基因操作、重組DNA技術以及基因工程等。
採用重組DNA技術，將不同來源的DNA分子在體外進行特異切割，重新連接，組裝成一個新的雜合DNA分子。在此基礎上，這個雜合分子能夠在一定的宿主細胞中進行擴增，形成大量的子代分子，此過程叫基因克隆。
Ⅵ 基因克隆的常用方法有哪幾種
根據已知探針克隆基因
這也是基因克隆的一種較直接的方法。首先將探針作放射性或非放射性標記,再將其與用不同內切酶處理的基因組DNA雜交,最後將所識別的片段從膠中切下來，克隆到特定的載體(質粒、噬菌體或病毒)中作序列測定或功能分析。這種方法不但可以將基因克隆出來,還能同時觀察該基因在基因組中的拷貝數。但在探針雜交後,要注意高強度(highstringent)漂洗,以避免干擾信號,即保證克隆的特異性,同時節省時間。
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