影響酶免疫組化方法的因素有哪些

㈠ 影響酶活性測定準確性的因素有哪些

1．底物濃度 除選擇適合的底物外，在實際應用中更多考慮的是底物濃度。由於[S]與反應速度V成雙曲線關系，在酶活性測定時，要求[S]達到一定水平以保證酶活性與酶量成正比。[S]范圍一般選擇在10～20Km為宜，此時反應速度基本達到最大反應速度，測定的誤差在可接受范圍。
2．酶濃度 在反應條件一定時，酶濃度與反應速度成正比。按照中間產物學說，只有[S]>>[E]時，酶才能被底物分子飽和，反應速度才能達到最大值。因此當標本酶活力過高時，應將標本適當稀釋後再加以測定。
3．溫度 不同的酶最適溫度可以不同，多數酶的最適溫度在37～40℃，高於或低於最適溫度，酶活性都降低。目前，酶活性的測定溫度尚未統一，但常規實驗室多使用37℃。溫度對酶促反應的影響程度通常用溫度系數(Q10)表示。溫度系數指溫度每升高10℃，化學反應速度增加的倍數。Q10通常為l～2。由溫度系數得知，溫度的變化對酶活性有著重要影響，因此要求酶活性測定要在恆溫條件下進行，溫度波動要控制在±1℃。
4．離子強度和pH值 在最適pH時，酶的活性最強，高於或低於最適pH，酶的活性都降低，多數酶的最適pH在5～8之間。在測定酶活性時，要求緩沖液具有足夠的緩沖容量，以便使pH值保持穩定。血漿或血清標本含有多種緩沖溶質，具有較強的緩沖能力。為了防止血漿或血清標本緩沖溶質對反應液酸鹼度的影響，使pH不致偏離設定值，標本用量不宜過大，血漿或血清標本體積／反應液體積≤1／10為宜。
5 輔助因子 某些金屬離子和維生素類輔酶是結合酶的輔助因子，例如Zn2+是羧基肽酶的輔基，Mo6+是黃嘌呤氧化酶的輔基，NADH是不需氧脫氫酶的輔酶。這些酶離開它們的輔基或輔酶就不能表現活性，因此在酶活性測定時，就要保證輔基或輔酶的供給。
6．激活劑 有些酶在有激活劑存在時才有活性或活性較高，例如Mg2+是肌酸激酶的激活劑，Cl-是澱粉酶的激活劑。因此在酶活性測定時，也要滿足酶對激活劑的需要。
7．抑制劑 酶的抑制可分為不可逆抑制和可逆抑制，後者又可分為競爭性抑制和非競爭性抑制。重金屬離子和砷化物對巰基酶的抑制、有機磷對羥基酶的抑制屬於不可逆抑制；丙二酸對琥珀酸脫氫酶的抑制、磺胺類葯物對二氫葉酸合成酶的抑制屬於競爭性抑制；哇巴因對Na+，K+-ATP酶的抑制屬於非競爭性抑制。抑制劑使酶活性降低，在測定酶活性時，應避免抑制劑的影響。

㈡ 免疫組化實驗染色的注意事項及影響因素有哪些

免疫組化染色影響因素
影響免疫組化染色質量的因素有很多，在實驗中應注意組織的取材和固定，選擇質量好的商品化抗體，恰當地選擇和使用封閉和抗原修復手段，嚴格的技術操作和對照等。
1。假陰性反應可發生在：
1) 組織內待測抗原已被分解破壞，或抗原含量過低；
2) 抗原被遮蓋，多由於醛類固定劑的使用，使組織中的大分子蛋白借醛鍵形成交聯而遮蓋待檢抗原；
3) 抗體質量不佳或稀釋度不當；
4) 技術操作失誤等。
2．假陽性反應可發生在：
1) 抗體與非待檢抗原發生交叉反應，在使用多克隆抗體時易出現；
2) 組織對抗體的非特異性吸附，特別是在有大片組織壞死或組織中有較多富於蛋白的液體時容易發生；
3) 內源性過氧化酶的作用，在脾臟、骨髓及一些炎性病變組織的染色中易出現；內源性鹼性磷酸酶的作用，特別是腸黏膜上皮和腎近曲小管的刷狀緣有高濃度的鹼性磷酸酶，若處理不徹底，易出現假陽性結果；
4) 判斷失誤，將腫瘤組織中殘留的正常組織的免疫組織化學陽性信號誤認為是腫瘤的染色反應；
5) 當腫瘤浸潤破壞正常組織時，使被破壞的正常細胞胞漿內的可溶性蛋白釋放，後者被腫瘤細胞非特異吸附或吞噬，使瘤細胞出現該種抗原的陽性反應；⑥外源性和內源性色素的干擾。

㈢ 影響酶免疫組織化學技術的因素有哪些

免疫組化技術對於研究 腫瘤的發展規律，進行良惡性分類及鑒別診斷具有重要的作用。免疫組化染色的結果，與組織的固定、抗原的修復、抗體的保存及使用三個重要因素相關密切。
1、 固定
常用的組織固定液是甲醛，標本必須及時固定，這有利於抗原的保存，防止抗原在組織細胞內彌散、丟失或失去免疫活性，但固定時間最好為!" 小時，一般不超過"# 小時，因固定時間越長，部分組織細胞免疫組化標記敏感性會明顯降低。其原因為甲醛固定過程中會形成醛鍵或羧甲基，而封閉了部分抗原決定簇；也會使蛋白與蛋 白之間發生交聯，也可能會封閉抗原決定簇，使許多抗原如常用的$%、&$』( 等免疫反應明顯減弱，甚至消失，致酶標不能得出正確的結果，因此在染色時為取得良好的染色效果，必須對有些抗原進行預先修復，以進一步暴露抗原。
2、 修復抗原
外檢組織經過甲醛固定、脫水透明及浸蠟過程，組織中的抗原成分已被破壞或封閉，為了恢復組織的抗原性和提高組織對抗體的敏感性，一般需 修復抗原。有人用蛋白酶消化，或微波處理，或高壓鍋處理，使封閉的抗原成分暴露出來而顯色。我們採用高溫高壓處理切片，切片在弱酸及高溫高壓下，

使 封閉的抗原顯示出來，提高了陽性檢出率和陽性強度，同時減輕了背景著色，使陽性結果清晰可辨。當然，不同組織、不同抗原其所用的高壓時間及選用合適的抗原 修復緩沖液及其最適的.』 等均對結果影響甚大。我科一般採用+/+! 012 3 ( 檸檬酸鈉緩沖液（.』 -/ +）作為抗原修復液，高溫高壓時間以!+ 045 顯色效果最好，且幾乎無脫片發生。實踐證明，高壓處理技術應用於免疫組織化學具有經濟、簡便、陽性率高、定位準確、染色清晰等優點，容易推廣應用。

3、 正確保存及使用抗體
抗體是免疫組織化學最基本的試劑與材料，它可分為第一抗體與第二抗體，因為抗體是蛋白質構成，保存或使用不當，不但會造成浪 費，而試劑變質會出現假陰性結果。對抗體及6 , 7 試劑盒均應放置低溫冰箱貯存，用一支取一支，對於一次用不完的抗體可保存在# 8冰箱內，而不要放在冰格室，因為那裡的溫度在+ 8以下，抗體會很快結冰，再次使用時又要溶解。這樣幾次凍融，抗體效價會急劇下降而失效。對一些將近失效期或已過失效期，有的適當
提高工作濃度， 也可以作出正確的結果，以免丟失造成浪費。

㈣ 影響酶促反應的因素是什麼

溫度、酸鹼度、酶濃度、底物濃度、抑制劑。

酶促反應速度達到最大時的環境溫度稱為酶的最適溫度。高於或低於最適溫度，酶促反應速度均降低。人體內各種酶的最適溫度在37℃左右。

在一定溫度、pH條件下，當底物濃度大於酶濃度時，酶促反應速度與酶濃度成正比例關系。

酶活性降低，在測定酶活性時，應避免抑制劑的影響。使酶活性降低或喪失的物質稱為抑制劑。抑制分為競爭性抑制和非競爭性抑制，在酶活性測定過程中，應盡量避免抑制劑存在。但在有的反應體系中，加入競爭性抑制劑可以提高工具酶的米氏常數。

在一定溫度、pH條件下，酶濃度一定時，酶促反應速度與底物濃度的關系呈矩形雙曲線。底物濃度很低時，反應速度與底物濃度成正比；底物濃度再增加，反應速度的增加趨緩；當底物濃度達某一值後，反應速度達到最大，反應速度不再增加。

酶促反應速度達到最大時的反應體系的pH稱為酶的最適pH。pH低於或高於最適值，酶促反應速度均降低。人體內多數酶的最適pH接近於7，但也有例外，如胃蛋白質酶的最適pH為1.8；肝精氨酸酶的最適pH為9.8。

㈤ 影響酶活性的因素有

摘要 您好，影響酶活性的主要因素是溫度和pH值。其中溫度比較重要，人體內酶的活性在37攝氏度是最佳。生物酶各自適應的酶的溫度不同。植物光合作用酶的活性在20攝氏度左右最強。在一定的范圍內，酶的活性隨著溫度的升高而升高，但是溫度過高會使酶失活。

㈥ 影響酶促反應的因素有哪些用曲線表示他們的影響為什麼會產生這些影響

影響酶促反應的因素：
分三個方面：
1 濃度影響：酶濃度，底物濃度，產物濃度等。
2 外界因素（環境因素）：壓力，PH值，溶液的介電常數與離子強度，溫度等。
3 內部因素（結構因素）：底物濃度及效應物，酶結構等。

其中用到較多的是濃度影響，溫度，PH值的影響等，結構因素就要從分子的角度去解釋。

濃度的影響很容易解釋，酶濃度和底物濃度高了，自然反應會快。對於產物而言，經常會出現反饋抑制現象，所以產物濃度高了，往往會抑制反應的進行。

溫度和PH值的影響，他們的曲線都是「鍾形」的。
其中對於溫度而言，一定的酶促反應都是由正向的酶促反應與酶的失活反應的復合。當時間一定，隨溫度的升高，反應速率增大，轉化率提高，但當溫度高於某一值時，由於酶的熱失活速率加快，當快於酶促反應速率上升的速度時，酶的總反應速率下降，最終降為零。對某一反應時間，就有一與最高轉化率對應的溫度，該溫度稱為最適溫度。不同的反應時間，有不同的最適溫度。最適溫度是溫度對酶促反應速率和酶失活速率雙重作用的結果。

㈦ 影響酶免疫組織化學技術的因素有哪些

1.溫度：酶促反應在一定溫度范圍內反應速度隨溫度的升高而加快；但當溫度升高到一定限度時，酶促反應速度不僅不再加快反而隨著溫度的升高而下降。在一定條件下，每一種酶在某一定溫度時活力最大，這個溫度稱為這種酶的最適溫度。
2.酸鹼度：每一種酶只能在一定限度的pH范圍內才表現活性，超過這個范圍酶就會失去活性。
3.酶濃度：在底物足夠，其它條件固定的條件下，反應系統中不含有抑制酶活性的物質及其它不利於酶發揮作用的因素時，酶促反應的速度與酶濃度成正比。
4.底物濃度：在底物濃度較低時，反應速度隨底物濃度增加而加快，反應速度與底物濃度近乎：成正比，在底物濃度較高時，底物濃度增加，反應速度也隨之加快，但不顯著；當底物濃度很大且達到一定限度時，反應速度就達到一個最大值，此時即使再增加底物濃度，反應也幾乎不再改變。
5.抑制劑：能特異性的抑制酶活性,從而抑制酶促反應的物質稱為抑制劑。
6.激活劑：能使酶從無活性到有活性或使酶活性提高的物質稱為酶的激活劑。

㈧ 影響酶聯免疫吸附試驗結果的常見因素及控制方法

（一）雙抗體夾心法

雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：

（1）將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結合的抗體及雜質。

（2）加受檢標本：使之與固相抗體接觸反應一段時間，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合，形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質。

（3）加酶標抗體：使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關。

（4）加底物：夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產物。根據顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。

根據同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結合物，即可用雙抗原夾心法測定標本中的抗體。

（二）雙位點一步法

在雙抗體夾心法測定抗原時，如應用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標抗體，則在測定時可使標本的加入和酶標抗體的加入兩步並作一步（圖15-5）。這種雙位點一步不但簡化了操作，縮短了反應時間，如應用高親和力的單克隆抗體，測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應用使測定抗原的ELISA提高到新水平。

在一步法測定中，應注意鉤狀效應（hookeffect），類同於沉澱反應中抗原過剩的後帶現象。當標本中待測抗原濃度相當高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成夾心復合物，所得結果將低於實際含量。鉤狀效應嚴重時甚至可出現假陰性結果。

（三）間接法測抗體

間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標記的抗抗體以檢測已與固相結合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：

（1）將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌除去未結合的抗原及雜質。

（2）加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經洗滌後，固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質由於不能與固相抗原結合，在洗滌過程中被洗去。

（3）加酶標抗抗體：與固相復合物中的抗體結合，從而使該抗體間接地標記上酶。洗滌後，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測人對某種疾病的抗體，可用酶標羊抗人IgG抗體。

（4）加底物顯色：顏色深度代表標本中受檢抗體的量。

本法只要更換不同的固相抗原，可以用一種酶標抗抗體檢測各種與抗原相應的抗體。

（四）競爭法

競爭法可用於測定抗原，也可用於測定抗體。以測定抗原為例，受檢抗原和酶標抗原競爭與固相抗體結合，因此結合於固相的酶標抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下：

（1）將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體。洗滌。

（2）待測管中加受檢標本和一定量酶標抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應。如受檢標本中無抗原，則酶標抗原能順利地與固相抗體結合。如受檢標本中含有抗原，則與酶標抗原以同樣的機會與固相抗體結合，競爭性地佔去了酶標抗原與固相載體結合的機會，使酶標抗原與固相載體的結合量減少。參考管中只加酶標抗原，保溫後，酶標抗原與固相抗體的結合可達最充分的量。洗滌。 （3）加底物顯色：參考管中由於結合的酶標抗原最多，故顏色最深。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差，代表受檢標本抗原的量。待測管顏色越淡，表示標本中抗原含量越多。

（五）捕獲法測IgM抗體

血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在，後者會干擾IgM抗體的測定。因此測定IgM抗本多用捕獲法，先將所有血清IgM（包括異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上，在去除IgG後再測定特異性IgM。操作步驟如下：

（1）將抗人IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗人IgM。洗滌。

（2）加入稀釋的血清標本：保溫反應後血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質成分。

（3）加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結合。洗滌。

（4）加入針對特異性的酶標抗體：使之與結合在固相上的抗原反應結合。洗滌。

（5）加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標本中的特異性IgM抗體存在，是為陽性反應。

（六）應用親和素和生物素的ELISA

親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每個分子由4個亞基組成，可以和4個生物素分子親密結合。現在使用更多的是從鏈黴菌中提取的鏈霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又稱維生素H，分子量244.31，存在於蛋黃中。用化學方法製成的衍生物，生物素－羥基琥珀亞胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可與蛋白質、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產物。親和素與生物素的結合，雖不屬免疫反應，但特異性強，親和力大，兩者一經結合就極為穩定。由於1個親和素分子有4個生物素分子的結合位置，可以連接更多的生物素化的分子，形成一種類似晶格的復合體。因此把親和素和生物素與ELIS偶聯起來，就可大提高ELISA的敏感度。

親和素－生物素系統在ELISA中的應用有多種形式，可用於間接包被，亦可用於終反應放大。可以在固相上先預包被親和素，原用吸附法包被固相的抗體或抗原與生物素結合，通過親和素－生物素反應而使生物素化的抗體或抗在相化。這種包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量，而且使其結合點充分暴露。另外，在常規ELISA中的酶標抗體也可用生物素化的抗體替代，然後連接親和素－酶結合物，以放大反應信號。

㈨ 簡要說明影響酶促反應的因素有哪些，如何影響的

1.溫度：酶促反應在一定溫度范圍內反應速度隨溫度的升高而加快；但當溫度升高到一定限度時，酶促反應速度不僅不再加快反而隨著溫度的升高而下降。在一定條件下，每一種酶在某一定溫度時活力最大，這個溫度稱為這種酶的最適溫度。
2.酸鹼度：每一種酶只能在一定限度的pH范圍內才表現活性，超過這個范圍酶就會失去活性。
3.酶濃度：在底物足夠，其它條件固定的條件下，反應系統中不含有抑制酶活性的物質及其它不利於酶發揮作用的因素時，酶促反應的速度與酶濃度成正比。
4.底物濃度：在底物濃度較低時，反應速度隨底物濃度增加而加快，反應速度與底物濃度近乎：成正比，在底物濃度較高時，底物濃度增加，反應速度也隨之加快，但不顯著；當底物濃度很大且達到一定限度時，反應速度就達到一個最大值，此時即使再增加底物濃度，反應也幾乎不再改變。
5.抑制劑：能特異性的抑制酶活性,從而抑制酶促反應的物質稱為抑制劑。
6.激活劑：能使酶從無活性到有活性或使酶活性提高的物質稱為酶的激活劑.

㈩ 影響酶作用的因素

酶的催化活性的強弱以單位時間（每分）內底物減少量或產物生成量來表示。研究某一因素對酶促反應速率的影響時，應在保持其他因素不變的情況下，單獨改變研究的因素。影響酶促反應的因素常有：酶的濃度、底物濃度、pH值、溫度、抑制劑、激活劑等。其變化規律有以下特點。（1）酶濃度對酶促反應的影響在底物足夠，其他條件固定的條件下，反應系統中不含有抑制酶活性的物質及其他不利於酶發揮作用的因素時，酶促反應的速率與酶濃度成正比。（2）底物濃度對酶促反應的影響在底物濃度較低時，反應速率隨底物濃度增加而加快，反應速率與底物濃度近乎成正比；在底物濃度較高時，底物濃度增加，反應速率也隨之加快，但不顯著；當底物濃度很大，且達到一定限度時，反應速率就達到一個最大值，此時即使再增加底物濃度，反應速率幾乎不再改變。（3）pH對酶促反應的影響每一種酶只能在一定限度的pH范圍內才表現活性，超過這個范圍酶就會失去活性。在一定條件下，每一種酶在某一個pH時活力最大，這個pH稱為這種酶的最適pH。（4）溫度對酶促反應的影響酶促反應在一定溫度范圍內反應速率隨溫度的升高而加快；但當溫度升高到一定限度時，酶促反應速率不僅不再加快反而隨著溫度的升高而下降。在一定條件下，每一種酶在某一溫度時活力最大，這個溫度稱為這種酶的最適溫度。（5）激活劑對酶促反應的影響激活劑可以提高酶活性，但不是酶活性所必需的。激活劑大致分兩類：無機離子和小分子化合物。（6）抑制劑對酶促反應的影響抑制劑使酶活性下降，但不使酶變性。抑制劑作用機制分兩種：可逆的抑製作用和不可逆的抑製作用。