誘導基因沉默的方法有哪些

『壹』 核糖核酸(RNA)干擾機制

MicroRNA在人體發育過程中起著意想不到的作用。

法國科學家稱核糖核酸沉默機制（RNA silencing）能夠抵抗人體中的病毒，不可思議的是，小RNA (miRNA)竟然是組成這一機制的基礎。

「科學家一直認為miRNA與調節內源基因有關，而小分子干擾核糖核酸（iRNA）能夠控制外源基因，尤其是病毒RNA基因，」該文的主要作者、來自法國斯特拉斯堡的植物分子生物學院的查利斯·亨利·萊西利亞在《科學》雜志上說道。

科學家們先前的研究顯示，核糖核酸干擾（RNAi）能夠消滅植物以及昆蟲體內的病毒，但目前還沒有研究表明它在脊椎動物也擁有類似功能。自從科學家們發現RNA沉默機制能夠壓抑內生反轉錄病毒，使其無法在植物、酵母、蚯蚓以及蒼蠅等等體內游動，萊西利亞和他的同事就推斷哺乳動物體內的外源病毒基因的反轉錄移位功能應當也是同樣脆弱。因此他們選擇了一種原始的1型泡沫病毒（PFV-1）——一種與人體免疫缺損病毒（HIV）同類的逆轉錄酶病毒——作為實驗的模擬系統。

由於P19沉默干擾基因的表達，PFV-1病毒在人工「人體胚胎腎臟細胞株」（human embryonic kidney cells）中聚集並且變得十分明顯。這意味著，由於P19細胞控制著siRNA和miRNA，而且這兩種核糖核酸的路徑也控制著PFV-1在人體細胞中的繁殖。

為了確定人體RNA沉默機制的具體作用，研究者們將PFV-1病毒所含有的病毒基因序列與一種附有報告基因綠色熒光蛋白（GFP）鏈接在一起，然後使它們與人體胚胎腎臟細胞一起染上病毒。報告顯示，F11架構中的綠色熒光蛋白與F11mRNA聚集中所含有的綠色熒光蛋白比例完全不同。這一點使研究者們想到了miRNA轉錄抑制。利用DIANA-microT運演算法則計算後發現F11序列與人體miR-32具有高度的相似性。

進一步的研究表明，miR-32沉默受到P19表達細胞的壓抑。同樣，受抗miR-32細胞控制的核酸低聚核苷酸使子代病毒的繁殖量增加了一倍，並不是像抗miR-32細胞所起的作用一樣。這意味著miR-32起著直接反病毒作用。

植物與昆蟲中，所有的核糖核酸干擾（RNAi）能夠消滅的病毒都含有可以抑制核糖核酸沉默的蛋白質。而在後來的研究結果顯示，PFV-1中含有一種叫做Tas的病毒反激活蛋白。

一種叫做「阿拉伯芥」的植物中，轉基因Tas能夠大量減少siRNAs，並且使干擾基因引發的細胞產生發育變異現象，同時干擾miRNA的功能，例如植物葉子變長、長出鋸齒等。這意味著Tas具有抑制miRNA 和siRNA某種基本功能的作用，而這種功能是植物與哺乳動物共同擁有的。

類似Tas的另一種蛋白質，AC2，其中含有植物基因病毒，也是一種病毒反激活蛋白，同樣能夠壓抑RNA沉默機制。

目前，研究者們認為每種類型的細胞都有自己獨有的miRNA細胞庫。萊西利亞說：「這樣的概念能夠部分解答一些有關病毒反應方面的問題。」他認為，在細胞種類中，優先繁殖的病毒是處在抗病毒miRNAs沒有表現的地方，或者表現並不明顯的地方。

MiRNA的反應也會導致基因准種群出現，如果病毒能夠快速使其基因組發生變異，例如HIV與流感病毒，它就能避免受到miRNA沉默機制的影響。「基因准種群的出現對於躲避抗病毒功能的影響是十分重要的，因此研究這種miRNA反應也十分重要，」 萊西利亞說。

這一研究小組並沒有發現人類細胞能夠利用siRNA來消滅病毒。「所以研究哺乳動物是用還具有利用siRNA來對付病毒的能力是一個十分有趣的課題，因為與蚯蚓、蒼蠅這些昆蟲相比，哺乳動物擁有更加先進的免疫系統，」麻省理工大學的飛利浦·賽摩說。他並沒有參加這次研究活動。雖然miRNAs是否是抗病毒反應的原因之一，或者只是偶然對病毒核糖核酸起到了沉默作用，但是他認為：「不論miRNAs的表達是否會抑制病毒傳染，這項研究都會引起科學界的廣泛關注。」

美國加州大學的丁守維（音譯）稱，未來的研究方向可能會包括測試幾百個人體microRNAs對諸如HIV病毒和流感病毒等病毒的反應，他也未參加此次研究。他說：「他們已經在細胞培養室做了試驗，如果在動物身上做相關實驗的話會引起科學界更大的關注。」

英文原文鏈接參見：http://www.biomedcentral.com/news/20050422/01

法國研究人員發現，哺乳動物細胞能關閉入侵的病毒。當病毒感染細胞後，它把自己的基因插入細胞的基因組，這樣在細胞復制時也產生許多的病毒拷貝。研究人員已經知道植物和昆蟲用RNA干擾使病毒基因沉默，在這個過程中，小的RNA分子將自己插入到基因表達機器中使某個基因沉默。動物也將RNA干擾用在一個調節功能上：它們在發育過程中通過RNA干擾改變自己基因的表達。Charles Henri Lecellier和同事現在發現，人類細胞也用RNA干擾來阻礙一個侵襲哺乳類的病毒的積累。
核糖核酸干擾技術

轉錄後基因沉默（PTGS， post- transcriptional gene silencing）-最初被認為僅限於矮牽牛花和其它一些植物中的奇異現象，是目前分子生物學研究中一個最熱門的話題。過去幾年中，科研工作者已明確轉錄後基因沉默現象普遍存在於動、植物中，在機體防禦病毒入侵和轉座子沉默效應中起著重要作用。但是最激動人心的是轉錄後基因沉默現象的技術應用，即在多種有機體中應用核糖核酸干擾（RNA interfere ,RNAi）技術進行特異性的基因剔除以研究相應的基因功能。那麼核糖核酸干擾現象是如何被發現？它是怎樣工作的？科研工作者怎樣把它應用到功能基因組學的研究中呢？

10多年前，Rich Jorgensan和他的同事在矮牽牛花中發現一種奇怪的現象。他們嘗試把由一強有力啟動子控制的基因pigment-proing導入矮牽牛花以加深花的紫色，結果不但顏色未加深，許多花呈現雜色甚至白色。Rich Jorgensan把這種現象稱為"共抑制"，因為外源性導入基因和內源性具有相似功能基因的表達都被抑制了。當時人們不知道這是一種轉錄後基因沉默。

雙鏈核糖核酸能導致轉錄後基因沉默首先來自於對線蟲的研究。1995年Guo和Kewphues試圖用反義核糖核酸來阻斷Par-1基因的表達以研究其功能。確實反義核糖核酸抑制了基因表達，出乎意料的是用作陰性對照的正義核糖核酸也抑制了基因表達。該結果一直讓人迷惑不解，直至三年後Fire和Mello進行了另一實驗才真正提出雙鏈核糖核酸能導致轉錄後基因沉默的理論。Fire和Mello發現把反義核糖核酸和正義核糖核酸的混合物導入線蟲後，其抑制效應遠遠強於單獨導入反義核糖核酸或正義核糖核酸的抑制效應。再後來Baulcomb和Hamilton首先發現是~25nt的核糖核酸能特異性抑制具有相應互補序列的基因表達。

那麼核糖核酸干擾（RNAi）是怎樣工作的呢？首先外源導入的雙鏈核糖核酸(dsRNA)被切割為21~23nt的小分子干擾核糖核酸(siRNA)。Dicer, 作為特異性核糖核酸酶家族的一個成員，切割雙鏈核糖核酸為19~23nt小分子干擾核糖核酸（siRNA），這是一個依賴ATP的耗能過程. 切割後的 siRNA具有3'兩個核苷酸TT突出末端。然後siRNA結合到核糖核酸酶復合物上形成RNA誘導的基因沉默復合體（RISC，RNA-inced silencing complex）。該復合體依賴ATP釋能而解聚siRNA雙鏈成單鏈以激活RISC。活化的RISC通過由siRNA決定的鹼基互補配對原理切割具有同源序列的基因轉錄體，最終導致基因沉默效應。目前具體的切割機制還不明了，研究表明每個RISC包括單鏈siRNA和核糖核酸酶RNase。.

由於RNAi強大的基因沉默效應，有人提出了RNAi通路的效應擴增問題。RNAi通路的效應擴增可能是通過細胞復制外源導入的dsRNA或siRNA本身而實現的。另外，RISC的多次反復使用也能擴增RNAi的基因沉默效應。

科研工作者已開始RNAi效應增強子和效應抑制子的研究，認為RNAi是機體細胞一種強有力的基因調控機制。但是在哺乳細胞中外源導入大分子dsRNA（>30nt）常常導致非特異性的基因沉默效應，因為它激活了核糖核酸酶RNaseL而導致非特異性的RNA降解。相反，siRNA（<30nt）不激活RNaseL，而是通過序列特異性的方式誘導基因沉默效應。該序列特異性方式非常嚴格，一個鹼基的錯配會顯著降低基因沉默效應。所以siRNA可以解釋如下，它是一種具有3'兩個核苷酸TT突出末端的21~23nt大小的雙鏈核糖核酸，作為RNAi的中介分子，通過序列互補配對法則特異性降解目的基因。

siRNA可以經化學合成，比如著名生物學公司Proligo、Orbigen在siRNA合成方面處於世界領先水平，它們既提供即用型siRNA，也提供標記生物素、熒光素和磷酸等的siRNA更方便監測其抑制特異基因表達的效果

siRNA也可以通過體外轉錄獲取。它相對便宜，尤其適合於同時合成多個siRNA。雖然理論上說，任何一個具有3'兩個核苷酸TT突出末端的19~23nt小分子干擾核糖核酸 siRNA都具備序列特異性的基因沉默效應，但是由於位置效應，比如某些序列，尤其是調控序列易被蛋白質附著而阻止RISC的抑制效應，所以科研工作者首先合成2~4個siRNA進行預實驗以選定作用最佳者。RNA專家Ambion公司提供通過體外轉錄獲取siRNA的商品化試劑盒，使這一選擇過程簡單方便。

目前外源注射和轉染是轉運siRNA到細胞或機體的主要途經，之後基因沉默效應可以持續數天，同時傳至下一代細胞，但終將短時間內消失，因此，最近許多科研小組開發了siRNA的表達質粒，通過瞬時轉染或穩定轉染以達到在細胞內不斷表達siRNA的目的。有些質粒是表達小發夾結構RNAs（shRNAs, small hairpin RNAs）, 在細胞內它被加工處理為siRNA樣分子，誘導基因沉默。該質粒是在polyMeraseⅢ啟動子和4~5個鹼基T轉錄終止信號中插入shRAN。由於polyMeraseⅢ的特性，轉錄常常在第二個T終止，插入序列折疊成step-loop結構並帶有3'-UU突出末端。該質粒設計是基於線蟲、果蠅等中的實驗結果，因為其中的基因沉默效應就是通過step-loop而誘導。另外一種siRNA表達質粒是把編碼正義和反義的siRNA分別受控於各自的polyMeraseⅢ啟動子。兩種質粒的基因沉默效應相當。Invivogen公司和Imgenex公司都有操作簡單、作用有效的商品化試劑盒提供。而Gene Therapy System 公司的siRNA構建試劑盒則完全採用了不同的機制。該試劑盒首先PCR合成目標序列，然後由T7RNA多聚酶進行體外轉錄，經退火和純化處理的體外轉錄dsRNA模板被重組的Dicer酶切割，從而快速、高效地產生大量小分子干擾RNA（siRNAs）。產生的siRNAs混合物，比單一形式的siRNA更可能導致基因表達沉默。

基於目前的發表文獻和一些實驗經驗，siRNA的設計可遵循以下幾點進行1）選擇以鹼基A或G開始的19~21nt大小的目的mRNA。因為RNA polyMeraseⅢ啟動子只有在第一個轉錄鹼基是嘌呤時才能有效作用。2）針對目的mRNA一般選擇2~4個不同序列，GC含量為30~50%，避免四個鹼基T或A的連續序列，避免選擇起始密碼下游50~100nt、終止密碼上游100nt以及5'和3'的非編碼區域，BLAST檢查設計序列的特異性。3）設計適當的實驗對照，比如設計有1~2個鹼基錯配的序列，或者是隨機變更siRNA的鹼基排列順序。

RNAi的研究颳起了科學界的風暴，siRNA迅速有效抑制特異基因功能的性質促使科研工作者不斷深入完善該領域的研究。RNAi可能是未來發展基因治療策略的新希望所在。RNAi技術必將帶來功能基因組學的革命。

『貳』 什麼是基因沉默技術

基因沉寂（Gene Silencing) 也可以被稱為「基因沉默」，基因沉寂是真核生物細胞基因表達調節的一種重要手段，指的是真核生物中由雙鏈RNA誘導的識別和清除細胞非正常RNA的一種機制。

研究表明，「基因沉寂」 與「異染色質」 存在差異，盡管被沉寂的基因區段也呈高濃縮狀態，但「基因沉寂」 所形成的染色體構象並不完全等同於"異染色質「構象。

除此之外，兩者還存在著基因表達調控程度上的差異，一般認為處於"基因沉寂「 的染色質區的基因表達被」徹底「關閉，而」異染色質「 狀態的基因可能依然進行低水平的表達（轉錄）。

(2)誘導基因沉默的方法有哪些擴展閱讀

基因沉默是基因表達調控的一種重要方式

基因表達調控主要表現在以下幾個方面：轉錄水平上的調控；mRNA加工、成熟水平上的調控；翻譯水平上的調控；

基因表達調控的指揮系統有很多種，不同生物使用不同的信號來指揮基因調控。原核生物和真核生物之間存在著相當大差異。

原核生物中，營養狀況、環境因素對基因表達起著十分重要的作用；而真核生物尤其是高等真核生物中，激素水平、發育階段等是基因表達調控的主要手段，營養和環境因素的影響則為次要因素。

基因表達的調控可在多個層次上進行，包括基因水平、轉錄水平、轉錄後水平、翻譯水平和翻譯後水平的調控。基因表達調控是生物體內細胞分化、形態發生和個體發育的分子基礎。

『叄』 基因敲出，基因沉默的方法有哪些

基因敲除是指利用各種手段使某個基因不再表達，常見的方法是在基因的轉錄區插入一段外源DNA序列，從而破壞該基因的表達；RNA干擾是指一類小RNA可以與目的基因配對結合，從而使正常的基因表達受到干擾；基因沉默是指位於有些基因座的基因其表達不活躍甚至不表達的現象。

『肆』 抑制基因的方法有哪些20分

VIGS 病毒誘導的基因沉默。
原理都是一樣的，只不過是利用病毒誘導的RNA干擾。病毒做為載體（插入你靶基因的片段）去侵染寄主，引起靶基因沉默。

『伍』 當前流行的基因敲除技術有哪些

RNA干擾（RNAi）、反義嗎啉環寡核苷酸（Morpholino）、CRISPR-Cas9技術等技術。

RNAi是最為常見的一種誘發基因沉默的技術，最早是在研究秀麗新小桿線蟲反義RNA（antisense RNA）的過程中發現，由dsRNA介導的同源RNA降解的過程。RNAi是針對轉錄後水平的基因沉默，具有很高的效率與特異性，在植物和各種細胞中得到十分廣泛的應用。

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『陸』 基因沉默的主要方法和機制是什麼

DNA的一條鏈是用來翻譯成RNA並進一步表達成相關的蛋白質。但DNA的另一條鏈也可以翻譯成RNA，並與原來的RNA相結合，從而阻斷了RNA轉錄的過程，從而使基因不能表達成蛋白質。所以表現為基因沉默

『柒』 dsRNA會引起基因沉默的機制是什麼，轉基因和這個有關系嗎

dsRNA是英語Double-stranded RNA的縮寫，是指雙鏈核糖核酸。

RNA干擾機制：

1、是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發的、同源mRNA高效特異性降解的現象。

2、病毒基因、人工轉入基因、轉座子等外源性基因隨機整合到宿主細胞基因組內，並利用宿主細胞進行轉錄時，常產生一些dsRNA。宿主細胞對這些dsRNA迅即產生反應，其胞質中的核酸內切酶Dicer將dsRNA切割成多個具有特定長度和結構的小片段RNA，即siRNA。

2、特異性：Elbashir等和Brummel kamp等發現在21～23個鹼基對中有1～2個鹼基錯配會大大降低對靶mRNA的降解效果。

3、競爭效應：Hoten等將10 nmol/L和30 nmol/L的hTF167i相比，兩者的沉默基因效果無差異，但將20 nmol/L基因抑制效果很差的PSK314i和10 nmol/L的hTF167i相混和後，hTF167i產生的抑制效果明顯降低。

『捌』 什麼是基因干擾,列舉基因干擾的主要方法以及原理

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基因干擾=RNA干擾（RNA interference，縮寫為RNAi）是指一種分子生物學上由雙鏈RNA誘發的基因沉默現象，其機制是通過阻礙特定基因的轉錄或翻譯來抑制基因表達。當細胞中導入與內源性mRNA編碼區同源的雙鏈RNA時，該mRNA發生降解而導致基因表達沉默。

由於RNAi具有高度的序列專一性，可以特異地沉默基因，從而獲得基因功能喪失或基因表達量的降低。因此可以作為功能基因組學研究的一種強有力的工具。在實際應用中，通過病毒載體表達小核RNA（snRNA）進行RNAi已經非常成熟，能夠有效、快捷和持久地干擾體內基因的表達。廣泛應用到基因功能研究，葯物靶點篩選，細胞信號傳導通路分析和疾病治療等方向。

應用范圍

1.基因功能研究：RNAi具有高效特異性抑制基因表達的特點，運用病毒載體介導shRNA干擾可以調控基因表達，進而研究基因功能；
2.信號通路研究：可以運用該技術進行體內體外相關信號通路及作用機制的研究；
3.構建疾病模型：通過病毒載體介導shRNA干擾可構建轉基因抑制小鼠模型；
4.基因治療：RNAi被用於基因表達異常升高引起的疾病，如：腫瘤和病毒感染等；
5.葯物開發：利用RNAi特異性高效地抑制基因的表達，獲得基因功能抑製表型，進而大規模地篩選出基因靶點，從而實現短時間內葯靶在細胞水平和動物水平的篩選和評定。

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『玖』 trv1和trv2兩個載體區別

trv1包括編碼rna依賴的rna聚合酶、運動蛋白和16kd蛋白的基因，是vigs體系的輔助病毒載體。trv2包括衣殼蛋白(cp)基因、多克隆位點(mcs)等，用於插入目的基因。

煙草脆裂病毒（tobaccorattlevirus，TRV），是一類應用比較廣泛而且效率和持久性較好的病毒載體，能夠介導基因沉默同時不會帶來病毒誘導的症狀。

改造後的病毒能夠促進非病毒序列的插入以及對植物的後續感染，也可以鑒定宿主植物生長點的基因，因此TRV在植物基因功能鑒定中具有廣泛的應用。

一種玉米整株TRV載體介導病毒誘導基因沉默方法：

TRV-RNA1是由兩個復制酶（134 kDa，194 kDa），運動蛋白（MP）和富含半胱氨酸的蛋白（16 kDa）組成。

TRV-RNA2是由外殼蛋白（CP），與29.4kDa蛋白和32.8 kDa蛋白組成。