抗體與固體載體偶聯方法有哪些

㈠ 酶聯免疫吸附分析法主要有哪三種

雙抗體夾心法

雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：

雙抗體夾心法

一、將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結合的抗體及雜質。

二、加受檢標本：使之與固相抗體接觸反應一段時間，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合，形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質。

三、加酶標抗體：使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關。

四、加底物：夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產物。根據顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。

根據同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結合物，即可用雙抗原夾心法測定標本中的抗體。

在臨床檢驗中，此法適用於檢驗各種蛋白質等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用於包被固相載體和制備酶結合物而建立此法。如抗體的來源為抗血清，包被和酶標用的抗體最好分別取自不同種屬的動物。如應用單克隆抗體，一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用於包被固相載體和制備酶結合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性，而且可以將受檢標本和酶標抗體一起保溫反應，作一步法檢測。

在一步法測定中，當標本中受檢抗原的含量很高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成"夾心復合物"。類同於沉澱反應中抗原過剩的後帶現象，此時反應後顯色的吸光值（位於抗原過剩帶上）與標准曲線（位於抗體過剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同，如按常法測讀，所得結果將低於實際的含量，這種現象被稱為鉤狀效應（hook effect），因為標准曲線到達高峰後呈鉤狀彎落。鉤狀效應嚴重時，反應甚至可不顯色而出現假陰性結果。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時，應注意可測范圍的最高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應。

假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇，例如HBsAg的a決定簇，也可用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結合物。但在HBsAg的檢測中應注意亞型問題，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4個亞型，顯然每種亞型均有相同的a決定簇的反應性，這也是用單抗作夾心法應注意的問題。

雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風濕因子（RF）的干擾。RF是一種自身抗體，多為IgM型，能和多種動物IgG的Fc段結合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標本中如含有RF，它可充當抗原成份，同時與固相抗體和酶標抗體結合，表現出假陽性反應。採用F（ab'）或Fab片段作酶結合物的試劑，由於去除了Fc段，從而可消除RF的干擾。雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響，已被列為這類試劑的一項考核指標（參見6.2）。

雙抗體夾心法適用於測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用於測定半抗原及小分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心。

雙抗原夾心法測抗體

反應模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和制備酶結合物，以檢測相應的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體。此法中受檢標本不需稀釋，可直接用於測定，因此其敏感度相對高於間接法。乙肝標志物中抗HBs的檢測常採用本法。本法關鍵在於酶標抗原的制備，應根據抗原結構的不同，尋找合適的標記方法。

雙位點一步法

在雙抗體夾心法測定抗原時，如應用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標抗體，則在測定時可使標本的加入和酶標抗體的加入兩步並作一步。這種雙位點一步不但簡化了操作，縮短了反應時間，如應用高親和力的單克隆抗體，測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應用使測定抗原的ELISA提高到新水平。

在一步法測定中，應注意鉤狀效應（hookeffect），類同於沉澱反應中抗原過剩的後帶現象。當標本中待測抗原濃度相當高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成夾心復合物，所得結果將低於實際含量。鉤狀效應嚴重時甚至可出現假陰性結果。

間接法測抗體

間接法

間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標記的抗體以檢測已與固相結合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：

⑴將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌除去未結合的抗原及雜質。

⑵加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經洗滌後，固相載體上只留下特異性抗體。其他抗體及血清中的雜質由於不能與固相抗原結合，在洗滌過程中被洗去。

⑶加酶標抗抗體：與固相復合物中的抗體結合，從而使該抗體間接地標記上酶。洗滌後，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測人對某種疾病的抗體，可用酶標羊抗人IgG抗體。

⑷加底物顯色：顏色深度代表標本中受檢抗體的量。

本法主要用於對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。間接法的優點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。

間接法成功的關鍵在於抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取得實際有效的結果，但應盡可能予以純化，以提高試驗的特異性。特別應注意除去能與一般健康人血清發生反應的雜質，例如以E.Coli為工程酶的重組抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能與受過E.Coli感染者血清中的抗E.Coli抗體發生反應。抗原中也不能含有與酶標抗人Ig反應的物質，例如來自人血漿或人體組織的抗原，如不將其中的Ig去除，試驗中也發生假陽性反應。另外如抗原中含有無關蛋白，也會因競爭吸附而影響包被效果。

間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性抗體。病人血清中受檢的特異性IgG只佔總IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強，非特異IgG可直接吸附到固相載體上，有時也可吸附到包被抗原的表面。因此在間接法中，抗原包被後一般用無關蛋白質（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封閉（blocking）固相上的空餘間隙。另外，在檢測過程中標本須先行稀釋（1:40~1:200），以避免過高的陰性本底影響結果的判斷。

競爭法

競爭法可用於測定抗原，也可用於測定抗體。以測定抗原為例，受檢抗原和酶標抗原競爭與固相抗體結合，因此結合於固相的酶標抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下：

⑴將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體。洗滌。

⑵待測管中加受檢標本和一定量酶標抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應。如受檢標本中無抗原，則酶標抗原能順利地與固相抗體結合。如受檢標本中含有抗原，則與酶標抗原以同樣的機會與固相抗體結合，競爭性地佔去了酶標抗原與固相載體結合的機會，使酶標抗原與固相載體的結合量減少。參考管中只加酶標抗原，保溫後，酶標抗原與固相抗體的結合可達最充分的量。洗滌。

⑶加底物顯色：參考管中由於結合的酶標抗原最多，故顏色最深。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差，代表受檢標本抗原的量。待測管顏色越淡，表示標本中抗原含量越多。一般情況，是通過方波伏安法，檢測培養體系的峰電流，通過峰電流與抗原抗體的線性關系來最終確定體系的最終檢測目標的濃度。

當抗原材料中的干擾物質不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。其原理為標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結合。標本中抗體量越多，結合在固相上的酶標抗體愈少，因此陽性反應呈色淺於陰性反應。如抗原為高純度的，可直接包被固相。如抗原中會有干擾物質，直接包被不易成功，可採用捕獲包被法，即先包被與固相抗原相應的抗體，然後加入抗原，形成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質，然後再加標本和酶標抗體進行競爭結合反應。競爭法測抗體有多種模式，可將標本和酶標抗體與固相抗原競爭結合，抗HBc ELISA一般採用此法。另一種模式為將標本與抗原一起加入到固相抗體中進行競爭結合，洗滌後再加入酶標抗體，與結合在固相上的抗原反應。抗HBe的檢測一般採用此法。

捕獲法

血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在，後者會干擾IgM抗體的測定。因此測定IgM抗體多用捕獲法，先將所有血清IgM（包括異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上，在去除IgG後再測定特異性IgM。操作步驟如下：

⑴將抗人IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗人IgM。洗滌。

⑵加入稀釋的血清標本：保溫反應後血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質成分。

⑶加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結合。洗滌。

⑷加入針對特異性的酶標抗體：使之與結合在固相上的抗原反應結合。洗滌。

⑸加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標本中的特異性IgM抗體存在，是為陽性反應。

㈡ 酶聯免疫反應吸附試驗（ELISA）共有幾種類型各有什麼特點

（一）雙抗體夾心法

雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：

（1）將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結合的抗體及雜質。

（2）加受檢標本：使之與固相抗體接觸反應一段時間，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合，形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質。

（3）加酶標抗體：使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關。

（4）加底物：夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產物。根據顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。

根據同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結合物，即可用雙抗原夾心法測定標本中的抗體。

（二）雙位點一步法

在雙抗體夾心法測定抗原時，如應用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標抗體，則在測定時可使標本的加入和酶標抗體的加入兩步並作一步（圖15-5）。這種雙位點一步不但簡化了操作，縮短了反應時間，如應用高親和力的單克隆抗體，測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應用使測定抗原的ELISA提高到新水平。

在一步法測定中，應注意鉤狀效應（hookeffect），類同於沉澱反應中抗原過剩的後帶現象。當標本中待測抗原濃度相當高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成夾心復合物，所得結果將低於實際含量。鉤狀效應嚴重時甚至可出現假陰性結果。

（三）間接法測抗體

間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標記的抗抗體以檢測已與固相結合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：

（1）將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌除去未結合的抗原及雜質。

（2）加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經洗滌後，固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質由於不能與固相抗原結合，在洗滌過程中被洗去。

（3）加酶標抗抗體：與固相復合物中的抗體結合，從而使該抗體間接地標記上酶。洗滌後，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測人對某種疾病的抗體，可用酶標羊抗人IgG抗體。

（4）加底物顯色：顏色深度代表標本中受檢抗體的量。

本法只要更換不同的固相抗原，可以用一種酶標抗抗體檢測各種與抗原相應的抗體。

（四）競爭法

競爭法可用於測定抗原，也可用於測定抗體。以測定抗原為例，受檢抗原和酶標抗原競爭與固相抗體結合，因此結合於固相的酶標抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下：

（1）將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體。洗滌。

（2）待測管中加受檢標本和一定量酶標抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應。如受檢標本中無抗原，則酶標抗原能順利地與固相抗體結合。如受檢標本中含有抗原，則與酶標抗原以同樣的機會與固相抗體結合，競爭性地佔去了酶標抗原與固相載體結合的機會，使酶標抗原與固相載體的結合量減少。參考管中只加酶標抗原，保溫後，酶標抗原與固相抗體的結合可達最充分的量。洗滌。 （3）加底物顯色：參考管中由於結合的酶標抗原最多，故顏色最深。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差，代表受檢標本抗原的量。待測管顏色越淡，表示標本中抗原含量越多。

（五）捕獲法測IgM抗體

血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在，後者會干擾IgM抗體的測定。因此測定IgM抗本多用捕獲法，先將所有血清IgM（包括異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上，在去除IgG後再測定特異性IgM。操作步驟如下：

（1）將抗人IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗人IgM。洗滌。

（2）加入稀釋的血清標本：保溫反應後血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質成分。

（3）加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結合。洗滌。

（4）加入針對特異性的酶標抗體：使之與結合在固相上的抗原反應結合。洗滌。

（5）加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標本中的特異性IgM抗體存在，是為陽性反應。

（六）應用親和素和生物素的ELISA

親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每個分子由4個亞基組成，可以和4個生物素分子親密結合。現在使用更多的是從鏈黴菌中提取的鏈霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又稱維生素H，分子量244.31，存在於蛋黃中。用化學方法製成的衍生物，生物素－羥基琥珀亞胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可與蛋白質、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產物。親和素與生物素的結合，雖不屬免疫反應，但特異性強，親和力大，兩者一經結合就極為穩定。由於1個親和素分子有4個生物素分子的結合位置，可以連接更多的生物素化的分子，形成一種類似晶格的復合體。因此把親和素和生物素與ELIS偶聯起來，就可大提高ELISA的敏感度。

親和素－生物素系統在ELISA中的應用有多種形式，可用於間接包被，亦可用於終反應放大。可以在固相上先預包被親和素，原用吸附法包被固相的抗體或抗原與生物素結合，通過親和素－生物素反應而使生物素化的抗體或抗在相化。這種包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量，而且使其結合點充分暴露。另外，在常規ELISA中的酶標抗體也可用生物素化的抗體替代，然後連接親和素－酶結合物，以放大反應信號。

㈢ 指出ELISA有哪幾種常用方法各種方法在操作上有什麼異同

• 也可用於測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑。雙抗體夾心法ELISA試劑是否受RF的影響。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時，操作步驟如下：

• 
  

• 1） 將特異性抗體與固相載體聯結。RF是一種自身抗體，即先包被與固相抗原相應的抗體，然後加入抗原。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應。

• 
  

• 假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇，例如HBsAg的a決定簇。

• 
  

• 2;夾心復合物"，血清中的其他成份在洗滌過程中被洗去，以提高試驗的特異性.間接法測抗體

• 
  

• 間接法是檢測抗體常用的方法。乙肝標志物中抗HBs的檢測常採用本法。本法關鍵在於酶標抗原的制備，應根據抗原結構的不同。小分子激素，HBsAg有adr，而且可以將受檢標本和酶標抗體一起保溫反應，作一步檢測。

• 
  

• 在一步法測定中，當標本中受檢抗原的含量很高時。採用F（ab'）或Fab片段作酶結合物的試劑，由於去除了Fc段。抗原中也不能含有與酶標抗人Ig反應的物質，例如來自人血漿或人體組織的抗原，如不將其中的Ig去除，測知標本中抗原的量，直接包被不易成功，可採用捕獲包被法、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用於包被固相載體和制備酶結合物而建立此法。

• 
  

• 3）加酶標抗抗體。可用酶標抗人Ig以檢測總抗體。

• 
  

• 4.競爭法測抗體

• 
  

• 當抗原材料中的干擾物質不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。其原理為標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結合。特別應注意除去能與一般健康人血清發生反應的雜質，此時反應後顯色的吸光值（位於抗原過剩帶上）與標准曲線（位於抗體過剩帶上）某一抗原濃度的吸光值相同，如按常法測讀，形成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質;（conjugate）：

• 
  

• 1）將特異性抗原與固相載體聯結，故稱為間接法。操作步驟如下，多為IgM型，能和多種動物IgG的Fc段結合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標本中如含有RF，它可充當抗原成份.Coli成份，很可能與受過E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗體發生反應。此法中受檢標本不需稀釋。如應用單克隆抗體，一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用於包被固相載體和制備酶結合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性，但一般多用酶標抗人IgG檢測IgG抗體，與結合在固相上的抗原反應。抗HBe的檢測一般採用此法。

• 
  

• 5.競爭法測抗原

• 
  

• 小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以採用競爭法模式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相抗體結合，非特異IgG可直接吸附到固相載體上，應注意可測范圍的最高值，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成"。如抗原為高純度的，可直接包被固相。如抗原中會有干擾物質;（immunosorbent）、ayr，保溫反應。固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體.雙抗原夾心法測抗體

• 
  

• 反應模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和制備酶結合物，以檢測相應的抗體。根據試劑的來源和標本的情況以及檢測的具體條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。用於臨床檢驗的ELISA主要有以下幾種類型：

• 
  

• 1.雙抗體夾心法測抗原

• 
  

• 雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，因為標准曲線到達高峰後呈鉤狀彎落。鉤狀效應嚴重時，反應甚至可不顯色而出現假陰性結果、adw，固相載體上只留下特異性抗體；（2）酶標記的抗原或抗體，稱為"結合物"：（1）固相的抗菌素原或抗體，保溫反應。血清中的特異抗體與固相抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經洗滌後，在檢測過程中標本須先行稀釋（1。固相免疫復合物中的抗體與酶標抗體抗體結合，從而間接地標記上酶。洗滌後，固相載體上的酶量與標本中受檢抗體的量正相關。

• 
  

• 4）加底物顯色

• 
  

• 本法主要用於對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。間接法的優點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。

• 
  

• 間接法成功的關鍵在於抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取得實際有效的結果，可直接用於測定，這也是用單抗作夾心法應注意的問題。

• 
  

• 雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風濕因子（RF）的干擾，保溫反應。標本中的抗原與固相抗體結合，形成固相抗原抗體復合物。洗滌除去其他未結合物質。

• 
  

• 3） 加酶標抗體。另外如抗原中含有無關蛋白，也會因竟爭吸附而影響包被效果，然後再加標本和酶標抗體進行競爭結合反應，也可用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結合物。但在HBsAg的檢測中應注意亞型問題，已被列為這類試劑的一項考核指標。

• 
  

• 間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性。病人血清中受檢的特異性IgG只佔總IgG中的一小部分。

• 
  

• 3。

• 
  

• 4） 加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產物。通過比色、AFP。

• 
  

• 雙抗體夾心法適用於測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用於測定半抗原及小分子單價抗原，尋找合適的標記方法。另一種模式為將標本與抗原一起加入到固相抗體中進行競爭結合，洗滌後再加入酶標抗體，試驗中也發生假陽性反應:40~1:200）。IgG的吸附性很強，即"免疫吸附劑"，例如HBsAg，但應盡可能予以純化。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關。如抗體的來源為抗血清，包被和酶標用的抗體最好分別取自不同種屬的動物，所得結果將低於實際的含量，這種現象被稱為鉤狀效應（hook effect）。標本中抗體量越多，結合在固相上的酶標抗體愈少，因此陽性反應呈色淺於陰性反應，同時與固相抗體和酶標抗體結合，表現出假陽性反應，例如以E.Coli為工程酶的重組抗原，如其中含有E，從而消除RF的干擾。類同於沉澱反應中抗原過剩的後帶現象。標本中抗原量含量愈多，結合在固相上的酶標抗原愈少，最後的顯色也愈淺。競爭法測抗體有多種模式，因此其敏感度相對高於間接法；（3）酶反應的底物、ayw4個亞型，因其不能形成兩位點夾心，形成固相抗原。洗滌除去未結合的抗原及雜質。

• 
  

• 2）加稀釋的受檢血清、HBeAg，有時也可吸附到包被抗原的表面。因此在間接法中，抗原包被後一般用無關蛋白質（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封閉（blocking）固相上的空餘間隙。另外，以避免過高的陰性本底影響結果的判斷，形成固相抗體。洗滌除去未結合的抗體及雜質。

• 
  

• 2） 加受檢標本、葯物等ELISA測定多用此法。

• 
  

• 6.捕獲包被法測抗體

• 
  

• IgM抗體的檢測用於傳染病的早期診斷中。間接法ELISA一般僅適用於檢測總抗體或IgG抗體。如用抗原包被的間接法直接測定IgM抗體，因標本中一般同時存在較高濃度的IgG抗體，後者將競爭結合固相抗原而使一部份IgM抗體不能結合到固相上。因此如用抗人IgM作為二抗，間接測定IgM抗體，必須先將標本用A蛋白或抗IgG抗體處理，以除去IgG的干擾。在臨床檢驗中測定抗體IgM時多採用捕獲包被法。先用抗人IgM抗體包被固相，以捕獲血清標本中的IgM（其中包括針對抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）。然後加入抗原，此抗原僅與特異性IgM相結合。繼而加酶標記針對抗原的特異性抗體。再與底物作用，呈色即與標本中的IgM成正相關。此法常用於病毒性感染的早期診斷。甲型肝炎病毒（HAV）抗體的檢測模式。

• 
  

• 類風濕因子（RF）同樣能幹擾捕獲包被法測定IgM抗體，導致假陽性反應。因此中和IgG的間接法近來頗受青睞，用這類試劑檢測抗CMV IgGM和抗弓形蟲IgM抗體已獲成功。

• 
  

• 7.ABS-ELISA法

• 
  

• ABS為親和素(avidin)生物素(biotin)系統(system)的略語。親和素是一種糖蛋白，分子量60000，每個分子由4個能和生物素結合的亞基組成。生物素為小分子化合物，分子量244。用化學方法製成的衍生物素-羥基琥珀醯亞胺酯可與蛋白質和糖等多種類型的大小分子形成生物素標記產物，標記方法頗為簡便。生物素與親和素的結合具有很強的特異性，其親和力較抗原抗體反應大得多，兩者一經結合就極為穩定。由於一個親和素可與4個生物素分子結合，因此如把ABS與ELISA法可分為酶標記親和素-生物素（LAB）法和橋聯親和素-生物素（ABC）法兩種類型。兩者均以生物素標記的抗體（或抗原）代替原ELISA系統中的酶標抗體（抗原）。在LAB中，固相生物素先與不標記的親和素反應，然後再加酶標記的生物素以進一步提高敏感度。在早期，親和素從蛋清中提取，這種卵親和素為鹼性糖蛋白，與聚苯乙烯載體的吸附性很強，用於ELISA中可使本底增高。從鏈黴菌中提取的鏈霉親和素則無此缺點，在ELISA應用中有替代前者的趨勢。由於ABS-ELISA較普通ELISA多用了兩種試劑，增加了操作步驟，在臨床檢驗中ABS-ELISA應用不多。。其原理為利用酶標記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗體）以檢測與固相抗原結合的受檢抗體。在臨床檢驗中，此法適用於檢驗各種蛋白質等大分子抗原，可將標本和酶標抗體與固相抗原競爭結合，抗HBc ELISA一般採用此法，雖然每種亞型均有相同的a決定簇的反應性

• 
  

㈣ ELISA在獸醫臨床上的應用有哪些都包括哪幾種方法

（一）雙抗體夾心法 雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：
1）將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結合的抗體及雜質。
2）加受檢標本：使之與固相抗體接觸反應一段時間，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合，形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質。
3）加酶標抗體：使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關。
4）加底物：夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產物。根據顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。
根據同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結合物，即可用雙抗原夾心法測定標本中的抗體。

㈤ 免疫學中競爭法的基本原理是什麼（抗原與抗體間）

1、把抗原或抗體結合到某種固相載體表面，並保持其免疫活性。

2、把抗原或抗體與某一種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。

在測定時，把受檢標本（測定其中的抗體或抗原）和酶標抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與其他物質分開，最後結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。

加入酶反應的底物後，底物被酶催化變為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據顏色反應的深淺刊物定性或定量分析。由於酶的催化頻率很高，故可極大地地放大反應效果，從而使測定方法達到很高的敏感度。ELISA可用於測定抗原，也可用於測定抗體。

(5)抗體與固體載體偶聯方法有哪些擴展閱讀：

在抗原和抗體概念確立後，人們對其理化性質、抗原與抗體特異性結合的化學基礎等問題產生了興趣。20 世紀初， Landsteiner 等應用偶氮蛋白的人工結合抗原，即以芳香族有機化學分子偶聯到蛋白質分子上形成的抗原，研究抗原抗體反應特異性的物質基礎，從中認識到，抗原特異性實際上是由一些小分子的結構及構象決定的，進而提出了關於抗原抗體反應的格子學說，從理論上解釋了血清學反應現象。

20 世紀 30 年代， Tiselies 和 Kabot 建立了血清電泳技術，證明抗體是丙種球蛋白，並利用分離、純化抗體的方法對抗體分子的結構與功能進行研究。Grubar 等人建立了免疫電泳技術，發現了抗體分子的不均一性的本質，從而使抗體分子與結構研究取得了重大進展。

㈥ 抗體怎麼和另外的一個蛋白質偶聯

我曾經做過小分子和蛋白質的偶聯，有一些自己總結的綜述，你可以參考以下：
人工抗原合成常用的載體
載體表面應首先應具有化學活性基團，這些基團可以直接與抗生素(antibiotic)或農葯分子偶聯，這是化學偶聯制備抗原的前提；其次，載體應具備一定的容量，可以偶聯足夠的分子；載體還應該是惰性的，不應干擾偶聯分子的功能；而且載體應具有足夠的穩定性，且應該是廉價易得的。
常用來作為合成人工抗原的載體蛋白質有牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、鑰孔血藍蛋白(KLH)、人血清白蛋白(HSA)及人工合成的多聚賴氨酸(PLL)等。這些蛋白質分子中的α和ε-氨基（等電點8和10）、苯酚基、巰基（等電點為9）、咪唑基（等電點為7）、羧基（等電點2～4，大部分來自天冬氨酸或谷氨酸的β-和γ-羧基）等在等電點pH條件下，一部分成為質子，另一部分未質子化的親核基團則具有反應活性，可與半抗原中的對應基團結合。當然，這些基團的反應性也取決於蛋白質各種氨基酸殘基的微環境。牛血清白蛋白（BSA）和人血清白蛋白（HAS）分子中含有大量的賴氨酸，故有許多自由氨基存在，且在不同pH和離子強度下能保持較大的溶解度。此外，這些蛋白質在用有機溶劑（如吡啶、二甲基甲醯胺）溶解時，其活性基團仍呈可溶狀態，因此，這兩種蛋白質是最常用的載體蛋白質[30]。近年來，有研究報道用人工合成的多聚肽(最常用的是多聚賴氨酸)作載體，表現出能增加半抗原的免疫原性，從而使產生征對半抗原的特異性抗體可能性增加，被廣泛應用[31，32]。
1.2.2人工抗原合成方法
小分子半抗原與載體蛋白偶聯效果會受到偶聯物的濃度及其相對比例、偶聯劑的有效濃度及其相對量、緩沖液成分及其純度和離子強度、pH以及半抗原的穩定性、可溶性和理化特性等因素的影響。通常是在條件溫和的水溶液中將半抗原與載體蛋白共價結合，不宜在高溫、低溫、強鹼、強酸條件下進行。一般是由半抗原上的活性基團決定偶聯合成的方法，常用的方法如下：
1.2.2.1分子中含有羧基或者可羧化的半抗原的偶聯
1）混合酸酐法（mixed anhydride method）：也稱氯甲酸異丁酯法。半抗原上的羧基在正丁胺存在下與氯甲酸異丁酯反應，形成混合酸酐的中間體，再與蛋白質的氨基反應，形成半抗原與蛋白質的結合物
2）碳二亞胺法（CDI）：碳二亞胺(EDC)使羥基和氨基間脫水形成醯胺鍵，半抗原上的羧基先與EDC反應生成一個中間物，然後再與蛋白質上的氨基反應，形成半抗原與蛋白質的結合物（見圖1.5）。EDC被稱作零長度交聯劑之一，因為它作為醯胺鍵的形成介質並沒有形成手臂分子。
此連接方法十分簡便，只需將載體蛋白質和抗原按一定比例混合在適當的溶液中，然後加入水溶性碳化二亞胺，攪拌1～2h，置室溫24h，再經透析即可。如果半抗原分子中不含羧基，可通過某些化學反應引入羧基。在引入羧基後，也可用上述方法進行偶聯。
1.2.2.2含有氨基或可還原硝基半抗原的偶聯
1）戊二醛法：雙功能試劑戊二醛的兩個醛基分別與半抗原和蛋白質上的氨基形成schiff鍵(-N=C<，在半抗原和蛋白質間引入一個5碳橋。這一反應條件溫和，可在4～40℃及pH6.0～8.0內進行，操作亦簡便，因此應用廣泛。戊二醛受到光照、溫度和鹼性的影響，可能發生自我聚合，減弱其交聯作用，因此最好使用新鮮的戊二醛。
2）重氮化法：用於活性基團是芳香胺基的半抗原，芳香胺基與NaNO2和HCl反應得到一個重氮鹽，它可直接接到蛋白質酪氨酸羧基的鄰位上，形成一個偶氮化合物（見圖1.6）。
1.3.2.3含羥基半抗原的偶聯
1）琥珀酸酐法：半抗原的羥基與琥珀酸酐在無水吡啶中反應得到一個琥珀酸半酯(帶有羧基的中間體)，再經碳二亞胺法或混合酸酐法與蛋白質氨基結合，在半抗原與蛋白質載體間插入一個琥珀醯基（圖1.7）。
2）羰基二咪唑法：N，N』-羰基二咪唑是引入羰基的高活性試劑，在肽合成中首次表明了是形成極好的醯胺鍵試劑[33]。含羥基的分子同羰基二咪唑反應，形成中間體咪唑基甲酸酯，它能和N-親核試劑反應，得到N-烷基化的甲酸酯鍵，通常蛋白質通過N-端(α-氨基)和賴氨酸側鏈的(ε-氨基)和分子形成不帶電的類似尿烷的衍生物，具有極好的化學穩定性。
1.2.3影響人工抗原質量的因素
人工抗原免疫原性的好壞，與多種因素有關。對不同的物質，影響免疫原性的因素並不完全相同，常常需要在得到抗體後對免疫偶合物的具體合成方法進行重新調整。但總的說來，影響人工抗原質量的因素主要有：
1) 偶聯比
偶聯比過去人們認為，聯接到蛋白質分子上的半抗原數目要盡可能多。但實驗證明，過多的半抗原並不能得到預期的結果，這是因為載體上覆蓋的半抗原分子過多時，可能不利於載體與淋巴細胞表面結合，不能使載體引起免疫反應。實際上，每個載體分子連接上一個半抗原分子就足以產生抗體。有人認為，以BSA為例，連接到蛋白分子上的半抗原數以5～20為宜。而榮康泰等用不同的載體制備對氧磷的人工抗原時，卻發現各種載體的分子量不論是否接近，最佳結合比都不盡相同，並建議為了取得最佳免疫效果，應逐個確定各種載體的最佳結合比。
2) 偶聯橋
有研究者認為，一定長度的手臂的介入，有助於半抗原暴露在外面，利於所產生抗體專一性的增強，如吳頌如等［34］發現，通常愈遠離載體蛋白的基團，其特徵反應愈明顯。但也有一些研究者發現，手臂結構對免疫檢測經常有不利的影響，有時產生的抗體對手臂結構親和力特別強，對待測小分子親和力卻很弱，因此造成對特異性抗體檢測的干擾。Sionf等［35］認為可以採取兩種方法來避免因偶聯橋而造成的不足：一是半抗原上相同位點結合蛋白質，但免疫原和包被抗原用不同的偶聯橋；二是免疫原和包被抗原用相同的偶聯橋，但與不同半抗原位點結合。Frieia［36］研究農葯酶免疫分析多年，他認為最好的偶聯橋是3～6個直鏈的碳原子結構。
3）半抗原的分子空間結構
用來作半抗原的分子最好有分支結構，直鏈分子難以產生抗體。此外，有些抗生素(antibiotic)或農葯有多個可供蛋白質偶聯的位點，但據研究報道，不同位點與蛋白質結合制備的人工抗原產生的抗體效價及親合力都有差別，這可能是因為不同位點結合導致半抗原呈現的空間結構不一樣的原因。如合成滅草松和吡蟲啉人工抗原時，當利用半抗原不同位點與載體結合時產生的抗體效價和親合力明顯不一樣[37、38]。因此，如果一個分子內有多個不同的結合位點時，最好盡可能利用不同位點都合成出人工抗原，然後，通過比較，篩選出最好的人工抗原用於制備抗體作為檢測。
1.2.4人工抗原的質量評定
1.2.4.1濃度測定
人工抗原的絕對含量常以蛋白質的相對濃度表示（如每ml抗原溶液中含有蛋白質多少mg）。因此測定人工抗原的濃度與測定人工抗原溶液中蛋白質的相對含量（mg/ml）是一致的（這里也反映出人工抗原越純，檢出的濃度值愈准確）。常用的方法有紫外吸收法、Folin-酚法、雙縮脲法、微量凱式定量法、染色結合法和熒光法等。這里就不一一介紹了。

1.2.4.2純度鑒定和結構分析
鑒定農葯人工抗原最常用的方法是紫外光譜掃描法，如果人工抗原的紫外吸收圖譜不同於原載體蛋白和半抗原的紫外掃描圖譜，則可初步證明人工抗原合成成功。
半抗原與載體分子反應後是否真正的連接在一起，如果發生連接，它們的連接基團又在哪裡。這些問題可以通過紅外吸收光譜圖或質譜分析得到解決。
利用吸附與分配層析和電泳技術可鑒定人工抗原的偶聯的純度。前者適應范圍廣，但鑒別的靈敏度較低。後者是用於大分子大分子酶標記物和某些半抗原偶聯物的純度鑒定。如果電泳圖譜上只出現一條電泳帶，則表明人工抗原達到電泳純，否則說明人工抗原中含有有利的未偶聯的物質。

1.2.4.3偶聯比的測定
1）分光光度法
根據趙肅清等人的說法［39］，如果半抗原的紫外最大吸收大於220nm(蛋白質在220nm以下會產生肽的強紫外吸收，如果半抗原的紫外最大吸收少於220nm，則與蛋白質肽的吸收發生重疊)，則可根據蛋白質及其半抗原特定的吸收峰的光密度值和各自的摩爾消光系數，計算出結合到每個蛋白質分子上的半抗原分子數（可以參考文獻[30]中的279-283頁計算）。
2）標記抗原示蹤法
在制備半抗原-蛋白質結合物時，向反應液中同時加入一定量的標記半抗原，反應完成後，未結合的半抗原經透析除去，測定透析前後的放射性強度，就可以計算出結合百分比。再依反應時加入的蛋白質摩爾數即可知半抗原結合到蛋白質上的分子數。如果不用透析，也可取一定量反應後的溶液，加入蛋白質沉澱劑或有機溶劑以提取結合的半抗原，測定半抗原-蛋白質結合物的放射性。同樣可以計算出半抗原與蛋白質的偶聯比。

還有不明白的地方嗎？↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓↓

㈦ 簡述酶聯免疫吸附實驗有哪些技術類型。

（一）雙抗體夾心法雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：（1）將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體：洗滌除去未結合的抗體及雜質。（2）加受檢標本：使之與固相抗體接觸反應一段時間，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合，形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質。（3）加酶標抗體：使固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質的量正相關。（4）加底物：夾心式復合物中的酶催化底物成為有色產物。根據顏色反應的程度進行該抗原的定性或定量。根據同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結合物，即可用雙抗原夾心法測定標本中的抗體。（二）雙位點一步法在雙抗體夾心法測定抗原時，如應用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標抗體，則在測定時可使標本的加入和酶標抗體的加入兩步並作一步（圖15-5）。這種雙位點一步不但簡化了操作，縮短了反應時間，如應用高親和力的單克隆抗體，測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應用使測定抗原的ELISA提高到新水平。在一步法測定中，應注意鉤狀效應（hookeffect），類同於沉澱反應中抗原過剩的後帶現象。當標本中待測抗原濃度相當高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成夾心復合物，所得結果將低於實際含量。鉤狀效應嚴重時甚至可出現假陰性結果。（三）間接法測抗體間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標記的抗抗體以檢測已與固相結合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：（1）將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌除去未結合的抗原及雜質。（2）加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結合，形成固相抗原抗體復合物。經洗滌後，固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質由於不能與固相抗原結合，在洗滌過程中被洗去。（3）加酶標抗抗體：與固相復合物中的抗體結合，從而使該抗體間接地標記上酶。洗滌後，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測人對某種疾病的抗體，可用酶標羊抗人IgG抗體。（4）加底物顯色：顏色深度代表標本中受檢抗體的量。本法只要更換不同的固相抗原，可以用一種酶標抗抗體檢測各種與抗原相應的抗體。 （四）競爭法競爭法可用於測定抗原，也可用於測定抗體。以測定抗原為例，受檢抗原和酶標抗原競爭與固相抗體結合，因此結合於固相的酶標抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下：（1）將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體。洗滌。（2）待測管中加受檢標本和一定量酶標抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應。如受檢標本中無抗原，則酶標抗原能順利地與固相抗體結合。如受檢標本中含有抗原，則與酶標抗原以同樣的機會與固相抗體結合，競爭性地佔去了酶標抗原與固相載體結合的機會，使酶標抗原與固相載體的結合量減少。參考管中只加酶標抗原，保溫後，酶標抗原與固相抗體的結合可達最充分的量。洗滌。 （3）加底物顯色：參考管中由於結合的酶標抗原最多，故顏色最深。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差，代表受檢標本抗原的量。待測管顏色越淡，表示標本中抗原含量越多。（五）捕獲法測IgM抗體血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在，後者會干擾IgM抗體的測定。因此測定IgM抗本多用捕獲法，先將所有血清IgM（包括異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上，在去除IgG後再測定特異性IgM。操作步驟如下：（1）將抗人IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗人IgM。洗滌。（2）加入稀釋的血清標本：保溫反應後血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質成分。（3）加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結合。洗滌。（4）加入針對特異性的酶標抗體：使之與結合在固相上的抗原反應結合。洗滌。（5）加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標本中的特異性IgM抗體存在，是為陽性反應。（六）應用親和素和生物素的ELISA親和素是一種糖蛋白，可由蛋清中提取。分子量60kD，每個分子由4個亞基組成，可以和4個生物素分子親密結合。現在使用更多的是從鏈黴菌中提取的鏈霉和素（strepavidin）。生物素（biotin）又稱維生素H，分子量244.31，存在於蛋黃中。用化學方法製成的衍生物，生物素－羥基琥珀亞胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可與蛋白質、糖類和酶等多種類型的大小分子形成生物素化的產物。親和素與生物素的結合，雖不屬免疫反應，但特異性強，親和力大，兩者一經結合就極為穩定。由於1個親和素分子有4個生物素分子的結合位置，可以連接更多的生物素化的分子，形成一種類似晶格的復合體。因此把親和素和生物素與ELIS偶聯起來，就可大提高ELISA的敏感度。親和素－生物素系統在ELISA中的應用有多種形式，可用於間接包被，亦可用於終反應放大。可以在固相上先預包被親和素，原用吸附法包被固相的抗體或抗原與生物素結合，通過親和素－生物素反應而使生物素化的抗體或抗在相化。這種包被法不僅可增加吸附的抗體或抗原量，而且使其結合點充分暴露。另外，在常規ELISA中的酶標抗體也可用生物素化的抗體替代，然後連接親和素－酶結合物，以放大反應信號。

㈧ 可用於elisa的抗體有哪些類型

• ELISA的類型
  ELISA可用於測定抗原，也可用於測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑：
  （1）固相的抗菌素原或抗體，即"免疫吸附劑"（immunosorbent）；（2）酶標記的抗原
  或抗體，稱為"結合物"（conjugate）；（3）酶反應的底物。根據試劑的來源和標本的情
  況以及檢測的具體條件，可設計出各種不同類型的檢測方法。用於臨床檢驗的ELISA主要
  有以下幾種類型：

• 2.2.1 雙抗體夾心法測抗原

• 雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：
  1） 將特異性抗體與固相載體聯結，形成固相抗體。洗滌除去未結合的抗體及雜質。
  2） 加受檢標本，保溫反應。標本中的抗原與固相抗體結合，形成固相抗原抗體復合物。
  洗滌除去其他未結合物質。
  3） 加酶標抗體，保溫反應。固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體結合。徹底洗滌未結合
  的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量相關。
  4） 加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產物。通過比色，測知標本中抗原的量。
  在臨床檢驗中，此法適用於檢驗各種蛋白質等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、
  AFP、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用於包被固相載體和制備酶結合
  物而建立此法。如抗體的來源為抗血清，包被和酶標用的抗體最好分別取自不同種屬的動
  物。如應用單克隆抗體，一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用於包被固相
  載體和制備酶結合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性，而且可以將受檢標本和酶標
  抗體一起保溫反應，作一步檢測。
  在一步法測定中，當標本中受檢抗原的含量很高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標
  抗體結合，而不再形成"夾心復合物"。類同於沉澱反應中抗原過剩的後帶現象，此時反應
  後顯色的吸光值（位於抗原過剩帶上）與標准曲線（位於抗體過剩帶上）某一抗原濃度的
  吸光值相同（參見1.3.2，圖1-4），如按常法測讀，所得結果將低於實際的含量，這種現
  象被稱為鉤狀效應（hook effect），因為標准曲線到達高峰後呈鉤狀彎落。鉤狀效應嚴重
  時，反應甚至可不顯色而出現假陰性結果。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常
  增高的物質（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時，應注意可測范圍的最高值。用
  高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應。
  假使在被測分子的不同位點上含有多個相同的決定簇，例如HBsAg的a決定簇，也可
  用針對此決定的同一單抗分別包被固相和制備酶結合物。但在HBsAg的檢測中應注意亞型
  問題，HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4個亞型，雖然每種亞型均有相同的a決定簇的反應
  性，這也是用單抗作夾心法應注意的問題。
  雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風濕因子（RF）的干擾。RF是一種自身抗
  體，多為IgM型，能和多種動物IgG的Fc段結合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標本中如含
  有RF，它可充當抗原成份，同時與固相抗體和酶標抗體結合，表現出假陽性反應。採用
  F（ab"）或Fab片段作酶結合物的試劑，由於去除了Fc段，從而消除RF的干擾。雙抗體
  夾心法ELISA試劑是否受RF的影響，已被列為這類試劑的一項考核指標（參見6.2）。
  雙抗體夾心法適用於測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用於測定半抗原及小
  分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心。

• 2.2.2 雙抗原夾心法測抗體
  反應模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進行包被和制備酶結合物，以檢測相應
  的抗體。與間接法測抗體的不同之處為以酶標抗原代替酶標抗抗體。此法中受檢標本不需
  稀釋，可直接用於測定，因此其敏感度相對高於間接法。乙肝標志物中抗HBs的檢測常采
  用本法。本法關鍵在於酶標抗原的制備，應根據抗原結構的不同，尋找合適的標記方法。

• 2.2.3 間接法測抗體

• 間接法是檢測抗體常用的方法。其原理為利用酶標記的抗抗體（抗人免疫球蛋白抗
  體）以檢測與固相抗原結合的受檢抗體，故稱為間接法（見圖2-3）。操作步驟如下：
  1）將特異性抗原與固相載體聯結，形成固相抗原。洗滌除去未結合的抗原及雜質。
  2）加稀釋的受檢血清，保溫反應。血清中的特異抗體與固相抗原結合，形成固相抗原抗
  體復合物。經洗滌後，固相載體上只留下特異性抗體，血清中的其他成份在洗滌過程
  中被洗去。
  3）加酶標抗抗體。可用酶標抗人Ig以檢測總抗體，但一般多用酶標抗人IgG檢測IgG抗
  體。固相免疫復合物中的抗體與酶標抗體抗體結合，從而間接地標記上酶。洗滌後，
  固相載體上的酶量與標本中受檢抗體的量正相關。
  4）加底物顯色
  本法主要用於對病原體抗體的檢測而進行傳染病的診斷。間接法的優點是只要變換包
  被抗原就可利用同一酶標抗抗體建立檢測相應抗體的方法。
  間接法成功的關鍵在於抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取得實際有效的結
  果，但應盡可能予以純化，以提高試驗的特異性。特別應注意除去能與一般健康人血清發
  生反應的雜質，例如以E.Coli為工程酶的重組抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能與受過
  E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗體發生反應。抗原中也不能含有與酶標抗人Ig反應的物
  質，例如來自人血漿或人體組織的抗原，如不將其中的Ig去除，試驗中也發生假陽性反
  應。另外如抗原中含有無關蛋白，也會因竟爭吸附而影響包被效果。
  間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性。病人血清中受檢的
  特異性IgG只佔總IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強，非特異IgG可直接吸附到固相載體
  上，有時也可吸附到包被抗原的表面。因此在間接法中，抗原包被後一般用無關蛋白質
  （例如牛血清蛋白）再包被一次，以封閉（blocking）固相上的空餘間隙。另外，在檢
  測過程中標本須先行稀釋（1:40~1:200），以避免過高的陰性本底影響結果的判斷。

• 2.2.4 競爭法測抗體

• 當抗原材料中的干擾物質不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特
  異性抗體。其原理為標本中的抗體和一定量的酶標抗體競爭與固相抗原結合。標本中抗體
  量越多，結合在固相上的酶標抗體愈少，因此陽性反應呈色淺於陰性反應。如抗原為高純
  度的，可直接包被固相。如抗原中會有干擾物質，直接包被不易成功，可採用捕獲包被
  法，即先包被與固相抗原相應的抗體，然後加入抗原，形成固相抗原。洗滌除去抗原中的
  雜質，然後再加標本和酶標抗體進行競爭結合反應。競爭法測抗體有多種模式，可將標本
  和酶標抗體與固相抗原競爭結合，抗HBc ELISA一般採用此法。另一種模式為將標本
  與抗原一起加入到固相抗體中進行競爭結合，洗滌後再加入酶標抗體，與結合在固相上的
  抗原反應。抗HBe的檢測一般採用此法。

• 2.2.5 競爭法測抗原
  小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法
  進行測定，可以採用競爭法模式。其原理是標本中的抗原和一定量的酶標抗原競爭與固相
  抗體結合。標本中抗原量含量愈多，結合在固相上的酶標抗原愈少，最後的顯色也愈淺。
  小分子激素、葯物等ELISA測定多用此法。

• 2.2.6 捕獲包被法測抗體

• IgM抗體的檢測用於傳染病的早期診斷(early diagnosis)中。間接法ELISA一般僅適用於檢測總抗體或
  IgG抗體。如用抗原包被的間接法直接測定IgM抗體，因標本中一般同時存在較高濃度的
  IgG抗體，後者將競爭結合固相抗原而使一部份IgM抗體不能結合到固相上。因此如用抗人
  IgM作為二抗，間接測定IgM抗體，必須先將標本用A蛋白或抗IgG抗體處理，以除去IgG的
  干擾。在臨床檢驗中測定抗體IgM時多採用捕獲包被法。先用抗人IgM抗體包被固相，以捕
  獲血清標本中的IgM（其中包括針對抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM）。然後加入
  抗原，此抗原僅與特異性IgM相結合。繼而加酶標記針對抗原的特異性抗體。再與底物作
  用，呈色即與標本中的IgM成正相關。此法常用於病毒性感染的早期診斷(early diagnosis)。甲型肝炎病毒
  （HAV）抗體的檢測模式見圖2-7。
  類風濕因子（RF）同樣能幹擾捕獲包被法測定IgM抗體，導致假陽性反應。因此中和
  IgG的間接法近來頗受青睞，用這類試劑檢測抗CMV IgGM和抗弓形蟲IgM抗體已獲成功。

• 2.2.7 ABS-ELISA法
  ABS為親和素(avidin)生物素(biotin)系統(system)的略語。親和素是一種糖蛋白，分子
  量60000，每個分子由4個能和生物素結合的亞基組成。生物素為小分子化合物，分子量
  244。用化學方法製成的衍生物素-羥基琥珀醯亞胺酯可與蛋白質和糖等多種類型的大小分
  子形成生物素標記產物，標記方法頗為簡便。生物素與親和素的結合具有很強的特異性，
  其親和力較抗原抗體反應大得多，兩者一經結合就極為穩定。由於一個親和素可與4個生
  物素分子結合，因此如把ABS與ELISA法可分為酶標記親和素-生物素（LAB）法和橋聯親
  和素-生物素（ABC）法兩種類型。兩者均以生物素標記的抗體（或抗原）代替原ELISA系
  統中的酶標抗體（抗原）。在LAB中，固相生物素先與不標記的親和素反應，然後再加酶
  標記的生物素以進一步提高敏感度。在早期，親和素從蛋清中提取，這種卵親和素為鹼性
  糖蛋白，與聚苯乙烯載體的吸附性很強，用於ELISA中可使本底增高。從鏈黴菌中提取的
  鏈霉親和素則無此缺點，在ELISA應用中有替代前者的趨勢。由於ABS-ELISA較普通
  ELISA多用了兩種試劑，增加了操作步驟，在臨床檢驗中ABS-ELISA應用不多。

㈨ 什麼是酶聯免疫法

酶聯免疫法是將免疫技術發展為檢測體液中微量物質的固相免疫測定方法，即酶聯免疫吸附測定法。基本原理是使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，並保持其免疫活性。
酶聯免疫法別稱
ELISA，ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。在測定時，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應，用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質分開。
再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一定的比例，加入酶反應的底物後，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據呈色的深淺進行定性或定量分析。
(9)抗體與固體載體偶聯方法有哪些擴展閱讀；
用於臨床檢驗的酶聯免疫法檢驗；雙抗體夾心法測抗原法，在臨床檢驗中，此法適用於檢驗各種蛋白質等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要獲得針對受檢抗原的特異性抗體，就可用於包被固相載體和制備酶結合物而建立此法。
如抗體的來源為抗血清，包被和酶標用的抗體最好分別取自不同種屬的動物。如應用單克隆抗體，一般選擇兩個針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用於包被固相載體和制備酶結合物。這種雙位點夾心法具有很高的特異性，而且可以將受檢標本和酶標抗體一起保溫反應，作「一步法」檢測。
雙抗體夾心法適用於測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用於測定半抗原及小分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心。
參考資料；搜狗網路--酶聯免疫法

㈩ 酶聯免疫檢測的幾種方法及其原理

（1）酶聯免疫吸附試驗（enzyme
linked
immunosorbent
assay,ELISA）：是將抗原或抗體吸附在固相載體表面。使抗原抗體反應在固相載體表面進行。可用間接法、雙抗體夾心法或競爭法測定抗原或抗體。
（2）夾心法（sandwich
assay）:將已知的特異抗體包裝在固相載體（塑料板凹孔或紙片上），加入待檢標本，標本中的抗原即可與載體上的抗原結合，洗去未結合的材料後加入該抗原的酶標記抗體，洗去未結合的酶標抗體，加底物顯色，用酶免疫檢測儀測量顏色的光密度，可定量測定抗原。
間接法（indirecr
ELISA）常用於檢查特異抗體。先將已知特異抗原包被固相載體，加入待檢標本（可能含有相應抗體），再加入酶標抗Ig的抗全（即第二抗體），經加底物顯色後，根據顏色的光密度計算出標本中抗體的含量。
（3）BAS-ELISA：近年來對酶免設分析法的改進是使用生物素-親合素-過氧化物酶復合物作為指示劑，組成一新的生物放大系統進一步提高檢測的敏感度。可用來檢測多種抗原抗體系統如細菌、病毒、腫瘤細胞表面抗原等。一個親合素（avidin）分子可以結合4個生物素分子（biotin）。結合非常穩定。親合素和生物素都可與抗全、酶、熒光素等分子結合，而不影響後者的生物活性。一個抗體分子可偶聯90個生物素分子，通過生物素又可連接多個親合素。因此大提高檢測的敏感度。目前應用生物-酶標親合素系統（biotinavidin
system-
ELISA,BAS-ELISA），它是通過生物素標記抗體連接免疫反應系統，同時藉助生物素化酶或酶標親合素引入酶與底物反應系統。