1. 細胞方式有哪些
細胞式生產方式有:
(一)實行單件流(One-piece-flow)作業
要求產品在生產時一次一件完成整個流程,而完成的速率則由顧客的需求來決定。單件流作業有利於公司快速交貨給客戶,減少了存儲和傳輸需求,降低了貨物被損壞的風險。
但是單件流只是一種理想狀態,在實際生產中,不可能也沒有必要總在某一個時間只流一個產品。細胞式生產方式所關注的是流過整個流程的材料,力求以最少的延誤保證產品流的暢通。
(二)進行彈性生產
要求生產者將在同樣設備上,並以同樣流程製造的類似的產品歸為一組,同時努力減少進行機種轉換所需要的時間,建立便於各工序轉移的作業機制,以避免因為頻繁更換生產線花費過多時間而不能及時滿足客戶的不同需求。
(三)培養多能工
傳統大批量生產方式將復雜的生產工藝,分解成眾多的容易掌握的工序,每個工人只完成一個工序,而細胞式生產方式將生產線劃分為若干獨立的「細胞生產線」, 每個工人必須熟練掌握盡可能多的工序,以避免傳統生產方式由於作業不平衡、安排作業不當等在工序交接上花費大量等待時間的弊端。
細胞式生產方式要求工人從「零件人」轉變為「完整人」, 把藍領工人從傳統大批量生產方式中解放了出來。
(四)採用扁平化管理
細胞式生產方式要求企業改變以往金字塔式的管理體制,採用扁平化的管理方式,以使信息在傳遞過程中的損耗降低到最低,以便企業能根據市場形勢的變化隨時作出應變,制定相應的生產計劃並執行。
(五)開展TPM活動
TPM(Total Proctive Maintenance),也就是全面生產性維護,TPM活動要求企業全體員工做到自己的工廠自己管理、自己的設備自己維護,每個人都在TPM活動中有自己的角色。這種全體參與的形式有利於發揮設備的最大效能,保證持續生產,同時也能夠增強團隊的創造力和凝聚力,使企業充滿活力。
以上內容參考:網路-細胞式生產方式
2. 細胞模型製作方法
關於這種製作方法,可以考慮的方法有三:
方法一
首先,考慮一個真核細胞模型製作所需要的零件,即細胞各部分結構尤其是各種細胞器,包括細胞核、液泡、葉綠體等,材料我自然選取了硬紙卡,由於以前手工課剩下的紙卡不夠了,我就剪了一個餅干盒子作為細胞壁;接著做細胞核,為了使其富有立體感,我選擇了塑料泡沫,並用水彩顏料染上紫色;我認為做內質網的最好材料是紫色毛線,但是條件不允許,所以我選擇了塑料網,也染上了紫色;葉綠體和線粒體分別用彩色卡紙剪貼,也很逼真。最後的細胞膜頗費了一帆周折,用保鮮膜和膠帶貼好即可。
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【方法二】
用硬紙殼做細胞壁,並在內部貼了一層紙作為細胞膜,內部的細胞器,是仿照書上做的比較粗糙,由於細胞核是圓的,不方便做,我就找了一個小土豆,削皮後切掉1/4作為細胞核。主要設計思路是仿照書上的範例做的,由於紙卡比較硬,高爾基體和線粒體的嵴做得不是很像。
【方法三】
材料:各色彩色卡紙、白紙、青棗、橘皮(綠色)、米粒、透明塑料外殼、膠帶、剪刀、膠水等。
過程:
1、用彩色卡紙做線粒體、高爾基體、內質網、類囊體。
線粒體:用紅色彩紙剪一長條,圍起來用膠帶粘住作為外膜;再剪一長條,反復折疊後取開放在裡面作為內膜。
高爾基體:用粉色彩紙剪幾個長條圍成幾個圈粘好,用膠帶將它們固定。
內質網:用藍色彩紙剪一長條反復折疊,用膠帶固定成形。
類囊體:用綠色紙片剪若干小圓片,5-18個用膠水粘合疊在一起,組成基粒。
2、葉綠體:切1/5左右的橘皮,自然捲曲成為葉綠體的形狀,把做好的基粒放在其中。
3、細胞膜和細胞壁:用普通白紙折一個無蓋方盒作為細胞膜,用黑色卡紙折一個更大的無蓋方盒套在細胞膜外面作為細胞壁。
4、核糖體:將一些米粒粘在內質網上作為附著的核糖體,撒在細胞內一些米粒作為游離的核糖體。
5、細胞核:用一個青棗放在細胞內作為細胞核。
6、液泡:將一個塑料包裝盒稍加改造作為大液泡。
還有其他等等
3. 你認為植物細胞工程制葯技術由哪些方面的技術方法,闡述其技術原理與特點。
植物細胞工程制葯技術由哪些方面的技術方法,其技術原理與特點如下:
1、植物細胞工程的基本技術:植物組織培養技術、植物體細胞雜交技術、植物細胞的全能性。植物細胞工程指已經分化的細胞,仍具有發育成完整個體的潛能。
2、原因特點:生物體的任何一個細胞都包含有該物種所特有的全套遺傳物質,都有發育成為完整個體所必需的全部基因,從理論上講,生物體的每一個活細胞都應該具有全能性。
植物組織培養技術
植物組織培養愈傷組織是由一團排列疏鬆而無規則,高度液泡化的呈無定形狀態的薄壁細胞組成。薄壁組織細胞具有潛在的細胞分裂能力,在一定的外界因素刺激下可再生,使植物的創傷癒合或形成不定根、不定芽等。
這個培養必要條件是離體、一定的營養物質、激素、其他外界條件(無菌環境、一定的溫度、適合的PH、適時光照等),植物體細胞雜交定義是將不同的植物體細胞,在一定條件下融合成雜種細胞,並把雜種細胞培育成新的植物體的技術。
4. 制備細胞膜的方法
活動目標
1.體驗用哺乳動物紅細胞制備細胞膜的基本方法。
2.使用高倍顯微鏡觀察制備細胞膜過程中細胞的變化。
背景資料
生物膜的研究發展迅速。要研究生物膜的組成、結構及功能,首先必須分離出純凈的細胞膜。分離得到的哺乳動物的紅細胞膜,一般稱為「血影」。哺乳動物成熟的紅細胞中沒有一般真核細胞所具有的細胞核和細胞器,容易用它制備純凈的細胞膜。此外,哺乳動物的血液也比較容易獲得,因而是研究細胞膜的理想材料。
從哺乳動物的紅細胞中分離細胞膜,第一步是將血液收集在加有抗凝劑的容器內,用低速離心的方法從血液中分離出紅細胞,然後用等滲緩沖液反復洗滌,經多次離心,去除血漿。第二步是在紅細胞中加入低滲緩沖液,由於低滲溶液的作用,大量水分進入細胞,使紅細胞脹破而溶血。第三步是將溶血的紅細胞反復而充分地高速離心、洗滌,去除血紅蛋白和其他的細胞內含物,最終獲得比較純凈的紅細胞膜。
操作指南
1.材料 新鮮的哺乳動物血液
2.用具 離心機,離心管,滴管,顯微鏡,載玻片,蓋玻片,吸水紙,小燒杯。
3.試劑 檸檬酸鈉或肝素(抗凝劑),生理鹽水(質量分數為0.9%的NaCl溶液),蒸餾水或清水。
4.操作要點
教師在實驗前做以下准備工作。
准備一定量的新鮮的哺乳動物血液,如羊血或豬血,在冰箱中靜置一晝夜。用滴管將上清液吸去。再吸取1 mL的沉澱物,放入離心管中,加入生理鹽水2 mL,在2 000 r/min條件下離心5 min。去除上清液,在沉澱中再加入生理鹽水2 mL,再離心一次,去除上清液,留沉澱備用。以上操作的目的是洗去血漿成分,避免血漿對血細胞的緩沖作用,從而使紅細胞的溶血現象更加明顯。
學生的實驗操作如下。
(1)取一個5 mL的小燒杯,加入生理鹽水2~3 mL。
(2)用滴管在沉澱的下層吸取一小滴血細胞,滴入小燒杯的生理鹽水中,以達到稀釋紅細胞的目的,以免觀察時,由於細胞密度太大,影響觀察效果。
(3)取另一個滴管,在小燒杯中輕輕攪拌,然後吸取少量的血細胞稀釋液,在載玻片的中央滴很小的一滴,加蓋玻片。
(4)先在低倍鏡下觀察紅細胞的正常形態,可見其邊緣完整發亮。
(5)在蓋玻片的一側加一滴蒸餾水或清水,在另一側非常小心地用吸水紙慢慢地吸引,防止把紅細胞全部吸入吸水紙中而影響觀察。邊加水邊觀察,注意紅細胞的形態變化。紅細胞會隨著水流向一側漂移,觀察時注意移動玻片。紅細胞體積逐漸變大,變得非常鼓脹,在視野中可以找到少數脹破的紅細胞,它們已失去完整發亮的邊緣,變成彌散狀。
5.需要注意的幾個問題
(1)製作臨時裝片時,紅細胞必須稀釋,而且取紅細胞的量要少。
(2)在高倍鏡下觀察,待觀察清晰時,在蓋玻片的一側滴加蒸餾水,同時在另一側用吸水紙吸引。上述操作均在載物台上進行,並隨時調整鏡筒高度,持續觀察細胞的變化。在蓋玻片一側滴加蒸餾水的量要少,不能讓蓋玻片處於漂浮狀態;同時在另一側用吸水紙吸引時要小心,不要將血細胞吸走。
(3)要想取得好的觀察效果,所用顯微鏡的放大倍數應在400倍以上。
(4)操作中要認真觀察才能看到連續的變化過程。
1.分析實驗原理
5. 利用細胞的培養生產天然化合物的方法分為幾個步驟
植物的很多次生代謝產物(secondary:metabolism)是葯物、染料、香料、色素、糖類等的重要來源,只是這些天然產物的含量太低,難以滿足人類的需要,大規模人工合成又存在許多困難。
不過,在整體植物中存在的這類化合物,在培養細胞中也同樣存在,隨著細胞培養技術的發展,人們可以利用細胞大量培養技術來生產這些化合物。如從光下培養的胡蘿卜愈傷組織能分離出紫紅色、橙紅色、綠色、黃白四種愈傷組織株系,其中紫紅色愈傷組織能夠合成大量的花青苷,而胡蘿卜素含量少;中國從新疆紫草中篩選出高產細胞株系,其紫草色素含量比原植物根提高48倍,可作為輕工業原料;長春花細胞和愈傷組織培養物能合成數量較高的利血平和阿馬靈。
利用細胞大量培養生產天然化合物的方法大致包括三個步驟:一是高產細胞系的建立,包括從特定的植物材料誘導愈傷組織,從愈傷組織分離單細胞,細胞誘變和突變細胞的篩選,高產單細胞無性系的保存等;
二是「種子」培養,即對高產細胞系進行多次擴大繁殖,以便獲得足夠的培養細胞用做大量培養時的接種材料;
三是細胞大量培養,即用發酵罐或生物反應器進行細胞培養,以生產所需的植物化合物。需要說明的是,在進行植物細胞大量培養時,不能簡單地使用微生物發酵的設備和方法,必須根據植物細胞個體大、不易分散均勻、生產周期長等特點來設計生物反應器,並制定相應的操作程序。在生物反應器中,溫度、pH、傳導性、氣體濃度、泡沫形成等是可以自動控制的。
到目前為止,通過細胞大量培養能生產的次生代謝產物包括:生物鹼、類固醇、萜類化合物、醌類、生物活性物質(抗生物質、抗癌物質、抗病毒物質、酶阻害物質等)和酶類物質等。
6. 什麼叫細胞式生產模式
細胞式生產方式(Cell Proction),簡單說,就是自律分散型生產方式,它起源於20世紀60年代的日本。人們一般把細胞式生產方式分為:U字型生產線(流程分割生產)、單人生產貨攤式巡迴生產方式、無傳送帶生產方式、單人貨攤式生產方式、一人巡迴生產方式等五種生產方式。其中最典型的代表形式是「單人貨攤式生產方式」,該方式主要依靠手工進行組裝,由少數的精通多道工序的員工組裝產品的生產方式,它是一種適應性很強的生產方式。
細胞式生產方式在實際的生產線上,根據產品的不同、環境的不同和人員的不同,其形態也有所不同。在細胞式生產方式中,每個操作者在獨立的製造生產線上操作,而眾多的被稱為「細胞」的生產線同時進行工作,但是每一「細胞」的生產並非為所欲為和各行其是,而是有周密、嚴格的生產計劃,一個產品在各個「細胞」中分別進行組裝,最終共同完成一個成品的生產。
細胞式生產非常類似於細胞狀的蜂巢中所常見的勞力分工,在製造業上的細胞式生產試圖去將公司組織當中為生產產品及服務所創造出來的各式各樣流程加以分類。生產計劃者可能會先去對公司產品的整個范圍進行調查,根據員工在工作上所需要的特殊技術,以及為生產各式產品所需要的機器類型將流程加以組合。
在某些公司里的流程分類非常清楚簡潔,然而在其他公司像是這家運動用品製造商,分類的方法不見得具有持續性。基於這個原因,另外設有一個單獨的「其它」類別,以便放入那些與其他分類皆不適合的產品。不過在「主細胞」當中所包含的產品,都是在其生產上對員工技術的需求及用以製造的機器類型具有類似性的產品。
每個分類細胞通常都會被當作獨立的團隊來管理。每個細胞中的員工所需要負責的工作有執行、排定流程以及檢視。就這方面來說,細胞式生產便與由傳統工作站或是生產線所執行的工作有很大的差異。在像是汽車工廠或是洗車廠所可以看到的生產線生產方式,大部分的工作都是由機器設備在做,幾乎不可能有機會去發展出團隊合作的精神。而在像汽車修護廠或是醫院這樣的工作站,員工會有根強烈的團體歸屬感,可是因為每個人所做的工作都不相同,幾乎沒有人能對整體的工作有所了解。可是在細胞式生產當中卻不是這樣的情況,因為每個特殊分類細胞內的員工都必須負責起全部的工作。根據細胞式生產的擁護者的說法,細胞式生產可以培育出團隊的建立,對完工期的順利達成提出挑戰性,以及改進每一項產品及服務的品質
7. 哺乳動物細胞生產方式及其特點
(一)市場應對性好
標准化之後的細胞生產線可以簡單復制,可以針對客戶的要求隨時進行專門配置;
(二)生產效率高
由高能力員工組成的細胞生產線,通過優化配置,可以實現較高的生產效率;
(三)空間利用率高
細胞生產線可以在一天內搭建完成,不需要的時候也可以簡單拆除,用於其他更有價值的用途
(四)環境效益好
細胞式生產方式減少了庫存、搬運等耗費,降低了物耗與能耗,可以產生較好的環境效益。
(五)有利於員工自身的全面發展
細胞式生產方式要求員工成為多面手,掌握多種工序, 成為具有綜合技能的勞動者,而不像傳統生產方式中那樣單一的勞動者。
8. 細胞式生產方式的細胞式生產方式的基本分類
(一)無傳送帶生產方式
(二)U字型生產線(流程分割生產)
(三)單人貨攤式生產方式(單人生產)
(四)貨攤式巡迴生產方式(單人生產)
(五)巡迴生產方式(單人生產)
9. 細胞工程的研究對象及方法有哪些
細胞工程是生物工程的一個重要方面。總的來說,它是應用細胞生物學和分子生物學的理論和方法,按照人們的設計藍圖,進行在細胞水平上的遺傳操作及進行大規模的細胞和組織培養。當前細胞工程所涉及的主要技術領域有細胞培養、細胞融合、細胞拆合、染色體操作及基因轉移等方面。通過細胞工程可以生產有用的生物產品或培養有價值的植株,並可以產生新的物種或品系。
細胞工程(Cell engineering):
是指應用現代細胞生物學、發育生物學、遺傳學和分子生物學的理論與方法,按照人們的需要和設計,在細胞水平上的遺傳操作,重組細胞結構和內含物,以改變生物的結構和功能,即通過細胞融合、核質移植、染色體或基因移植以及組織和細胞培養等方法,快速繁殖和培養出人們所需要的新物種的生物工程技術。
細胞工程與基因工程一起代表著生物技術最新的發展前沿,伴隨著試管植物、試管動物、轉基因生物反應器等相繼問世,細胞工程在生命科學、農業、醫葯、食品、環境保護等領域發揮著越來越重要的作用。
21世紀合成生物學的發展,採用計算機輔助設計、DNA或基因合成技術,人工設計細胞的信號傳導與基因表達調控網路,乃至整個基因組與細胞的人工設計與合成,從而刷新了基因工程與細胞工程技術,並將帶來生物計算機、細胞制葯廠、生物煉制石油等技術與產業革命。
10. 細胞工程的種類
又稱為染色體轉導,或染色體介導的基因的轉移。染色體轉導術,目前有兩類,其一,稱為微細胞轉移術。應用低濃度秋水仙素長時間處理可使細胞微核化,經去核處理後,可得到只含相當於幾個乃至一個染色體的微細胞。微細胞被導入完整細胞以後仍顯示RNA合成,因而微核編碼的基因信息可望在微細胞異核體內表達出來。如小鼠的微細胞可被導入至另一品系的小鼠或倉鼠乃至人的HeLa細胞內。電泳檢測顯示存在著小鼠基因型的大分子物質,如脂酶D、嘌呤核苷磷酸化酶和肽酶B。已知前兩種酶的結構基因定位於小鼠的第14號染色體上。提示小鼠的該號染色體已進入宿主細胞內並行使其功能。
另一種方法是先誘發細胞同步分裂,繼用秋水仙素阻抑細胞分裂於中期,再破碎細胞,通過離心收集大量的中期染色體。有人把此法得到的人或倉鼠的中期染色體轉移到小鼠細胞內,並探查到有特異的供體基因的功能產物, 動物的染色體工程與育種
如胸苷激酶(TK)與次黃嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HPRT)。並推測整合到宿主小鼠內攜帶TK基因的染色體片段約大於 17000個鹼基。有人證明通過染色體介導的基因轉移,不僅在宿主細胞的分裂過程中能穩定地傳給子代,而且還能進行連續轉移,如人染色體基因可以轉移到小鼠細胞內,然後再使用同樣的技術從小鼠細胞轉移到中國倉鼠細胞內。這些實驗是在染色體水平上進行基因轉移的良好開端。 在高等植物方面的染色體工程,目前還僅在六倍體普通小麥與其他種、屬之間做過。六倍體普通小麥的染色體組型是由野生一粒小麥AA、小斯卑特山羊草BB和匯山羊草DD三種類型的染色體組融合而成,是一種能正常繁殖的種間雜種(AABBDD),因此,很容易容納其他種、屬染色體添加或替代。這個領域的研究目的在於改良作物品種和探究物種起源。
1.染色體的消除①單體植物,起初是利用自然發生的單倍體普通小麥製作。現在則用人工誘導花粉或未受精的子房產生的單倍體植株為材料進行。這是因為普通小麥的單倍體植株只有21條染色體,都不是成對的,因此在成熟分裂(見減數分裂)時沒有聯會的對象,故仍為單價染色體。這21個單價染色體能排列在赤道板上縱裂為二,在後期Ⅰ被平均分配到細胞的兩極。但在第二次分裂時,這21個染色體不再縱裂,隨機分開,結果產生了染色體數從0~21個的 21種類型的配子。這些配子只有具19條或20條染色體的有受精能力。因此,如果用正常植株的花 植物的染色體工程與育種
粉(n=21)給單倍體植株授粉,n=20的卵細胞以一定的比例受精,結果得到2n=41的植株。其染色體組型中有20條染色體因有同源(對應)染色體故可以配對形成二價染色體。而只有一條染色體沒有配對,成為單價染色體,因此稱這種類型的植物叫單體植物。例如,美國米蘇里大學的E.R.西爾斯於1937~1954年共用了十七年的時間,用中國春小麥中發現的兩個單倍體植物與正常花粉授粉,得到的後代中找到了 5種單體植物。其後用同樣方法製作一套21種單體植物。除普通小麥外,煙草和硬粒小麥也製成了一套單體植物。②缺對植物,單體植物的體細胞染色體數為2n=41。在成熟分裂後,將形成兩種配子,即n=21,n=20,這兩種雌雄配子都有受精能力,而且自花授粉後也容易結實。不過兩者受精率的高低有差別。因此,受精時,兩種配子按一定比例進行結合。結果見表1。如果缺失型的花粉與缺失型的卵細胞結合為受精卵,由此發育成的植物,將比通常的普通小麥少一對染色體,所以叫缺對植物。E.R.西爾斯用此方法也培育出了一套普通小麥缺對植物。
2.染色體的添加①同種染色體的添加,所添加的染色體來自同種個體,添加一個的叫三體植物(2n+1);添加一對的叫四體植物(2n+2)。三體植物和單體植物一樣,可得自單倍體三倍體或缺體。它的來源很多。如普通小麥單體植物在成熟分裂時,有時會出現不分離現象(即單價染色體的二個姊妹染色單體在後期Ⅰ被同時拉到同一極,而不是各自分配到兩極)。結果所形成的四分孢子,其中三個的染色體數是n=20,一個是n=22。如果多一個染色體的配子與正常花粉或卵細胞 (n=21)受精後,就成為三體植物(2n=43),比原來正常普通小麥多了一個染色體。三體植物自花授粉的後代中就有四體植物出現。因為三體植物在成熟分裂時形成兩種配子(n=21,n=22)。如果讓三體植物自花授粉,就會出現三種類型的子代,如表2所示。其中就有新型的四體植物,比正常植物多兩條染色體。②異種染色體的添加,所添加的染色體來自別種植物。以普通小麥(W)和黑麥(R)2n=14雜交為例(圖1)。由於黑麥染色體不能和普通小麥配對,在成熟分裂染色體重組時,黑麥基因不能直接轉移到小麥染色體上,而只能將黑麥整個染色體組加到小麥的染色體組中,所得子一代雜種為多倍單倍體(21′W7′R),僅28個染色體。經過秋水仙素處理加倍後,成為小黑麥八倍體(21″W7″R)共有56個染色體,再與小麥回交得到七倍體(21″W7′R),共49個染色體。然後與小麥再回交一次,就可得到外加的單體植物。單體植物自交後得二體植物(44個染色體21″W1″R)。另外,還有一個外加系是加入了黑麥第Ⅱ對染色體,成為44個染色體的二體植物。這種外加系能使小麥抗銹(見染色體倍性)。
3.染色體的替代用同種或異種染色體來替代某特定染色體的技術。其目的是要把已知道的具有抗病或其他有利特性的某一染色體來替代另一個具有其他性狀的染色體,以改良作物品種。染色體替代有三種方法:①用普通小麥自身的染色體來替代。例如,普通小麥的一對1A染色體被一對1B染色體替代後,就能育成缺對1A、四體 1B植物,即缺對-四體植物。這種類型的植物是由缺對1A與四體1B雜交後所得子一代再自花授粉後選育而成。②普通小麥的一個品種的染色體用別的品種的染色體來替代,叫做同種染色體替代。如果用正常普通小麥B品種的花粉,與缺對的A品種雜交,所得子一代自花授粉,則在子二代就能選育出A品種的缺對的二條染色體被B品種染色體替代的植物。③用異種植物的染色體來替代,叫異種染色體替代。例如,普通小麥的2A染色體可用黑麥的2R染色體替代。為了達到這個目的,首先要育成基本材料缺對植物(2n=42-2A)和異種染色體外加系(2n=42+2R)。這樣就可把普通小麥缺對2A與小麥2R染色體外加系(具有21對小麥染色體加上一對黑麥2R染色體)雜交,子一代雜種染色體2n=42,其中20對染色體是除2A外的全部普通小麥染色體,其餘二個一價染色體是2A和2R,成熟分裂時可產生四種類型配子,即:n=20+2A+2R,n=20+0,n=20+2A=21,n=20+2R=21。這最後一種是具有除2A以外的20個普通小麥染色體一個黑麥的2R染色體。因此,子一代雜種自花授粉的後代中,就能得到所期望的異種染色體替代植物。即一對黑麥的2R替代了一對小麥的2A(20″W2″R)。
現在,應用染色體工程的方法,在許多添加和替代染色體工作中,已經獲得了不少有遺傳學和育種學價值的品系。例如,獲得了添加單個冰草染色體的小麥品系中間,有的能抗粉露菌病、稈銹和葉銹。這種抗性均呈現顯性單因子遺傳。將黑麥第Ⅲ對染色體加到軟粒小麥對粉露菌病有抗性。用冰草的一個染色體替代軟粒小麥染色體3D,使軟粒小麥對稈銹有抗性。這些在生產實踐上都有實用價值。 誘導增加或減少一個生物體內整套染色體組數的技術。增加同種染色體組數的叫同源多倍體;增加異種染色體組數的叫異源多倍體,異源多倍體必須經過雜交才能得到(圖2)(見染色體倍性)。
染色體組工程的方法:多倍體的誘發自1937年發現了用秋水仙素誘發多倍體的方法以來,一般常用葯劑(秋水仙素、富民隆等),也可用高溫處理來誘發多倍體。其法是把植物的種子或幼芽浸在 0.05~0.2%的秋水仙素水溶液中,處理24~96小時即可得到很好的效果。例如四倍體西瓜、甜菜、玉米和百合等都是用此法獲得的(圖2)。
現在,由於原生質體分離技術的發展,也可從原生質體的融合得到多倍體。例如用聚乙二醇作誘導融合劑處理胡蘿卜原生質體後,得到了頻率相當高的四倍體和六倍體植株。這是來源於二個或三個原生質體融合的結果。
單倍體的誘發60年代以來,子房、花葯或花粉離體培養成功,很易從大孢子、卵細胞或小孢子等得到單倍體植株。其法是將一定時期的花葯或子房移植到特定的培養基上培養。待生長愈傷組織或胚狀體後,再移到分化培養基上,分化出苗和根,長成完整的小植株即可移到盛有土壤的盆中繼續栽培到開花。單倍體植物一般不能結實或僅結少量種子。
此外,還可用遠緣雜交,X射線或紫外線照射,化學葯品如馬來醯肼、甲苯胺藍、氯黴素等以及異源胞質等方法都能誘導單倍體產生。1970年有人又用大麥與球莖大麥雜交後染色體消除的方法,產生高頻率的單倍體,有的可高達68.5%。在雜交後,球莖大麥的7個染色體就消除在胚中,留下的是大麥的7個染色體,成為單倍體的胚及小植株。經秋水仙素處理後,染色體加倍形成純合二倍體。
染色體組工程的應用誘導多倍體在植物育種上的應用是有限度的。由於作物類型不同,對多倍性誘變反應也不同。原來的倍性水平、染色體組的結構、繁殖方式、多年生性、植株實用部位,所有這些都關繫到育種的成敗。最適宜用染色體加倍方法改良的作物應該具有:①染色體數目較少,②以收獲營養體為主,③異花授粉,④多年生和營養繁殖的習性等條件。這些都是多倍體育種獲得成功的先決條件。 研究真核細胞的核、質相互關系以及細胞器,胞質基因的轉移等細胞拆合的技術,所以又叫細胞拆合工程。主要研究內容是細胞質的置換。過去在植物上置換的方法是進行連續回交。例如,為了研究柳葉菜屬的細胞質遺傳,曾連續回交了二十五代,結果還不能把全部母核替代出來。現在由於核移植和原生質體的分離方法的改進,推進了這項工程的進展。
細胞質工程的方法去核和核移植 動物細胞核的移植一般都用顯微操作器進行。50年代初期,美國生物學家R.布里格斯和T.金首先成功地把豹蛙囊胚期細胞的細胞核移植到去核的蛙卵,並能正常發育。後來,英國J.B.格登把爪蟾蝌蚪腸上皮細胞核移植到去核卵內,能發育到有生殖能力的成體。中國童第周等還成功地進行金魚類異種、異屬之間的核移植實驗(見細胞分化)。70年代以來,體外培養的動物細胞的去核,是先用細胞鬆弛素B處理細胞,再高速離心使細胞核與細胞質分開。分離出來的核,帶有少量胞質並圍有質膜,稱為「核體」或「小型細胞」。核體能重新再生其胞質部分,繼續生長、分裂。去核後的胞質部分,仍由膜所包圍,即為「胞質體」或「去核細胞」(圖3)。秋水仙素及其衍生物和長春新鹼等也能誘發某些哺乳類細胞排核。目前制備胞質體和核體的方法目臻完善,純度可達99%左右。胞質體約可存活18~36小時。
植物細胞核的移植,在低等植物如單細胞傘藻,可把新鮮材料的假根切下,放在玻片上用玻棒擠壓,使細胞的內含物壓出在一滴適合的培養液中,反復沖洗幾次,然後在顯微鏡下觀察,一直到核周圍無細胞質為止。離心分離後待用。高等植物如矮牽牛、天仙子、煙草、番茄等原生質體核的分離,可先在懸浮的原生質體中用蒸餾水將懸液沖淡一半,約30分鍾後,原生質體破裂,放出細胞核與葉綠體,就可在0.6M蔗糖液中離心和收集核,然後存放在一定的培養液中待用。1978年以來又借用動物細胞去核的葯劑細胞鬆弛素B來處理原生質體,加上高速離心,使原生質體分離成二部分,即:無核原生質體和小原生質體。開辟了去植物細胞核甚至去部分染色體的新途徑。
細胞重組已經分離的核體(小細胞)與胞質體在融合因子的介導下重新融合,構成「重組細胞」,這一技術即稱為細胞重組,胞質體與另一完整細胞融合,即產生「胞質雜種」細胞。這兩種細胞產生的效果是不同的,現在有方法把它們鑒別開。以大鼠二種成肌細胞為材料,一種是正常的具有次黃嘌呤-鳥嘌呤-磷酸核糖基轉移酶(HGPRT+)基因, 另一種是突變體缺少這種基因(HGPRT-),因此,前者細胞中有轉移酶能被氚-次黃嘌呤標記,而後者沒有這種酶,便不能標記。在兩者的細胞質中讓HGPRT+攝取小乳膠顆粒,讓HGPRT-攝取大乳膠顆粒,以顆粒的大小來作標記。當核體(小型細胞)與胞質體融合後,在重組細胞中可看到核被氚-次黃嘌呤所標記,在細胞質中有大量大乳膠顆粒和極少數小乳膠顆粒。當胞質體與另一個HGPRT+完整細胞融合後的胞質雜種細胞的細胞質中,則同時出現有大量的大、小乳膠顆粒。如圖4所示。應用這種方法很容易把兩類細胞鑒別出來。
在植物中,原生質體與核的融合以煙草、矮牽牛的核移植為例,其步驟是:①先使矮牽牛游離核與煙草原生質體各自懸浮並沉澱在0.25M硝酸鈣溶液中,pH6;②去掉上清液,再把它們懸浮起來,以適當比例使核與原生質體在試管中混合、離心,隨後加入45%聚乙二醇溶液1毫升使之聚合:③30分鍾後,徐徐加入4毫升0.2M硝酸鈣(被pH9的甘氨酸氫氧化鈉所緩沖)以誘導融合攝取核;④15分鍾後加0.2M硝酸鈣(pH6);⑤再過20分鍾,原生質體用培養液沖洗;⑥鏡檢後,將具有雙核的(其中一個是矮牽牛的核)煙草原生質體進行培養。
細胞質工程的應用動物方面1974年有人用兩種小鼠成纖維細胞,其一用L細胞的完整細胞,它的核內具有對5-溴脫氧尿苷抗性的核基因BUd(RR),但細胞質內沒有抗氯黴素的胞質基因,用的另一個細胞的線粒體上帶有抗氯黴素的胞質基因CA(PR),而細胞核內帶有硫代鳥嘌呤敏感核基因(TGS),把後者去核細胞與前者融合(圖5),則融合後的胞質雜種細胞既能抗5-溴脫氧尿苷(BUdR),又能抗氯黴素(CAP)。但如果把親體細胞 (BUdRR和TGS)同時培養在含有這兩種葯物的培養基上,則都將死去。因為這兩種細胞一個對CAP敏感,另一個不抗BUdR,而胞質雜種細胞則兩者都能抗,不但能存活而且還能增殖。
植物方面用等滲密度梯度高速離心後,也可得到兩種亞原生質體,①在低密度范圍內可得到胞質體(去核原生質體);②在高密度中,可得到小原生質體(核質體)。現在已能自玉米、煙草和胡蘿卜細胞得到這兩種亞原生質體。生化實驗證明:去核原生質體代謝作用很低,而小原生質體由於減少了表面積和體積(僅及原生質體的10~15%),因此,攝取物質快,合成蛋白質也快,培養時發育迅速,是一種研究核質關系的好材料。由於這項工作才開始,迄今尚無明顯結果。 細胞融合是指用自然或人工的方法,使兩個或幾個不同的細胞融合成一個細胞的過程。細胞融合的結果,一個細胞中含有兩個不同的細胞核,則稱為異核體;隨後的有絲分裂中,來自不同細胞核的染色體可能合並到一個結合核內。因此,又稱為體細胞雜交。細胞融合的范圍很廣,從種內、種間、屬間、科間一直到動、植物兩界之間都進行了嘗試。在植物方面,由於各類細胞具有全能性,在煙草、矮牽牛、胡蘿卜等種間雜種,馬鈴薯和番茄、曼陀羅和顛茄、煙草和矮牽牛等屬間雜種都已獲得了再生植株。在動物方面人和鼠體細胞雜交,雖然不能長成一個新個體,但能作基因定位的材料。因此,這項新技術,在理論研究和工、農、醫方面的應用,均有廣闊的前景。細胞融合技術的發展,歷史很短。自1960年在體外培養中發現雜種細胞以來,僅20多年。1965年岡田善雄等和H.哈里斯等各自用滅活的仙台病毒誘導產生了第一個種間異核體。1970年已應用人與鼠的細胞雜交系統地進行了人類染色體基因的定位工作。在植物方面,1960年E.C.科金首先使用纖維素酶分離番茄幼根的原生質體獲得成功。1970年他們又成功地使種間原生質體融合在一起。1972年P.S.卡爾森等又從融合的原生質體獲得了第一株種間細胞雜種。到1980年為止,種間融合的再生植株已有16種之多。
細胞融合的方法動物細胞雜交或細胞融合 將兩個不同種的親本細胞A和B,以滅活的仙台病毒或聚乙二醇(PEG)為融合誘導劑,使A和B兩細胞融合成為一個具兩個遺傳性不同核的異核體(如遺傳性相同的核融合在一起叫同核體)。隨後異核體經有絲分裂成為兩個具有A和B兩親本的雜種融合核。AB雜種經多次分裂,B親本的染色體會逐漸減少到一個或完全消失(圖6)。
植物體細胞雜交①原生質體的分離。植物細胞之間有果膠質粘連,每個細胞之外還有一層纖維素組成的壁,因此,在分離原生質體時,首先要在一定濃度的酶液(果膠酶與纖維素酶)中保溫,消去果膠質與纖維素後才能使原生質體分離出來。②原生質體的融合。不同種之間原生質體的融合,須選用一種融合誘導劑(聚乙二醇,或高鈣CaCl2.2啹O,0.05M溶於甘露醇 0.4M和pH10.5)誘導融合。它們的誘導率可達20~50%。③雜種細胞的選擇與培養。細胞融合後要把雜種細胞選擇出來。一般都利用各種生化指標和遺傳標記來選擇和鑒定。例如,使用天然的或人工誘變的突變體,如白化苗、營養缺陷型、抗葯性突變體等,或根據不同材料對激素敏感性不同,生長差異等,來設計適合的選擇系統。如果融合的原生質體一個是白化,另一個具葉綠體,就可用機械的方法,把融合的細胞在倒置顯微鏡下把它們挑選出來進行培養。這些細胞培養到各個發育階段,如愈傷組織、分化苗和根,都需要更換培養基,才能使它們順利地再生成植株。