真菌常用的誘變方法有哪些

⑴ 請問真菌誘變是化學劑的含量以及紫外線的時間選擇謝謝

紫外線是屬於物理誘變，一般是253.7nm波長的紫外線（15w紫外燈）距離30cm，照射10-20秒到10—20分鍾，具體時間根據你誘變的菌種而定。但要記住微生物有光照復活的現象，所以誘變後要在紅光下操作，還有不要見到其他光源。誘變致死率在百分之70-75最好。
化學誘變的主要方法比較多，我就說一個自己還記得的吧！
就是亞硝酸鹽誘變
一）1mol每升的醋酸作為緩沖液：取6.12g醋酸+蒸餾水至100ml。將NAAC溶液徐徐加入到剛才配製的溶液中混勻，然後調節PH到4.5為止。
二）0.6mol每升的亞硝酸鈉溶液：4.14g+蒸餾水到100ml
三）0.7mol每升的磷酸氫鈉溶液：9.94g該物質+蒸餾水到100ml
上述是所需溶液的配製方法，注意三種溶液使用前需要滅菌。
做法你應該會吧？！！全部是自己打的啊剛好考試復習過！！~~希望能幫助到你。

⑵ 請問用紫外線對真菌的原生質體進行誘變的成功率高嗎要注意些什麼謝謝！

是的。紫外線殺菌就是通過紫外線的照射，破壞及改變微生物的DNA（脫氧核糖核酸）結構，使細菌當即死亡或不能繁殖後代，達到殺菌的目的。真正具有殺菌作用的是UVC紫外線，因為C波段紫外線很易被生物體的DNA吸收，尤以253.7nm左右的紫外線最佳，這是因為細胞對光波的吸收譜線有一個規律，在250~270nm的紫外線有最大的吸收，被吸收的紫外線實際上作用於細胞遺傳物質即DNA，它起到一種光化作用，紫外光子的能量被DNA中的鹼基對吸收，引起遺傳物質發生變異，使細菌當即死亡或不能繁殖後代，達到殺菌的目的。

由於紫外線會殺死細胞，因此紫外線消毒時要注意不能直接照射到人的皮膚，尤其是人的眼睛，紫外線殺菌燈點亮時不要直視燈管，由於短波紫外線不透過普通玻璃，戴眼鏡可避免眼睛受傷害。如果不小心眼受傷，一般情況也無關大礙，就象被太陽光灼傷一樣，嚴重的可滴眼葯水或人乳，幫助復原。在有人的場合，不要使用有臭氧燈管，臭氧濃度高時對人不利。

紫外線殺菌屬於純物理消毒方法，具有簡單便捷、廣譜高效、無二次污染、便於管理和實現自動化等優點，隨著各種新型設計的紫外線燈管的推出，紫外線殺菌的應用范圍也不斷在擴大。 另可參考網路資料：http://ke..com/view/773897.htm

紫外線殺菌燈的應用和注意事項：

1.每一種微生物都有其特定紫外線殺滅、死亡劑量標准，其劑量是照射強度與照射時間的乘積（殺菌劑量＝照射強度·照射時間/K=I·t)，即紫外線的照射劑量則取決於紫外線的強度大小以及照射時間的長短，高強度短時間與低強度長時間之照射其效果是相同的。
2.石英燈管使用一段時間後會逐漸老化，紫外線照射強度會發生衰退，為達到徹底消毒的效果，應定期檢查測石英燈的照射強度，發現強度不夠時應立即更換。
3.紫外線的只能沿直線傳播，穿透能力弱，任何紙片、鉛玻璃、塑料都會大幅降低照射強度。因此消毒時盡量應使消毒部位充分暴露於紫外線下，定期擦拭燈管，以免影響紫外線穿透率及照射強度。
4.紫外線對人體的的皮膚能產生很大的傷害性，不要在有人的場所使用UV燈，更不要用眼睛直視點燃的燈管，由於短波紫外線不能透過普通玻璃，所以戴眼鏡可避免眼睛受傷害。
5.在有人員活動的場所，一般不能使用臭氧燈管，因為臭氧會促進人體的血紅蛋白凝結，造成人體供氧不足，發生頭暈、惡心的感覺，影響身體健康，特別在臭氧濃度達到＞0.3ppm (mg/m2 )時，將會對人體造成嚴重的傷害。
6.低壓放電燈中之紫藍色光芒為汞蒸氣壓，雖然汞蒸氣壓的強度與紫外線仍然有其關聯性，但是並不直接代表紫外線之強度，這也就是說，紫外線的強度無法用肉眼來判定。
7.燈具加反光罩可以保證紫外線能量的集中，另外可以避免給工作人員造成損傷。反光罩一定要用對253.7nm紫外線材料吸引少反射多的材料製作，表面氧化拋光處理過的鋁對短波紫外線的反射系數最大，所以一般紫外線燈具的反光系統均用鋁材製成。

⑶ 誘變育種的方法

物理、化學誘變的方法及其機理如下述。 應用較多的是輻射誘變，即用α射線、β射線、γ射線、Χ射線、中子和其他粒子、紫外輻射以及微波輻射等物理因素誘發變異。當通過輻射將能量傳遞到生物體內時，生物體內各種分子便產生電離和激發，接著產生許多化學性質十分活躍的自由原子或自由基團 。它們繼續相互反應，並與其周圍物質特別是大分子核酸和蛋白質反應，引起分子結構的改變。由此又影響到細胞內的一些生化過程，如 DNA合成的中止、各種酶活性的改變等，使各部分結構進一步深刻變化，其中尤其重要的是染色體損傷。由於染色體斷裂和重接而產生的染色體結構和數目的變異即染色體突變，而DNA分子結構中鹼基的變化則造成基因突變。那些帶有染色體突變或基因突變的細胞，經過細胞世代將變異了的遺傳物質傳至性細胞或無性繁殖器官，即可產生生物體的遺傳變異。
誘變處理的材料宜選用綜合性狀優良而只有個別缺點的品種、品系或雜種。由於材料的遺傳背景和對誘變因素的反應不同，出現有益突變的難易各異，因此進行誘變處理的材料要適當多樣化。由於不同科、屬、種及不同品種植物的輻射敏感性不同，其對誘變因素反應的強弱和快慢也各異。如十字花科白菜的敏感性小於禾本科的水稻、大麥，而水稻、大麥的敏感性又小於豆科的大豆。另外，輻射敏感性的大小還同植物的倍數性、發育階段、生理狀態和不同的器官組織等有關。如二倍體植物大於多倍體植物，大粒種子大於小粒種子，幼齡植株大於老齡植株，萌動種子大於休眠種子，性細胞大於體細胞等。根據誘變因素的特點和作物對誘變因素敏感性的大小，在正確選用處理材料的基礎上，選擇適宜的誘變劑量是誘變育種取得成效的關鍵（表 1）。適宜誘變劑量是指能夠最有效地誘發作物產生有益突變的劑量，一般用半致死劑量（LD50）表示。不同誘變因素採用不同的劑量單位。Χ、γ射線線吸收劑量以拉德(rad）或戈瑞（GY）為單位，照射劑量以倫琴（R）為單位，中子用注量表示。同時要注意單位時間的照射劑量（劑量率、注量率）以及處理的時間和條件。
輻照方法分外照射和內照射兩種，前者指被照射的植物接受來自外部的γ射線源、Χ射線源或中子源等輻射源輻照，這種方法簡便安全，可進行大量處理。後者指將放射性物質(如32P、35S等）引入植物體內進行輻照，此法容易造成污染，需要防護條件，而且被吸收的劑量也難以精確測定。干種子因便於大量處理和便於運輸、貯藏，用於輻照最為簡便。 化學誘變除能引起基因突變外，還具有和輻射相類似的生物學效應，如引起染色體斷裂等，常用於處理遲發突變，並對某特定的基因或核酸有選擇性作用。化學誘變劑主要有：①烷化劑。這類物質含有1個或多個活躍的烷基，能轉移到電子密度較高的分子中去，置換其他分子中的氫原子而使鹼基改變。常用的有甲基磺酸乙酯(EMS）、乙烯亞胺（EI）、亞硝基乙基脲烷（NEU）、亞硝基甲基脲烷（NMU）、硫酸二乙酯（DES）等。②核酸鹼基類似物。為一類與DNA鹼基相類似的化合物。滲入DNA後，可使DNA復制發生配對上的錯誤。常用的有5-溴尿嘧啶(BU）、5-溴去氧尿核苷（BudR）等。③抗生素。如重氮絲氨酸、絲裂毒素C等，具有破壞DNA和核酸的能力，從而可造成染色體斷裂。
化學誘變主要用於處理種子，其次為處理植株。種子處理時，先在水中浸泡一定時間，或以干種子直接浸在一定濃度的誘變劑溶液中處理一定時間，水洗後立即播種，或先將種子乾燥、貯藏，以後播種。植株處理時，簡單的方法是在莖稈上切一淺口，用脫脂棉把誘變劑溶液引入植物體，也可對需要處理的器官進行注射或塗抹。應用的化學誘變劑濃度要適當（表 2）。處理時間以使受處理的器官、組織完成水合作用和能被誘變劑所浸透為度。化學誘變劑大都是潛在的致癌物質，使用時必須謹慎。

⑷ 靈芝誘變育種的物理方法有哪些

物理誘變是利用超聲波、高溫、激光、各種射線包括紫外線、X射線、γ射線、快中子、α射線、β射線等物理因素誘導真菌發生變異的方法。其中應用較普遍的有應用γ射線、紫外線、X射線等輻照育種，如太空育種靈芝。中國醫學科學院葯用植物研究所研究人員於1999年11月，利用「神舟1號」宇宙飛船搭載靈芝菌種，在封艙和開艙過程中均得到北京市公證處的公證。經過多年的研究，採用傳統生物技術和分子生物學及空間育種技術相結合，探明空間環境對靈芝的生物學效應，經對神舟飛船搭載靈芝多年的栽培試驗，選育出高產優質的太空新菌株，其子實體產量比對照增長15%左右。開展搭載靈芝與地面對照在生物學特性、生理、生化、遺傳性狀、成分含量等方面的研究，並對各基因組DNA進行了AFLP指紋比較，表明搭載靈芝菌株基因發生了變異，其中靈芝三萜酸成分比對照高10倍多。該項研究填補了葯用真菌空間育種的空白。

⑸ 誘變育種常用的方法有

誘變育種：是用物理或化學的誘變劑使誘變對象內的遺傳物質（DNA）的分子結構發生改變， 引起性狀變異並通過篩選獲得符合要求的變異菌株的一種育種方法。

物理方法：射線（紫外線、X光線、Y射線，中子線），激光微束，離子束，微波，超聲波，熱力等
化學誘變常用方法：浸漬法、塗抹法、滴液法、注射法、施入法和熏蒸法。化學誘變劑（鹼基類似物、烷化劑，移碼誘變劑，硫酸二乙酯（DFS）、5-溴尿嘧 啶（5－BU）、氮芥（Nm）、N'廣甲基N'亞硝基胍（NTG））。

生物方法：空間條件處理誘變，病原微生物誘變，轉基因誘變

秋水仙素是從百合科植物秋水仙（Colchicum autumnale）的根、莖、種子等器官中提煉出來的一種葯劑，分子式為C22H25O6N。積水仙素是淡黃色粉末，純品是針狀無色結晶性，性極毒，融點為155℃，易溶於水、酒料、氯仿和甲醛中，不易溶解於乙醚、苯。
秋水仙素能抑制細胞分裂時紡錘絲的形成，使已正常分離的染色體不能拉向兩極，同時秋水仙素又抑制細胞板的形成，使細胞有絲分裂停頓在分裂中期。由於它並不影響染色體的復制，因而造成加倍後的染色體仍處於一個細胞中，導致形成多倍體。處理過後，如用清水洗凈秋水仙素的殘液，細胞分裂仍可恢復正常。
人工誘導多倍體常用秋水仙素的水溶液。配製方法為，將秋水仙素直接溶於冷水中，或先將其溶於少量酒精中，再加冷水。配製好的溶液應放入棕色玻璃瓶內保存，且保存時應置於暗處，避免陽光直射，此外瓶蓋應擰緊，以減少與空氣的接觸，避免造成葯效損失。
3．秋水仙素的濃度與處理時間
秋水仙素溶液的濃度及處理時間的長短是誘導多倍體成功的關鍵因素。一般秋水仙素處理的有效濃度有0.0006%～1.6%，比較適宜的濃度為0.2%～0.4%。處理時間長短與所用秋水仙素的濃度有密切關系，一般濃度俞大，處理時間則要愈短，相反則可適當延長。多數實驗表明，濃度大，處理時間短的效果比濃度小，處理時間長要好。但處理時間一般不應小於24小時或以處理細胞分裂的1～2個周期為原則。
由於不同植物，不同器官或組織在一定條件下對秋水仙素的反應不同，因此，須根據不同情況來掌握處理的濃度和時間。例如，東北林業大學張敩方等人用白花類型金魚草種子進行多倍體誘變，採用濃度0.3%～0.5%的秋水仙素處理24小時誘變效果較好。另有實驗表明，處理矮牽牛種子的適宜濃度為0.01%～0.1%，以0.05%處理時間24小時效果最佳。在不同器官方面，處理種子的濃度可稍高些，持續時間可稍長（一般為24～48小時）；處理幼苗時，濃度應低些，處理時間可稍短點；植物幼根對秋水仙素比較敏感，極易受損害，因此，對根處理時應採用秋水仙素溶液與清水交替間歇的方法較好。
秋水仙素溶液只是影響正在分裂的細胞，對於處於其他狀態的細胞不起作用。因此，對植物材料處理的適宜時期是種子（干種子或萌動種子）、幼苗、幼根與莖的生長點、球莖與球根的萌動芽等。如果處理材料的發育階段較晚，被誘導的植株易出現嵌合體。

4．秋水仙素處理的方法
（1）浸漬法
此法適合於處理種子，枝條盆栽小苗的莖段生長點。
一般，選干種子或萌動種子，將它們放於培養器內，再倒入一定濃度的秋水仙素溶液，溶液量為淹沒種子的2/3為宜。處理時間多為24小時，濃度0.2%～1.6%。浸漬時間不能太長，一般不超過6天，以免影響根的生長。最好是在發根以前處理完畢。處理完後應及時用清水洗凈殘液，再將種子播種或沙培。對於百合類植物，常采二倍體鱗片浸於0.05%～0.1%的秋水仙素溶液，處理1～3小時後洗凈扦插。唐菖蒲實生小球也可用浸漬法促使染色體加倍。
盆栽幼苗，處理時將盆倒置，使幼苗頂端生長點浸入秋水仙素溶液內，以生長點全部浸沒為度。對於組織培養試管苗也可採用浸漬法處理，只是處理時須用紗布或濕濾紙覆蓋根部，處理時間因材料可從幾個小到幾天。對插條，一般處理1～2天。
（2）滴定法
用滴管將秋水仙素水溶液滴在子葉、幼苗的生長點上（即頂芽或側芽部位）。一般6～8小時滴一次，若氣候乾燥，蒸發快，中間可加滴溜餾水一次，如此反復處理一至數日，使溶液透過表皮滲入組織內起作用。若水滴難以停留在芽處，則可用棉球包裹幼芽，再滴芽液處理。此法與浸種法相比，可避免植株根系受到傷害，也比較節省葯液。
（3）毛細管法
將植株的頂芽、腋芽用脫脂棉或紗布包裹後，將脫脂棉與紗布的另一端浸在盛有秋水仙素溶液的小瓶中，小瓶置於植株近旁，利用毛細管吸水作用逐漸把芽浸透，此法一般多用於大植株上芽的處理。
（4）塗抹法
將秋水仙素乳劑塗抹在牙上或梢端，隔一段時間再將乳劑洗去。
（5）套罩法
保留新梢頂芽，除去牙下數葉，套上一個膠囊。內盛0.65%的瓊脂加適量秋水仙素，經24小時即可除去膠囊。
（6）注射法
採用微量注射器將一定濃度的秋水仙素溶液注入植株頂芽或側芽中。
（7）復合處理法
據日本山川邦夫（1973年）報道，將好望角苣苔屬（Streptocarpus，屬苦苣苔科植物）中的一些種用秋水仙素處理11天，又用 0.04～0.05Gy（4～5rad）的X射線照射，可提高染色體加倍植株的出現率達到60%。而單獨用秋水仙素處理時為30%。採用復合處理法還獲得了兩株八倍體。

5．秋水仙素誘導多倍體需注意的事項
（1）幼苗生長點的處理愈早愈好，獲得全株四倍性細胞的數目就愈多，處理時間愈晚，則大多是混雜的嵌合體。
（2）植物組織經秋水仙素處理後，在生長上會受到一定影響，如果外界條件對它生長不適宜，也會使試驗失敗，要注意培育、管理。對形成嵌合體的可採用摘頂、分離繁殖、細胞培養等方法。
（3）處理期間，注意處理時的室溫，當溫度較高時，處理濃度應低一些，處理時間要短些；相反，當室溫較低時，處理濃度應高些，處理時間應長點。
（4）誘導多倍體時，處理的植物材料應選二倍體類型，且生長發育處理幼苗期，材料數量上應盡量多數，以便選擇有利變異。
（5）處理完後，須用清水沖洗干凈，以避免殘留葯液繼續使染色體加倍，從而對植株造成傷害。
（6）秋水仙素屬劇毒物質，配製和使用時，一定要注意安全，避免秋水仙素粉末在空中飛揚，以免誤入呼吸道內；也不可觸及皮膚。可先配成較高濃度溶液，保存於棕色瓶中，蓋緊蓋子，放於黑暗處，用時再稀釋。

⑹ 病原真菌毒性怎麼實現人工誘變

人工誘變常用的誘變劑(mutagen)有物理的和化學的兩類常用物理誘變劑有紫外線X射線γ射線超聲波等化學誘變劑很多，有天然嘧啶類似物天然嘌呤類似物烷化劑類移碼誘變劑以及其他

突變的類型很多，在抗病性研究中，經常誘導的有顏色突變生化突變和毒性突變顏色突變菌株與生化突變菌株多用於遺傳研究和致病機制研究

人工誘導毒性突變，先要選擇適宜的誘變劑，用誘變劑處理孢子或接種的葉片在預備試驗中，先確定誘變方法最適誘變劑量和處理時間作出劑量致死曲線和劑量突變曲線一般致死率達95%~99%的劑量為紫外線誘變的適宜劑量(井金學等，1993)

檢出突變體的標記類型很多，有毒性標記形態標記顏色標記生化標記抗葯性標記等專性寄生菌的毒性突變研究，適用毒性標記，有時也配合使用顏色標記，例如白化體(albino)毒性突變表型用作物的一套單基因系和近等基因系檢測發現突變菌落後，進行單孢子分離，在檢出品系或感病品種上繁殖，獲得突變菌株隨後用來進一步研究突變性質，確定毒性譜發生有性世代的病原菌，還要使突變菌株自交，明確其遺傳性質以及計算突變率

兼性寄生菌易於用培養基培養，還可利用生化標記，應用選擇性培養基，檢測抗葯性突變和營養缺陷型突變，一個菌落就是一個突變體，比照在完全培養基上產生的菌落總數，計算突變率對於能培養的真菌，誘導營養缺陷型等生化突變已有一套標准方法可以參照

⑺ 用化學法如何進行菌種誘變有哪位做過此項目具體的操作過程

已知的有烷化劑、鹼基類似物(base analog)、羥胺(hydroxylamine)、吖啶色素等。

常用化學誘變劑的種類及作用機制

（一）烷化劑

是栽培作物誘發突變的最重要的一類誘變劑。葯劑帶有一個或多個活潑的烷基。通過烷基置換，取代其它分子的氫原子稱為"烷化作用"所以這類物質稱烷化劑。
烷化劑分為以下幾類：
1. 烷基磺酸鹽和烷基硫酸鹽
代表葯劑：甲基磺酸乙酯（EMS）、硫酸二乙酯（DES）
2. 亞硝基烷基化合物
代表葯劑：亞硝基乙基脲（NEH）、N-亞硝基-N-乙基脲烷（NEU）
3. 次乙胺和環氧乙烷類
代表葯劑：乙烯亞胺（EI）
4. 芥子氣類
氮芥類、硫芥類
烷化劑的作用機制--烷化作用 作用重點是核酸，導致DNA斷裂、缺失或修補。

（二）核酸鹼基類似物

這類化合物具有與DNA鹼基類似的結構。
代表葯劑：
5-溴尿嘧啶（BU）、5-溴去氧尿核苷（BudR） 為胸腺嘧啶（T）的類似物
2-氨基嘌呤（AP） 為腺嘌呤（A）的類似物
馬來醯肼（MH） 為尿嘧啶（U）的異構體
作用機制：作為DNA的成份而滲入到DNA分子中去，使DNA復制時發生配對錯誤，從而引起有機體變異。

（三）其它誘變劑

亞硝酸 能使嘌呤或嘧啶脫氨，改變核酸結構和性質，造成DNA復制紊亂。HNO2還能造成DNA雙鏈間的交聯而引起遺傳效應。
疊氮化鈉(NaN3) 是一種呼吸抑制劑，能引起基因突變，可獲得較高的突變頻率，而且無殘毒。

以下是具體的使用方法，希望對你有點作用！！！！！！！！！！

化學誘變劑的劑量主要決定於其濃度和處理時間。

化學誘變劑都具毒性，其中90%以上是致癌物質或極毒葯品，使用時要格外小心，不能宜接用口吸，避免與皮膚直接接觸，不僅要注意自身安全，也要防上污染環境，造成公害。

一、鹼基類似物

用於誘發突變的鹼基類似物有5-BU、5-FU、BUdr、5－IU等他們是胸腺嘧啶的結構類似物，AP、6-MP是腺嘌呤的給、結構類似物。最常用是5－BU和AP。

當將這類物質加人到培養基中，在繁殖過程中可以摻人到細菌DNA分子中，不影響DNA的復制。它們的誘變作用是取代核酸分子中鹼基的位置，再通過DNA的復制，引起突變，困此，也叫摻人誘變劑。顯然這一類誘變劑要求微生物細胞必頓處在代謝的旺盛期，才能獲得最佳的誘變效果。

（一）鹼基類似物的誘變機制

正常的鹼基存在著同分異構體，互變異構現象在嘧啶分子中以酮式和烯醇式的形式出現，而嘌呤分子中以氨基和亞氨基互為變構的形式出現、一般互變異構現象在鹼基類似物中比正常DNA鹼基中頻率更高。

5-BU 導致A：T鹼基對轉換為GC鹼基

2-氨基嘌呤也可以誘發DNA分子中A：T－ G：C或G：C－ A：T的轉換。

（二）鹼基類似物的誘變處理方法（以5-BU為例）

1．單獨處理

將微生物液體培養到對數期．離心除去培養液，加入生理鹽水或緩沖液．飢餓培養8-10h，消耗其體內的貯存物質、將5-BU加入到經飢餓培養的培養液中，處理濃度為25-40ug／ml，溫合均勻．取0.1-0.2ml菌懸液加人到瓊脂培養基上塗布培養。在適宜溫度下，使之在生長過程中誘變處理。培養後挑取單菌落，進行篩選。如果是處理真菌、放線菌孢子，則要提高5-BU的濃度，常處理濃度為 0.1mg／ml。

2．與輻射線復合處理

據報道；如果菌體先用5-BU等鹼基類似物進行處理，使它們首先滲人到DNA分予中，然後用輻射線照射，誘變效果會比單獨使用射線要好。因此鹼基類似物也是一種輻射誘變的增敏劑。從而提高突變率。

二、烷化劑

（一）烷化劑的作用機制

烷化劑分單功能烷化劑和雙功能或多功能烷化劑兩大類。前者僅一個烷化基團，對生物毒性小，誘變效應大。後者具有兩個或多個烷化基團，毒性大，致死率高，誘變效應較差。主要原因是雙功能烷化劑有硫芥、氮芥。

烷化劑主要是通過烷化基團使DNA分子上的鹼基及磷酸部分烷化，DNA復制時導致鹼基配對錯誤而引起突變，鹼基中容易發生烷化作用的是嘌呤類。其中鳥嘌呤N7是最易起反應的位點，幾乎可以和所有烷化劑起烷化作用；此外，DNA分子中比較多的烷化位點是鳥嘌呤O6和胸腺嘧啶O4，這些可能都是引起突變的主要位點。其次引起烷化的位點是鳥嘌呤N3、腺嘌呤N2，腺嘌呤N7和胞嘧啶N3。這些位點引起鹼基置換的僅占烷化作用的10％左右。因此，由這些位點改變所引起的突變僅是少數。

烷化劑也能造成磷酸和核糖之間的共價鍵斷裂，而造成突變。

（二）烷化劑的性質

溶液烷化劑的性質比較活潑，不太穩定，在水溶液中容易發生分解。它們大部分半衰期很短，其長短與溫反、溶液PH關系很大。因此，化學誘變劑要現用現配還要避光。配製烷化劑時，要採用合適的出緩沖液。 有毒！！！！

（三）常用的烷化劑

亞硝基胍（NTG）

黃色晶體物質，性質不穩定，容易光解，黃色變為綠色時，誘變效應際低。

有超誘變劑之稱，常用緩沖溶液有磷酸緩沖液和Tri緩沖液。

誘變處理方法：

①用一定值的磷酸緩沖液或Tri緩沖液洗製成菌懸液。②NTG母液：配製需加助溶劑甲醯胺或丙酮少許，然後加緩沖液，其比例為緩沖液9ml：NTG丙酮溶液lml，濃度為NTG 1mg/ml ；使用時取母液0.2ml + 菌懸液1.8ml，NTG終濃度為100ug/ ml。一般隨菌種不同而異，細菌一般為100-1000 ug/ ml，放線菌、真菌為l000-3000 ug/ ml。③放線菌在生長適宜的溫度下培養，（細菌30-35℃、真菌25-28℃、放線菌30-32℃）處理若干時間，一般細菌20-60min,孢子90-120 min④終止反應。冷的生理鹽水50倍稀釋處理，或經過離心洗滌處理，作一定稀釋度分離於平皿。如果是細菌，把後培養基按一定濃度加入到菌體沉澱物中，振盪培養1.5-2h，經2-3次細胞分裂，再塗平皿。

處理完畢後，馬上把接觸過NTG的器皿用NaOH浸泡處理。

NTG除以上直接以溶液處理外，還可以按以下方法誘變處理，搖瓶振盪處理：在接菌後的培養基中加人5-10 ug/ ml NTG．並加幾滴吐溫60或吐溫80，使成乳化狀（注意吐溫對該菌生長是否有影響）；在平皿上生長過程處理：如果將NTG、瓊脂和菌體混合製成平板，NTG濃度為10-50 ug/ ml。或將瓊脂培養基製成平板．然後將NTG和菌體混合塗抹平析，此時NTG濃度為10-20 ug/ ml。

經後培養的培養液．除部分進行平皿分離外。剩餘的培養液可以加人適量的葯物，保存於冰箱內數天。如日本有人把經過NTG處理後的大腸桿菌培養液，用50％甘油（最終濃度為12.5％）於-40℃、-80℃保存。在以後數天內隨時可取出融化，稀釋分離，突變體死亡很少。

據報道．無論是用輻射處理，還是用化學誘變劑處理後的菌懸液或後增養液，浸在冰浴中2-3h，試驗的重復性很好。認為在大腸桿菌、枯草桿菌和放線菌等可以採取這一措施來提高誘變效果。

NTG是一種強烈致癌物質，操作時要帶橡皮手套，穿工作服，帶口罩，用稱量瓶稱量，最好在通風櫥中進行。凡接觸過NTG的器皿必須及時、單獨處理，例用自來水大量沖洗或用1-2N的NaOH浸泡過夜，洗凈。

2．甲基磺酸乙酯（簡稱EMS）

甲基磺酸乙酯是磺酸酯類中誘變效果較好的一種烷基化合物，外觀呈粉末狀或無色液體，難溶於水，不穩定，易水解成無活性物質。

EMS的誘變處理方法：

① EMS 母液的配製：為了安全和防上失效，配製前將需用的器皿，置冰箱內預冷，然後在冰浴中進行配製。取0.5ml EMS原液，加人到10 ml pH7.2磷酸緩沖液中，加蓋，並輕輕轉動試管。由於在水溶液中易失效，故盡可能低溫保藏，並要現用現配。

②取新鮮的菌體，經前培養至對數期．離心洗滌，用緩沖液製成8 ml菌懸液（107-108ml-1）。對於絲狀菌孢子，則前培養至萌動期，懸液含 106 ml-1。

③取EMS母液2ml，加人到以8ml的菌懸液中。在適宜溫度下處理一定時間（根據預實驗緒果確定）。處理的最終濃度為0 .lmol／L。對於真菌孢子，則為0.2-0.5rnol／L。

④EMS處理一定時間後，用50倍生理鹽水稀釋或加入一定量的2%NaS2O3溶液或多次離心、洗滌，以終止反應。

EMS是劇毒的誘變劑，在整個誘變過程，包括配製葯品、操作處理、保存等都要嚴守安全，不能接觸皮膚，所有接觸過EMS的器皿，單獨用大量水沖洗洗滌，或用10％NaS2O3溶液浸泡過夜，再用清水沖洗干凈。

三、脫氨劑

亞硝酸是一稀常用的誘變劑，毒性小．不穩定，易揮發．其鈉鹽易在酸性緩沖液中產生NO和NO2

（一）亞硝酸的誘變機制

脫去鹼基中的氨基變成酮基，引起轉換而發生變異。A→H，C→U，G→X。 A：T→G：C和G：C→A：T。亞硝酸的誘變也可以發坐回復突變。

亞硝酸除了脫氨基作用外，還可引起DNA交聯作用，DNA復制，從而導致奕變。

（二）亞硝酸的處理方法

1．試劑的配製

（1）1mol／L pH4.5醋酸緩沖液

（2）0.1mol／L亞硝酸鈉溶液

（3）0.07mol／L pH8.6磷酸氫二鈉溶液

以上試劑用前均要滅菌。

2．處理方法

取孢子懸液1 ml，pH4.5醋酸緩沖液2ml及硝酸鈉溶液lml，最後處理濃度為0.025 mol／L ；25-26℃保溫10-20min，加入的磷酸氫二鈉溶液 20 ml，使出下降至pH 6. 8左右，以終止反應。稀釋分離於平板。

如果是處理細菌，亞硝酸最後濃度以0.05 mol／L。

在亞硝酸處理菌體或孢子時要嚴格控制好溫度，否則會影響誘變效果。

四、移碼誘變劑

移碼誘變劑與DNA相互結合引起鹼基增添或缺失而造成突變。它們主要包括吖啶黃、吖啶橙、ICR－171、ICR-191等。移碼誘變劑對噬菌體有強烈的誘變作用，誘發細菌、放線菌的質粒脫落比其他誘變劑效果更為顯著。如某些產生抗生素的放線菌。用處理後，發現產量明顯下降，主要就是由於控制抗生素合成的質粒脫落造成的。

吖啶黃的性質和使用方法：

淡黃色晶體，微溶於熱水，溶於乙醇和乙醚，不穩定，見光易分解。

使用時，先用少許乙醇溶解，配成一定濃度的母液。通常處理方法是特它們加入培養基中，使最後濃度為10-50ug/ml，混合後製成平板，適溫培養，在生長過程中處理。另外還可將吖啶黃加人到培養液中，濃度為10-20 ug/ml ，在適溫條件下，振盪培養過程中處理。

五、羥化劑【以羥胺為例】

羥胺的簡稱HA，常以鹽酸羥胺形式存在，為白色晶體，溶於水，不穩定易分解，具腐蝕性。

1.羥胺的誘變機制

當羥胺濃度為0.1-1.0mol／L pH6.0時，主要與胞嘧啶反應，使羥化的C與A配對，在0.1-1.0mol／L pH9.0，羥胺可以與鳥嘧啶反應，10-3 mol／L時，羥胺可以與胸腺嘧啶、鳥嘌呤和尿嘧啶起反應。但據分析，羥胺與T、G反應的是它的產物，而不是它本身。此外，羥胺有時還能和細胞中其他物質作用產生過氧化氯，也具有誘變作用。

2．羥胺的處理方法

常用濃度為0.1％-5％，可直接在溶液中處理，時間1-2h，然後分離培養。但一般都加到瓊脂平板或振盪培養基中。然後接入孢 子或細菌，在適溫下培養，生長過程中處理．所用濃度比直接處理時低些。

六、金屬鹽類

用於誘變育種的金屬鹽類主要有氯化鋰、硫酸錳等。其中氯化理比較常用，與其他誘變劑復合處理，效果相當顯著。

氯化鋰稱之為助誘變劑，氯化鋰是白色粉末，易溶於水，使用時通常加到培養基中。

為了速免受破壞．倒平板時，當培養基溫度冷卻到50-60℃時才加入製成平板，然後把細菌或孢子塗布分離，處理終濃度為0.3％-1.5%。

七、其他化學誘變劑

1．秋水仙素

秋水仙鹼是誘發細胞染色休多倍體的誘變劑。秋水仙鹼的主要作用是破壞細胞有絲分裂過程中紡錘絲的形成。導致多倍體的產生。

2．抗生素

作為誘變劑的抗生素主要有鏈黑黴素、爭光黴素、絲裂黴素、放線菌素、光輝黴素和阿黴素等。這些抗生素都是抗癌葯物，它們在微生物育種中雖有應用，但效果不如烷化劑等誘變劑顯著，應用並不廣泛。一般不單獨使用，常與其他誘變劑一起復合使用。

八、直視化學誘變劑的操作安全

化學誘變劑多數是極毒的致癌葯品，在進行誘變操作後的處置以及誘變劑的保藏等方面的安全防護都是極其重要的。如有疏忽，就可能對健康和環境帶來惡果，萬萬不可麻痹。

⑻ 用語言表述誘變育種的一般流程圖

誘變育種的操作要點

（一）出發菌株的選擇
用來進行誘變的菌株稱為出發菌株。誘變育種的目的在於提高微生物代謝產物的產量、改進質暈或產生新的代謝產物。因此，選擇出發菌株對誘變效果尤為重要。
1.作為出發菌株疢對誘變劑敏感，變異幅度大。
2．從自然界分離到的野生型菌株，對誘變劑敏感，易發生正向突變。由自發突變經
篩選得到的菌株也屬於野生型菌株。
3.經誘變處理獲得的高產菌株再誘變時易出現負突變，繼續提高產量較難，不易直接作出發菌株。
4.選擇易於表現出基因發生改變的單倍體細胞，酵母菌二倍體細胞很穩定，應該挑選異宗接合的單倍體菌株或用子囊孢子進行誘變。
5.選擇單核或細胞核少的細胞，在黴菌的誘變育種中，多採用分生孢子或孢子囊孢
子進行誘變處理。

(二）細胞懸液的制備

1.採用生理狀態一致的單細胞或單孢子進行誘變處理，不可能使細胞均勻地接觸誘
變劑，還可以減少分離性表型延遲現象的發生。因此，誘變處理前的細胞應盡可能達到同步培養和對數生長期狀態。
2． 一般誘變處理真菌孢子或酵母菌營養細胞，其細胞懸液濃度應為106個/ml而細菌營養細胞或放線菌孢於濃度為108個/ml，細胞懸液濃度可用平板計數法和血球計數板法測定。
3.一般情況，使用物理誘變劑處理時，用生理鹽水配製細胞懸液；而使用化學誘變劑處理時，由於pH變化易引起誘變劑性質的改變而都使用緩沖液配製細胞懸液。

(三）誘變劑和處理方法的選擇

1.誘變劑的選擇 對誘變劑的要求是使遺傳物質改變大，難於產生回復突變，這樣獲得的突變株突變性狀穩定。亞硝基胍(NTG)和甲基磺酸己酯(EMS)等烷化雖能引起高頻度的變異，但它們多是引起鹼基對轉換突變，易發生回變；而能引起染色體大損傷或移碼的紫外線、γ-射線等誘變劑，其有優越性能。

2.誘變劑量的選擇 選擇最適誘變劑量，也就是在提高突變率的基礎上，即能擴大變異幅度，又能使變異向正向突變范圍移動的劑量。研究方向正向突變多出現在偏低劑量中，形態變異多發生在偏高劑量中，而一般形態變異多趨向於降低產量。
3.誘變處理方法的選擇
（1）紫外線與光復活的交替處理 能使紫外線誘變作用得到顯著增強。多次紫外線照射後，並在每次照射後進行-次光復活，突變率將大大提高。
（2）誘變劑的復合處理有一定的協同效應，復合處理有以下幾種方式：兩種或多種
誘變因子先後使用；同—種誘變劑重復使用；兩種或兩種以上誘變劑的交替使用等。

(四）中間培養

突變基因的出現並不意味著突變表型的出現，表型的改變落後於基因型改變的現象，稱為表型延遲。其原因是分離性延遲和生理性延遲造成的。為此，必須將誘變處理的菌液進行中間培養，即將菌液接入完全液體培養基中培養過夜。

（五）突變株的分離
1.營養缺陷性菌株的分離

（1）淘汰野生型、濃縮缺陷型
（2）缺陷菌株的檢出
（3）營養缺陷型的鑒定

2.抗性突變菌株的分離
（1）抗葯性突變株的分離
（2）抗代謝結構類似物突變菌株的分離

3.產量性狀突變的分離

⑼ 產油真菌的誘變育種

紫外誘變和微波誘變是較常用的物理誘變方法，
它們操作簡單，對設備要求不高，不需要昂貴的設備，
比較適合基層單位進行誘變育種。本文就這兩種方法
對不同多不飽和脂肪酸誘變效果進行比較研究，為采
用這兩種方法進行產油菌株誘變育種提供一些依據
1 試驗材料與方法
1．1 實驗材料
1．1．1 菌株
本實驗室分離並保存。
FR3，刺孢小克銀漢霉(Cunninghamella echinulata)；
AGEDm59、AGEDm 95為菌株AGED激光誘變
株，多形單毛孢(Monoblepharispolymorpha Comu)。
其中FR37-~][麻酸含量、AGEDm59花生四稀酸含
量、AGEDm 95二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸含量
較高。
1．1．2 實驗儀器
超凈工作台、格蘭氏微波爐、索氏抽提器、粉碎機、電子天平；
氣相色譜儀：福立9790氣相色譜儀，CT-IA氮、
氫、空氣發生器(武漢科林分析技術研究所)，GPI一2
氣體凈化器(福立儀器)。
1．1．3 試驗試劑
乙醚、石油醚、苯、甲醇、氫氧化鉀；
GLA 甲脂、AA甲脂、EPA甲脂及DHA 甲脂標准
品購白Sigma公司，其他試劑均為分析純。
1．1．4 培養基
斜面培養基為PDA 培養基；種子和發酵培養基
為PDY液體培養基。
1．2 試驗方法
1．2．1 孢子懸液的制備
FR3取7天種齡、AGEDm59、AGEDm 95取l0
天種齡的斜面菌株，用無菌水洗下孢子(並用接種針輕
刮表面)，FR3配成10一、AGEDm59、AGEDm 95配
成l0。濃度的孢子液。
1．2．2 誘變及保種
紫外誘變：先打開紫外燈照射30min，取0．5ml孢
子懸液到倒好DPA固體培養基的平皿中，塗布均勻，
放在紫外燈下(紫外燈為25W，照射距離為35cm)
照射，之後置於25℃避光24h培養。隨機挑取單菌落
於斜面中保存。
微波誘變：由於微波照射會產生熱效應，因此在進
行微波誘變時採用了間歇性照射【6】，即先照射一段時
間後進行冷卻，再照射，照射時間為各次照射時間的
累加。250mi三角瓶裝100ml經過活化的孢子懸液(即
先在150r／min的搖床上振盪5h)【7】，用中等強度功率
照射，每次照射的時間為l0秒，隨機挑取的誘變株都
保存於斜面中。
1．2．3 菌絲培養和收獲
把長好的誘變株從斜面轉到500ml三角瓶中(內
裝200mlPDY液體培養基)，置於25℃ 中l50轉／分鍾
搖床上培養。FR3培養4天，AGEDm59、AGEDm 95
培養6天後下樣，用濾布過濾獲得濕菌絲體。將所得
濕菌絲體在36℃烘箱內烘乾，稱重，計算生物量；
1．2．4 油脂提取及甲脂化
將干菌體粉碎，並用脫脂濾紙包好，用100ml乙
醚在43~C進行索氏提取6h，回收溶劑，用N2吹走殘
留溶劑稱重，計算粗油脂量。油脂甲脂化的方法見參考
文獻
1．2．5 氣相色譜分析條件
色譜柱：FFAP交聯石英毛細管柱(0．25mmx 0．25
pmx30m)；檢測器：氫火焰檢測器(FID)；載氣：N2(流量60 mLlmin)：溫度：進樣器溫度160℃ ，檢測器溫
度240℃；柱溫：160℃升至200℃ (8℃／rnin)，繼續升
至220℃ (2℃／min)，恆溫7min，降至160℃ 。
1．2．6 多不飽和脂肪酸含量分析
用微量進樣器吸取l 上層清液進樣分析，對照
標准品保留時間進行定性，由面積歸一化法確定相對
百分含量。
2 結果與分析
紫外誘變中不同致死率對誘變的效果影響較大，
據報道，在致死率為75～80％之間誘變的效果最好I9J，
3株菌株從致死率為75～80％的照射劑量中共獲得105
株紫外誘變株，其中F 為2l株，AGEDm59為58
株， AGEDm95為26株。
微波誘變中致死率對誘變效果的影響不同的研究
有不同的結果，本實驗採用的致死率為40~60％【l0】，
從3株菌中共獲得78株微波誘變株，其中FR3為27
株，AGEDm59為25株， AGEDm95為26株。
2．1 生物量
從表l的生物量看，AGED系列2株菌紫外誘變
的正誘變率遠高於微波誘變，對菌株FR3而言微波誘
變正誘變率略高於紫外誘變。從生物量的平均提高率
和最大提高率上也得到同樣的結果，但提高的幅度不
大，只有菌株FR3微波誘變的最大提高率和AGEDm59
紫外誘變的最大提高率超過10％，分別達到10．29％
和l3．87％ 。
從結果分析來看，兩種誘變方法均不能大幅度提
高生物量。
2．2 油脂產量
從表2可看出，在油脂產量正誘變率、平均提高
率和最大提高率上微波誘變比紫外誘變有顯著提高。
除了AGEDm59兩種誘變效果比較接近外，其它的兩
株菌的平均提高率和最大提高率微波誘變比紫外誘變
幾乎提高2倍以上，而且微波誘變的最大提高率比較
穩定，都在20％左右。
從結果分析來看，採用微波誘變來提高油脂產量
可以取得較好的效果。

⑽ 微生物育種的誘變育種

1.1物理誘變
1.1.1紫外照射
紫外線照射是常用的物理誘變方法之一，是誘發微生物突變的一種非常有用的工具。DNA 和RNA 的嘌呤和嘧啶最大的吸收峰在260nm，因此在260nm 的紫外輻射是最有效的致死劑。紫外輻射的作用已有多種解釋，但比較確定的作用是使DNA 分子形成嘧啶二聚體[1]。二聚體的形成會阻礙鹼基間正常配對，所以可能導致突變甚至死亡[2]。
紫外照射誘變操作簡單，經濟實惠，一般實驗室條件都可以達到，且出現正突變的幾率較高，酵母菌株的誘變大多採用這種方法。
1.1.2電離輻射
γ- 射線是電離生物學上應用最廣泛的電離射線之一，具有很高的能量，能產生電離作用,可直接或間接地改變DNA 結構。其直接效應是可以氧化脫氧核糖的鹼基，或者脫氧核糖的化學鍵和糖- 磷酸相連接的化學鍵。其間接效應是能使水或有機分子產生自由基，這些自由基可以與細胞中的溶質分子發生化學變化，導致DNA 分缺失和損傷[2]。
除γ- 射線外的電離輻射還有X- 射線、β- 射線和快中子等。電離輻射有一定的局限性，操作要求較高，且有一定的危險性，通常用於不能使用其他誘變劑的誘變育種過程。
1.1.3離子注入
離子注入是20 世紀80 年代初興起的一項高新技術，主要用於金屬材料表面的改性。1986 年以來逐漸用於農作物育種，近年來在微生物育種中逐漸引入該技術[3]。
離子注入時，生物分子吸收能量，並且引起復雜的物理和化學上的變化，這些變化的中間體是各類活性自由基。這些自由基，可以引起其它正常生物分子的損傷，可使細胞中的染色體突變，DNA 鏈斷裂，也可使質粒DNA 造成斷裂。由於離子注入射程具有可控性，隨著微束技術和精確定位技術的發展，定位誘變將成為可能[4]。
離子注入法進行微生物誘變育種，一般實驗室條件難以達到，目前應用相對較少。
1.1.4 激光
激光是一種光量子流，又稱光微粒。激光輻射可以通過產生光、熱、壓力和電磁場效應的綜合應用，直接或間接地影響有機體，引起細胞染色體畸變效應、酶的激活或鈍化，以及細胞分裂和細胞代謝活動的改變。光量子對細胞內含物中的任何物質一旦發生作用，都可能導致生物有機體在細胞學和遺傳學特性上發生變異。不同種類的激光輻射生物有機體，所表現出的細胞學和遺傳學變化也不同[5]。
激光作為一種育種方法，具有操作簡單、使用安全等優點，近年來應用於微生物育種中取得不少進展。
1.1.5 微波
微波輻射屬於一種低能電磁輻射，具有較強生物效應的頻率范圍在300MHz~300GHz，對生物體具有熱效應和非熱效應。其熱效應是指它能引起生物體局部溫度上升。從而引起生理生化反應；非熱效應指在微波作用下，生物體會產生非溫度關聯的各種生理生化反應。在這兩種效應的綜合作用下，生物體會產生一系列突變效應[6]。
因而,微波也被用於多個領域的誘變育種，如農作物育種、禽獸育種和工業微生物育種，並取得了一定成果。
1.1.6 航天育種
航天育種，也稱空間誘變育種，是利用高空氣球、返回式衛星、飛船等航天器將作物種子、組織、器官或生命個體搭載到宇宙空間，利用宇宙空間特殊的環境使生物基因產生變異，再返回地面進行選育，培育新品種、新材料的作物育種新技術。空間環境因素主要有微重力，空間輻射，以及其它誘變因素如交變磁場，超真空環境等，這些因素交互作用導致生物系統遺傳物的損傷，使生物發生諸如突變、染色體畸變、細胞失活、發育異常等。
航天育種較其它育種方法特殊，是航天技術與微生物育種技術的有機結合，技術含量高，成本高，個體研究者或一般研究單位都難以實現，只能與航天技術相結合，由國家來完成。
1.1.7 常壓室溫等離子體誘變育種
常壓低溫等離子體（Atmospheric and Room Temperature Plasma）簡稱為ARTP，指能夠在大氣壓下產生溫度在25-40 °C之間的、具有高活性粒子（包括處於激發態的氦原子、氧原子、氮原子、OH自由基等）濃度的等離子體射流。ARTP技術作為一種新型的物理方法，在微生物誘變育種領域有著廣闊的應用前景。
等離子體中適當劑量的活性粒子作用於微生物，能夠使微生物細胞壁/膜的結構及通透性改變，並引起基因損傷，菌株出現遺傳物質損傷後，微生物啟動SOS修復機制，其誘導產生DNA聚合酶Ⅳ和V，它們不具有3ˊ核酸外切酶校正功能，於是在DNA鏈的損傷部位即使出現不配對鹼基，復制仍能繼續前進。在此情況下允許錯配可增加存活的機會。ARTP對遺傳物質造成的損傷，多樣性較高；又SOS誘導修復本身為容錯性修復，因此，ARTP多樣性的損傷將可能在修復過程中包容於DNA鏈中，在微生物進行復制修復時，其可能帶來多樣性的錯配可能。
ARTP應用於微生物突變育種，成本低、操作方便，沒有很多物理誘變設備（如離子束注入等）所需的離子或電子加速、真空和製冷等附屬設備；ARTP對遺傳物質的損傷機制多樣，具有較高的正突變率，突變性能多樣，對於真菌、細菌、藻類等都有效果；ARTP對環境無污染，保證操作者的人身安全，無論用何種氣體放電，其均無有害氣體產生。