轉基因動物有哪些建立方法

⑴ 轉基因有幾種方式

幾種常用的植物轉基因方法

遺傳轉化的方法按其是否需要通過組織培養、再生植株可分成兩大類，第一類需要通過組織培養再生植株，常用的方法有農桿菌介導轉化法、基因槍法；另一類方法不需要通過組織培養，目前比較成熟的主要有花粉管通道法。

1．農桿菌介導轉化法

農桿菌是普遍存在於土壤中的一種革蘭氏陰性細菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數雙子葉植物的受傷部位，並誘導產生冠癭瘤或發狀根。根癌農桿菌和發根農桿菌中細胞中分別含有Ti質粒和Ri質粒，其上有一段T-DNA，農桿菌通過侵染植物傷口進入細胞後，可將T-DNA插入到植物基因組中。因此，農桿菌是一種天然的植物遺傳轉化體系。人們將目的基因插入到經過改造的T-DNA區，藉助農桿菌的感染實現外源基因向植物細胞的轉移與整合，然後通過細胞和組織培養技術，再生出轉基因植株。

農桿菌介導法起初只被用於雙子葉植物中，近年來，農桿菌介導轉化在一些單子葉植物（尤其是水稻）中也得到了廣泛應用。

2．基因槍介導轉化法

利用火葯爆炸或高壓氣體加速（這一加速設備被稱為基因槍），將包裹了帶目的基因的DNA溶液的高速微彈直接送入完整的植物組織和細胞中，然後通過細胞和組織培養技術，再生出植株，選出其中轉基因陽性植株即為轉基因植株。與農桿菌轉化相比，基因槍法轉化的一個主要優點是不受受體植物范圍的限制。而且其載體質粒的構建也相對簡單，因此也是目前轉基因研究中應用較為廣泛的一種方法。

3．花粉管通道法

在授粉後向子房注射合目的基因的DNA溶液，利用植物在開花、受精過程中形成的花粉管通道，將外源DNA導入受精卵細胞，並進一步地被整合到受體細胞的基因組中，隨著受精卵的發育而成為帶轉基因的新個體。該方法於80年代初期由我國學者周光宇提出，我國目前推廣面積最大的轉基因抗蟲棉就是用花粉管通道法培育出來的。該法的最大優點是不依賴組織培養人工再生植株，技術簡單，不需要裝備精良的實驗室，常規育種工作者易於掌握。

常用的動物轉基因技術

1．顯微注射法

在顯微鏡下，用一根極細的玻璃針（直徑1-2微米）直接將DNA注射到胚胎的細胞核內，再把注射過DNA的胚胎移植到動物體內，使之發育成正常的幼仔。用這種方法生產的動物約有十分之一是整合外源基因的轉基因動物。

2．體細胞核移植方法

先在體外培養的體細胞中進行基因導入，篩選獲得帶轉基因的細胞。然後，將帶轉基因體細胞移植到去掉細胞核的卵細胞中，生產重構胚胎。重構胚胎經移植到母體中，產生的仔畜百分之百是轉基因動物。

⑵ 常用的轉基因動物的方法有哪些

1)基因打靶

基因打靶是將基因從「基因槍」里直接打入靶細胞。用特殊物質將目的基因包裹起來，然後像槍子彈一樣，直接打入靶細胞。

好處：操作方便

壞處：基因進入方式太暴力，且對目的細胞的細胞膜有機械損傷，成功率低，在萬分之一一下。

2）顯微注射

這是目前較為成熟，應用也最廣的一種了。通過顯微操作儀，直接將目的基因注射到細胞核里。

好處：操作也較方便，顯微操作儀也不貴，十幾萬左右。

壞處：還是太暴力，成功率也不高，比基因打靶要高，在萬分之一左右。

3）病毒轉染

這是目前大家看好的一種，將目的基因導入滅活或者無毒性的病毒內，通過病毒所特有的方式，將目的基因整合到目的細胞的染色體組或者導入細胞核里。

好處：成功率高，在百分之一以內。

壞處：操作不方便，且病毒大多數具有感染性切有致病、致命性，很難被公眾接受。

4）性原細胞導入

這是一種新型的轉基因方法，是將目的基因導入性原細胞（這些細胞將來時發育成生殖細胞的），那麼，由這些性原細胞發展而來的生殖細胞就也具有這個目的基因。

好處:成功率高，在九成以上。

壞處：成本高，操作要求高，周期長。

注意：以上成功率指的是基因導入的成功率，不是基因表達的成功率，實際上基因表達的成功率比基因導入的成功率還要低很多。

⑶ 轉基因小鼠的制備方法

「轉基因小鼠的制備技術主要有兩類，DNA原核顯微注射法和胚胎幹細胞囊胚顯微注射法。

DNA原核顯微注射法 通過顯微操作儀將外源基因直接注入受精卵,使外源基因整合到DNA中,發育成轉基因動物。

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⑷ 轉基因動物的制備方法有哪些

根據外源基因導入的方法和對象的不同，製作轉基因動物的方法主要有顯微注射法、反轉錄病毒法、胚胎幹細胞（embryonic stem cell，ES細胞）法、電脈沖法、精子載體導入法等。

1、顯微注射

是最常用且成功率較高的方法。基因顯微注射法的特點是外源基因的導入整合效率較高，不需載體，直接轉移目的基因，目的基因的長度可達lOOkb（10萬個鹼基對）。

它可直接獲得純系，所以實驗周期短。但需要貴重精密儀器，技術操作難度大，並且外源基因的整合位點和整合的拷貝數都無法控制，易造成宿主動物基因組的插入突變，引起相應的性狀改變，重則致死。

2、反轉錄病毒感染法

該法整合率較高，目的基因不易破壞，多是單拷貝、單位點整合，適合於難以觀察到原核的禽類受精卵。由於病毒衣殼大小的限制，目的基因不宜超過10kb，否則影響活性和穩定。此外，病毒DNA可能影響外源基因在宿主動物的表達。

3、胚胎幹細胞法

胚胎幹細胞（ES細胞）指從囊胚期的內細胞團中分離出來的尚未分化的胚胎細胞，具有發育全能性，能進行體外培養；擴增、轉化和製作遺傳突變型等遺傳操作。

本法外源基因整合率高，植入囊胚前篩選合適的轉化的ES細胞，克服了以前只能在子代選擇的缺點，並能充分利用分子生物學發展起來的各種先進方法，是很有前途的技術。缺點是不易建立ES細胞系。並且由於通過嵌合體途徑，所以實驗周期長。

4、電脈沖法

電脈沖法（electroporation）又稱電穿孔法，是將供體DNA與受體細胞充分混勻，在外界的高電壓短脈沖下改變細胞膜結構，使細胞膜產生瞬間可逆性電穿孔，從而使一定大小的DNA可以通過細胞膜進入細胞，運送到細胞核。

5、精子導入法

利用精子作為外源基因載體，藉助受精作用把外源基因導入受精卵，整合到受精卵的基因組中，稱之為精子載體導入法，是構建轉基因動物的一種新嘗試。

該法簡單、方便，依靠生理受帶過程，免去了對原核的損傷。但在實踐中成功率較低，對於精子是否可作為外源DNA載體也存在爭論。這項技術尚處在探索階段。該法可以將人工授精、體外受精與轉基因結合起來。

安全管理

在我國，先後頒布了《農業轉基因生物安全管理條例》、《農業轉基因生物安全評價管理辦法》等法律法規。在管理范圍、安全性評價、管理措施等方面做了一系列規定，以確保使用安全。

轉基因技術正在領導一場新的農業科技革命。我國公眾對轉基因技術和轉基因食品還存在一些疑慮，應該採用多種形式進行普及生命科學知識的教育，使公眾對轉基因技術有一個較為科學的認識，主動地接受轉基因食品。使轉基因技術貼近民眾，造福於人類。

以上內容參考：網路-轉基因動物、網路-動物轉基因技術

⑸ 轉基因動物是怎麼產生的

顯微注射DNA的方法是對單細胞的胚胎進行基因操作，涉及復雜的操作步驟。首先是要准確掌握母畜的性周期，在此基礎上加以人工調節，使母畜在預先確定的時間排卵，保證獲得大量的剛剛受精的單細胞胚胎。第二步是用手術或非手術的方法收集單細胞胚胎，經短暫的離心處理後，放在顯微鏡下用口徑1微米玻璃微管向細胞核注射500～600拷貝基因。然後把經過DNA注射的胚胎移植到另外一頭處於相同性周期的母畜的體內。經過這樣處理後，在後代中就會出現1%～3%的轉基因動物。效率雖然不高，但結果相當穩定。全世界已在各種動物身上進行了上萬次的試驗，都能生產出轉基因動物。

⑹ 轉基因動物的培育流程包括…………

1.目的基因的獲得，牽扯到很多，比如序列的獲得，引物的設計，T載體的轉化，測序等等。
2.表達載體重組子的構建。將你獲得的目的基因克隆到表達載體上，比如說PBI121等，利用限制性酶切位點，體外連接等。
3.表達載體重組子轉化農桿菌中。
4.農桿菌與植物葉片或者其他組織共培養，轉化植物
5.抗生素篩選。一般農桿菌共培養四天後用含有抗生素的培養基篩選。
6.組培苗的獲得，煉苗。
7.轉基因植株的檢測，如PCR檢測，Southern/Northern雜交等。

⑺ 動物轉基因技術

轉基因動物是指以實驗方法導入外源基因，在染色體組內穩定整合並能遺傳給後代的一類動物。

自1981年，第一次成功地將外源基因導入動物胚胎，創立了轉基因的動物技術。1982年獲得轉基因小鼠。轉入大鼠的生長激素基因，使小鼠體重為正常個體的二倍，因而被稱為"超級小鼠"。以後相繼在10年間報道過轉基因兔、綿羊、豬、魚、昆蟲、牛、雞、山羊、大鼠等轉基因動物的成功。

由於轉基因動物體系打破了自然繁殖中的種間隔離，使基因能在種系關系很遠的機體間流動，它將對整個生命科學產生全局性影響。因此轉基因動物技術在1991年第一次國際基因定位會議上被公認是遺傳學中繼連鎖分析、體細胞遺傳和基因克隆之後的第四代技術，被列為生物學發展史上126年中第14個轉折點。

生物體細胞中的DNA能精確合成並防止被DNA酶降解是由於存在由限制酶與修飾酶組成的生物屏障。一般情況下，限制酶能將外源DNA切割並降解掉，而細胞本身合成的DNA由於修飾酶的甲基化作用而避免了被限制酶降解從而保持遺傳穩定性。但是，偶然也會發生外源DNA倖免降解的情況，使生物體產生小的變異。轉基因技術就是利用生物這一特性，把外源基因注入細胞核而獲得符合要求的轉基因動物。

轉基因動物生產主要步驟包括目的基因的選擇，這應視生產目的而定；將重組基因轉入受精卵，常使用的方法有顯微注射法、反轉錄病毒感染法、胚胎幹細胞法、精子載體法、脂質體法等，將轉入了外源基因的受精卵植入同期發情的受體動物，在植入前完成整合胚胎的檢測、篩選、建立ES細胞系；對出生後基因整合、表達情況進行檢測，對整合、表達的轉基因動物進行育種試驗，建立由成功轉基因個體或群體組建的轉基因系。

轉基因的方法主要有4類：1）融合法，包括細胞融合，微細胞介導融合等；2）化學法，包括DNA-磷酸鈣沉澱法、DEAE-葡聚糖法、染色體介導法等；3）物理法，包括顯微注射法、電脈沖法、細胞凍存法等；4）病毒感染法，包括重組DNA病毒感染、重組RNA病毒感染等。

動物轉基因技術面臨著一些問題，諸如生產效率低，基因整合效率不高，生產周期長，成本高，轉基因動物死亡率高，常出現不育導致轉基因難以傳代，無法大規模生產。

動物克隆技術屬於無性繁殖范疇，能實現基因型復制，使少數優秀個體迅速擴大成群。轉基因克隆技術是轉基因技術和動物克隆技術的有機結合，其研究意義和實用價值又超過了兩種技術。它以轉基因細胞為核供體，採用體細胞核移植技術產生轉基因克隆動物，實現種質創新。

⑻ 成熟穩定生產轉基因動物的方法有幾種

轉基因動物技術的核心，是把遺傳的功能單位──基因轉移到動物體內，使它成為動物體內的一部分。被轉移的基因可以來自同種或異種動物，也可以來自植物或微生物。這樣一來，就打破了物種之間的界線，也可以說動物能與植物、微生物雜交了。不過目前的雜交是低水平的，只限於主管一兩個性狀的一兩個基因。隨著科學技術的發展，一次可以轉移的遺傳信息將越來越多，那時就可以實現真正意義上的動植物之間的雜交。從科學上講，這將是一個重大突破。

目前，世界上已報道了多種生產轉基因動物的方法，但真正成熟並可以穩定生產轉基因動物的方法只有兩種，即顯微注射DNA的方法和精子介導的基因轉移法。

⑼ (多選)轉基因小鼠可以用以下方法進行。

轉基因小鼠的制備技術主要有兩類，DNA原核顯微注射法和胚胎幹細胞囊胚顯微注射法。

DNA原核顯微注射法

通過顯微操作儀將外源基因直接注入受精卵，使外源基因整合到DNA中，發育成轉基因動物。此方法是最經典的轉基因動物製作方法，也是應用最廣泛的方法，轉基因動物研究大都是在Palmiter等方法的基礎上有所改進而進行的。由這種方法制備的動物品種屬於狹義的轉基因動物的范疇。

由這種方法制備的轉基因小鼠其插入目的基因的形式通常是多拷貝首尾相連的形式，其整合到基因組的具體機制並沒有完全研究清楚。

胚胎幹細胞囊胚顯微注射法

在體外將外源基因導入胚胎幹細胞，然後將轉基因的胚胎幹細胞通過顯微操作儀注入動物囊胚，此胚胎幹細胞可參與宿主的胚胎構成，形成嵌合體，直至達到種系嵌合。胚胎幹細胞體外培養時保持未分化狀態，當被注入囊胚腔後，可以參與包括生殖腺在內的各種組織嵌合體的形成，因此將外源DNA導入胚胎幹細胞就可實現基因的轉移。出生的動物其生殖系統就可能整合上外源基因，通過雜交繁育可得到具有純合目的基因的個體，即轉基因動物。胚胎幹細胞介導法在小鼠上應用比較成熟，在大動物上應用較晚。基因的敲除及捕獲常用這類方法。

⑽ 2. 鑒定轉基因動物的方法有哪些

一、植物的遺傳轉化

20世紀70年代末80年代初，人們用野生型Ri和Ti質粒轉化煙草和馬鈴薯細胞獲得再生植株後，以Ti質粒為載體的植物遺傳轉化技術隨之被建立。近年來植物的遺傳轉化技術得到了迅速發展，建立了多種轉化系統。按照基因引入受體植物細胞的方法，植物遺傳轉化技術大體可分為兩類：以載體為媒介的基因轉移和基因或DNA的直接轉移。所謂以載體為媒介的基因轉移就是將目的基因連於某一載體DNA上，然後通過寄主感染受體植物等途徑將外源基因轉入植物細胞的技術。DNA的直接轉移是指利用植物細胞生物學特性，通過物理、化學和生物學方法將外源基因轉入植物細胞的技術。

（一）載體法轉化 農桿菌介導的轉化是最主要的一種載體轉化方法。利用經過改造的農桿菌Ti質粒為載體可以高效地轉移外源基因。所獲得的轉化植物有兩種基本方法：一種是1979年Marton等以植物原生質為受體的共培養法（ocultivation）；一種是1985年Horsch等人建立的葉盤法（leaf disc cocultivation）。

共培養法是把農桿菌與植物原生質體共同培養以實現轉化的方法。其程序包括農桿菌對初生細胞壁的原生質體的轉化、轉化細胞的篩選和誘導轉化細胞分化並再生植株。

葉盤法實際上是對共培養法加以改進後而創立的一種轉化方法。用農桿菌感染葉片外植體並短期共培養。在培養過程中，農桿菌的vir基因被誘導，它的活化可以啟動T-DNA向植物細胞的轉移。共培養後，也要進行轉化的外植體的篩選、愈傷組織的培養、誘導分化等步驟，以得到再生植株。葉盤法由於不需進行原生質體操作等，方法簡單，獲得轉化植株也更快，是用植物外植體為材料進行轉基因的一個良好途徑。

農桿菌介導的遺傳轉化是大多數雙子葉植物轉化中常採用的方法，但由於農桿菌具有宿主局限性，極少能感染單子葉植物，特別是一些重要的農作物如水稻、小麥、玉米等對農桿菌不敏感，難於應用此法進行遺傳轉化。

除上述以Ti質粒為載體的基因轉化外，還可以用脂質體（liposome）為載體進行遺傳轉化。脂質體是由磷脂組成的膜狀結構，因此可將DNA分子包裝在脂質體內以避免受體細胞DNase的降解，把DNA分子導入到植物的原生質體中去。

（二）基因直接轉移的方法 這是指既不依賴於農桿菌，也不依賴其他載體或媒介的一些基因轉移方法。

1．電激和電注射法 電脈沖能改變細胞膜的透性。通過高壓電脈沖的電激穿孔作用把外源DNA引入植物原生質體的方法就稱為電激法（electroporation）。這種方法現已較廣泛地應用於單子葉和雙子葉植物以及動物的基因轉移，如20世紀80年代末用此法將新黴素磷酸轉移酶（NPT Ⅱ）基因轉入玉米自交系的原生質體，已再生成植株。

通過電激技術把基因直接引入完整的植物細胞或組織的方法，稱作電注射（electroinjection）。這種方法可避免原生質體培養和再生成植株的繁雜操作與困難，因而具有巨大的應用潛力。

2．基因槍法 基因槍法又稱粒子轟擊技術（particle bombardment）。這一方法是用粒子槍把表面吸附有外源DNA的金屬微粒高速地射進植物細胞或組織。由於此法快速簡便，不受宿主范圍限制，而受體植物細胞不需去除細胞壁，轉化率又高，被轉化的細胞或組織容易再生成植株，因而頗受關注。

3．微注射法 微注射法（microinjection）是利用顯微注射儀等，通過機械的方法將外源基因或DNA直接注入細胞核或細胞質。與其他方法相比，這個方法對外源遺傳物質的導入更為直接和有效。

微注射法除用於植物細胞外，近些年還發展到用於直接注射植物子房，這樣更有利於外源遺傳物質對幼胚的轉化。這方面的工作我國於20世紀70年代即已進行了理論與實踐的探索，並已獲得抗枯萎病的棉花轉化植株抗蟲棉等。

二、轉基因動物技術及其應用

（一）轉基因動物的概念 藉助基因工程技術把外源目的基因導入生殖細胞、胚胎幹細胞和早期胚胎，並在受體染色體上穩定整合，使之經過各種發育途徑得到能把外源目的基因傳給子代的個體，即轉基因動物（transgenic animal）。轉入的目的基因稱為轉基因（transgene），這種轉移目的基因的過程稱為轉基因作用（transgenesis）。關於「轉基因」的概念，通常只限於動、植物中經基因工程技術進行的基因轉移，因此品種間不論有性或無性雜交獲得新基因的途徑都不屬此范疇。

（二）轉基因動物技術 轉基因動物技術是20世紀80年代初發展起來的一項生物技術，它克服了物種之間的生殖隔離，實現了動物物種之間遺傳物質的交換和重組。根據外源基因導入的方法和對象的不同，至今主要有3種途徑可以產生轉基因動物，即顯微注射法、反轉錄病毒法和胚胎幹細胞法。反轉錄病毒轉移基因的基本方法在前面已有簡介，這里只介紹顯微注射法和胚胎幹細胞法兩種。

1．受精卵原核顯微注射法 顯微注射技術是從動物胚胎學研究移核實驗的基礎上發展而來。20世紀80年代初期人們利用這一方法向動物生殖細胞轉移外源基因，成功地建立了轉基因小鼠。1985年轉基因綿羊和轉基因豬問世，以後轉基因大鼠、兔、雞、牛、魚等都已陸續取得成功，可見顯微注射法是迄今應用得較為普遍而又最有成效的一種獲得轉基因動物的技術。

本方法是在顯微鏡下，用直徑約為1μm的玻璃管直接插入受精卵的雄原核內，將毛細管內所帶有的外源基因的DNA注入原核，然後將其移植到假孕母體輸卵管或子宮內並發育成子代個體。為了解轉基因的整合情況，可酌情應用斑點雜交、多聚酶鏈式反應或Southern印跡雜交等方法對子代個體DNA進行檢測。

顯微注射法的優點是導入的外源基因片段可長達50 kb，且無需載體，外源基因在宿主染色體上的整合率相對較高。其不足之處是外源基因的整合是隨機的，因而難以控制其整合率；再者，對外源基因能否穩定整合於受體基因組的檢測，必須等到子一代個體出生後經過選擇才能確定，不利於在生育期長、產仔少的大家畜中應用。

2．胚胎幹細胞介導法 胚胎幹細胞（embryonic stem cell，ES）是指從哺乳動物胚胎囊胚期內的細胞團中分離出來的尚未分化的胚胎細胞，這種細胞具有發育的多能性，能夠分化出各種組織。20世紀80年代中期人們開始研究利用ES細胞獲得轉基因動物的方法。這個途徑是將外源基因直接導入ES細胞，經體外培養篩選後再注入到受體囊胚腔中，與其中的囊胚細胞聚集在一起，成為受體胚胎的一部分，參與其分化。由這種胚胎發育而成嵌合體的轉基因動物，即其中有一部分組織來源於整合有外源基因的供體ES細胞。在嵌合過程中，被轉化的ES細胞分化而成的生殖細胞可通過雜交將引入的外源基因傳遞下去。

在以胚胎幹細胞為媒介獲得轉基因動物的技術中，既可以用多種方法將外源基因導入ES細胞，且細胞的鑒定、篩選比較方便，又可預先在細胞水平上測定外源基因的拷貝數、定位和表達的水平以及插入的穩定性等，而且將ES細胞注入囊胚的操作較易進行，整合率相對較高。只是建立ES細胞系本身就是一項難度極高的工作，目前小鼠ES細胞系雖已建立，但在豬、羊中還未能得到真正穩定的ES細胞株。

（三）轉基因動物的應用 轉基因動物的研究內容非常廣泛，20世紀80～90年代以來從基礎理論到應用技術在深度和廣度上都有了很大發展，並已日漸由實驗室走向生產實踐。

1．在基因表達調控研究方面的應用 利用轉基因動物可作為在體內研究外源基因表達調控的「反應器」，下面僅就DNA順式調控元件和基因在發育中的時空調節為例予以介紹。

（1）順式調控元件的研究 異常的脂蛋白水平與動脈粥樣硬化等疾病有關。人類有5種脂蛋白，各自含有不同的載脂蛋白。現已發現約有17種載脂蛋白，它們的編碼基因已測序，是用於研究心血管疾病的候選基因。把載脂蛋白基因轉入小鼠，可用來研究人脂蛋白代謝、調控以及動脈粥樣硬化。在研究載脂蛋白基因組織特異性表達的順式調控元件時，發現有兩簇載脂蛋白基因凋節的組織特異性表達（圖19-15）。一簇包括A－Ⅰ、C-Ⅲ和 A-Ⅳ基因，定位於人11號染色體長臂2區3帶（11q23），是按A－Ⅰ、C－Ⅲ、A－Ⅳ的順序組成。C－Ⅲ的轉錄方向與其他兩個基因相反。 A-Ⅰ和C-Ⅲ主要在肝和小腸中表達，A-Ⅳ主要在小腸表達。在 C-Ⅲ基因的-0.2～-1.4bp之間是調節 A－Ⅰ基因在小腸中表達的區域。這個區域也是 C－Ⅲ和A－Ⅳ基因在小腸表達的凋控元件，表明這一元件可以調節整個載脂蛋白基因簇在小腸的表達。另一基因簇定位於19號染色體長臂1區3帶（19q13），包含有E、C－Ⅰ和C-Ⅱ基因，它們按E、C－Ⅰ、C－Ⅱ順序排列。E基因主要在肝臟和大部分身體組織中表達，但表達水平低。以後發現在C－Ⅰ基因和C－Ⅱ基因之間有一調控區可使E基因在肝臟內高水平表達，該區長約154 bp。此外，還證實這個調控區也調節該座位其他兩個載脂蛋白基因 C－Ⅰ和 C－Ⅱ在肝臟的表達。的表達。

（2）與發育相關基因的表達與調控 用轉基因動物可研究基因在發育中的時空調控。珠蛋白基因是研究發育調控的最好例子。人類珠蛋白基因分為α、β兩簇，分別定位於16號和11號染色體，各長30kb和60kb。據1993年的報道，為分析完整的β-珠蛋白基因中人的珠蛋白基因的開關調控，Peterson等把一個含有248 kb長的人β-珠蛋白基因簇的酵母人工染色體（YAC）轉入小鼠。對轉基因小鼠中此基因簇的表達分析表明，在成年的轉基因動物中只有人β-珠蛋白表達；在子一代和子二代動物中證實YAC β座位有β樣珠蛋白基因的發育開關調控，即在卵黃囊中有ε-和γ-珠蛋白基因表達，在14天的肝臟中有少量γ和大量β表達，而在成年動物中則僅有β珠蛋白基因的mRNA表達。採用先在酵母細胞內通過同源重組的方式使YAC發生突變，然後把這種突變的YAC導入小鼠，就可以詳細研究整個座位上基因的調控機制，如珠蛋白基因在發育與分化中的基因表達、定點誘變的β基因對發育凋節的影響等等。

除前述有關基因表達凋控的研究外，把轉基因動物用於遺傳病動物模型的研製近年來發展也很快，如把pro-αⅠ膠原突變基因導入小鼠基因組，可產生類似人的骨發育不全症的轉基因小鼠，這對了解人類遺傳病的發病機理意義重大。

2．用於基因產品的制備

在轉基因動物中，導入的目的基因表達，人們就可以從該動物的乳汁和血液里獲得目的基因產物，因此，可把轉基因動物看作是一種個體表達系統（whole animal expression system），以制備某種基因產物。這樣的轉基因動物常被稱作動物生物反應器（animal bioreactor）。

1982年Palmiter把大鼠生長激素基因轉入小鼠，成功地獲得高效表達生長激素的小鼠，其體積明顯增加，證實了用轉基因動物生產外源基因產品的可行性。近年來的報道已證實在轉基因家畜（如豬）的乳腺中可高效合成自身不含有的異源蛋白，如乳清蛋白等。目前，英國正在研究通過羊β-乳球蛋白啟動子和乳清蛋白啟動子的控制，在轉基因羊體內表達人α1抗胰蛋白酶和凝血因子Ⅸ；在美國已有在轉基因小鼠、乳羊和乳牛乳汁中分別表達產生tPA和促性腺素的研究報道。我國利用轉基因動物為反應器生產基因製品的工作也在展開，最近有關單位已從轉基因羊乳汁中獲得促紅細胞生成素。

3．動物品種的培育與改良

把具有優良性狀的基因或抗病基因導入畜禽以培育新的品種，這是轉基因動物研究中的一個極重要的方面。如已培育出抗雞白細胞組織增生病毒的轉基因雞新品種。為增強魚類的抗凍性，已有抗凍蛋白基因在轉基因鮭魚中表達的報道。1985年我國學者朱作岩在國際上首次將小鼠MT／hGH融合基因注入金魚受精卵中，獲得轉基因金魚，其F1比轉基因魚的同代大兩倍。以後該類實驗中還陸續獲得其他鯽、鯉等幾種轉入生長激素基因的魚。

三、轉基因技術研究進展

（一）基因分離技術的發展 真核生物基因組非常大，巨遺傳背景常不清楚，要從這樣龐大的DNA中分離目的基因實非易事。但是由於生物化學、酶學、分子生物學等學科的迅速發展，為基因的分離提供了有效手段，如今已發展了一些新的分離目的基因的技術，如PCR、轉座子標簽法與基因組消減技術等。

1．轉座子標簽技術 基因發生轉座最重要的遺傳效應是引起插入突變，也就是使插入位置的基因失活並誘導產生突變型，或在插入位置上出現新基因。因此，可用轉座子作探針克隆出該突變基因，再用突變基因作探針，從野生型個體中分離並克隆出野生型基因。這種用轉座子來分離基因的技術稱為轉座子標簽技術（transposon tagging）（圖19－16）。這種技術的一個顯著特點是可以用來分離預先不清楚表達產物的基因。目前已可利用在分子水平上研究得較為清楚的轉座子系統如玉米的Ac／Ds、金魚草的Tam3等來分離異源植物的基因。

利用轉座子分離植物基因時，首先要構建含轉座子與質粒載體，因為已分離得到的轉座子與選擇標記需整合到適當的質粒基因組中才能用於目標植物的遺傳轉化。當前用於構建轉座子載體的質粒主要是根癌農桿菌的Ti質粒和pBR322等。其次是目標植物的遺傳轉化，現常用帶有載體系統的根癌農桿菌進行轉化。第三是轉座及拷貝數的檢測。最後是轉座子插入突變的檢測及分離。而對分離得到的突變體，還要證明其突變確系轉座子的插入所引起的。

近幾年，一些用傳統生化方法難以分離的基因已用轉座子標簽法分離出來，如金魚草中控制花瓣及雄蕊發育的基因，與花的發生、發育有關的基因，亞麻的抗銹基因等。美國、荷蘭等國也分別利用轉座子分離擬南芥菜種子中脂肪酸合成的基因和研究植物病原體的抗性。

2．基因組消減技術 基因組消減（genomic subtraction）技術是最近幾年在PCR基礎上發展起來的根據表型變異進行目的基因分離和鑒定的又一種方法，已被應用於動、植物中分離遺傳背景不十分清楚的基因，如在醫學研究中已將該技術用於分離和鑒定腫瘤缺失和重排基因、制備多態位點探針、分離遺傳性疾病基因和基因治療等領域。

運用消減雜交技術分離缺失序列的概念最早是由Buatz提出的，他利用T4噬菌體缺失突變株的DNA來分離相應缺失區域的mRNA並獲得成功。以後被許多實驗室引用並加以改進。1989年D．Stuars和L．Wieland分別將PCR技術引入消減雜交方法中，使基因組消減雜交技術得以推廣應用。這一技術的基本原理是先用γ射線等引起機體大片段DNA的缺失突變，然後用此突變體DNA與野生型DNA雜交，用以去除野生型中突變體的DNA。如此反復幾次，在反應體系中突變體DNA所缺失的那段親本DNA序列便被保留下來。採用生物素-親和素-磁珠系統或HAT結合生物素-親和素層析系統富集缺失這種序列並用PCR技術擴增。擴增的序列再用來與野生型基因文庫雜交，從而克隆到對應缺失性狀的基因（圖19-17）。

用基因組消減雜交技術目前已從擬南芥中成功地克隆到包含赤黴素GA1位點的基因。在醫學研究中也有通過基因組消減雜交技術克隆人染色體特異的基因探針的報道，如杜興式肌營養不良（chenne muscular dystrophy，DMD）和脈絡膜缺損（choroideremia）座位的探針。

（二）基因剔除技術 基因剔除（gene knock-out）技術又稱基因打靶技術（gene trageting），是20世紀80年代末發展起來的。這是利用同源重組的方法以建立基因定點滅活細胞系或獲得基因定點滅活動物。這一技術近年來應用於生物學的諸多研究領域，已獲得數百種基因定位缺陷小鼠。

基因剔除技術的原理首先是用基因重組方法在目的基因片段中插入一外源基因作為篩選標記基因並使目的基因失活（定點突變），再將此（滅活）基因轉入胚胎多能幹細胞（ES細胞）中，通過細胞內的基因同源重組使滅活基因取代染色體上原有的目的基因。經篩選和基因型鑒定後，把定點突變後的ES細胞注入宿主囊胚腔內，然後將胚胎植入假孕母體子宮，使其發育成目的基因缺陷（突變）的嵌合體，經子代自交後篩選出目的基因缺陷的純合子即基因剔除動物。

基因剔除的具體實驗步驟是：首先要進行同源重組載體的設計與構建，即選擇具有一定長度（5～7kb以上）與目的基因功能區域同源的序列，並插入選擇性標記基因（如新黴素抗性基因neo等），以便於篩選。在此同源序列的一端或兩端還可以連接上負篩選標志基因（如單純皰疹病毒胸苷激酶基因等）。用電轉染等方法將此同源重組載體轉染靶細胞。通過葯物抗性來篩選重組細胞克隆，並用PCR和Southern雜交等方法對重組細胞進行基因型鑒定，這時得到的就是單個等位基因被剔除的雜合子細胞。為建立等位基因雙剔除的細胞系，則還要將單個等位基因剔除的細胞大量傳代培養，然後在更高濃度的選擇性培養基中多次重復篩選，並對最終得到的陽性克隆進行基因型鑒定。

在應用上，通過探討目的基因突變在基因剔除動物個體發育中的時空效應以及分析體內單基因缺陷所產生的表型異常，可以研究基因功能和調控，建立疾病的動物模型和基因治療等。因此，在細胞水平進行基因剔除研究有非常重要的意義。如近幾年國外已報道建立了用於研究心血管疾病的載脂蛋白E（apoE）、低密度脂蛋白受體的基因剔除動物。

基因剔除細胞系的建立有可能直接發現特定基因剔除後的影響，闡明基因功能，制備基因缺失的細胞模型，用於發病機理或基因治療的研究。體細胞與ES細胞同源重組有所不同，後者一般只需將同源染色體等位基因之一滅活，就能在嵌合體後代中最終獲得純合的基因剔除動物。而在體細胞水平滅活特定基因就必須把一對等位基因都滅活，否則無法研究其功能。目前採用兩種方法都可成功地達到這一目的：一是用兩種帶有不同標記基因的同源重組載體分別對靶細胞進行兩次同源重組；另一是把單個等位基因滅活的細胞系傳代培養，提高標記基因產物抗葯物的濃度，利用標記基因表達的累加效應，篩選出細胞系中自然發生的雙等位基因被剔除的細胞克隆。