基因結構檢測方法

A. 如何用PCR方法檢測基因的多樣性

多態性（polymorphism）是指處於隨機婚配的群體中，同一基因位點可存在2種以上的基因型。在人群中，個體間基因的核苷酸序列存在著差異性稱為基因（DNA）的多態性(gene polymorphism)。這種多態性可以分為兩類，即DNA位點多態性(site polymorphism)和長度多態性 (longth polymorphism)。

基因多態性的主要檢測方法簡述如下：
1．限制性片段長度多態性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）：由DNA 的多態性，致使DNA 分子的限制酶切位點及數目發生改變，用限制酶切割基因組時，���鈉�問�亢兔扛銎�蔚某ざ染筒煌��此�降南拗菩雲�緯ざ榷嗵�裕�賈孿拗破�緯ざ確⑸�謀淶拿蓋形壞悖�殖莆�嗵�暈壞恪W鈐縭怯肧outhern Blot/RFLP方法檢測，後來採用聚合酶鏈反應（PCR）與限制酶酶切相結合的方法。現在多採用PCR-RFLP法進行研究基因的限制性片段長度多態性。

2．單鏈構象多態性（SSCP）：是一種基於單鏈DNA構象差別的點突變檢測方法。相同長度的單鏈DNA如果順序不同，甚至單個鹼基不同，就會形成不同的構象。在電泳時泳動的速度不同。將PCR產物經變性後，進行單鏈DNA凝膠電泳時，靶DNA中若發生單個鹼基替換等改變時，就會出現泳動變位（mobility shift），多用於鑒定是否存在突變及診斷未知突變。

3．PCR-ASO探針法（PCR-allele specific oligonucleotide, ASO）：即等位基因特異性寡核苷酸探針法。在PCR擴增DNA片段後，直接與相應的寡核苷酸探雜交，即可明確診斷是否有突變及突變是純合子還是雜合子。其原理是：用PCR擴增後，產物進行斑點雜交或狹縫雜交，針對每種突變分別合成一對寡核苷酸片段作為探針，其中一個具有正常序列，另一個則具有突變鹼基。突變鹼基及對應的正常鹼 基勻位於寡核苷酸片段的中央，嚴格控制雜交及洗脫條件，使只有與探針序列完全互補的等位基因片段才顯示雜交信號，而與探針中央鹼基不同的等位基因片段不顯示雜交信號，如果正常和突變探針都可雜交，說明突變基因是雜合子，如只有突變探針可以雜交，說明突變基因為純合子，若不能與含有突變序列的寡核苷探針雜交，但能與相應的正常的寡核苷探針雜交，則表示受檢者不存在這種突變基因。若與已知的突變基因的寡核苷探針勻不能雜交，提示可能為一種新的突變類型。

4. PCR-SSO法：SSO技術即是順序特異寡核苷酸法（Sequence Specific Oligonucleotide, SSO）。原理是PCR基因片段擴增後利用序列特異性寡核苷酸探針，通過雜交的方法進行擴增片段的分析鑒定。探針與PCR產物在一定條件下雜交具有高度的特異性，嚴格遵循鹼基互補的原則。探針可用放射性同位素標記，通過放射自顯影的方法檢測，也可以用非放射性標記如地高辛、生物素、過氧化物酶等進行相應的標記物檢測。

5. PCR-SSP法：序列特異性引物分析即根據各等位基因的核苷酸序列，設計出一套針對每一等位基因特異性的（allele-specific）、或組特異性 (group-specific)的引物，此即為序列特異性引物（SSP）。SSP只能與某一等位基因特異性片段的鹼基序列互補性結合，通過PCR特異性地擴增該基因片段，從而達到分析基因多態性的目的。

6. PCR-熒光法：用熒游標記PCR引物的5』端，熒光染料FAM和JOE呈綠色熒光，TAMRA呈紅色熒光，COUM 呈蘭色熒光，不同熒游標記的多種引物同時參加反應，PCR擴增待檢測的DNA，合成的產物分別帶有引物5』端的染料，很容易發現目的基因存在與否。

7. PCR-DNA測序：是診斷未知突變基因最直接的方法，由於PCR技術的應用，使得DNA 測序技術從過去的分子克隆後測序進入PCR直接測序。PCR產物在自動測序儀上電泳後測序。常用方法有：Sanger雙脫氧末端終止法;Maxam-Gilbert化學裂解法；DNA測序的自動化。目前DNA順序全自動激光測定法是最先進的方法。

8. PCR指紋圖法（PCR-fingerprints）：實用於快速的同種異型DR/Dw配型。在DR/DW純合子及雜合子個體中，每種DR單倍型及每種單倍型組合所產生的單鏈環狀結構的大小、數目和位置各異，由於同質雙鏈和異質雙鏈之間的分子構象不同。因此，在非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳時，它們的遷移率各不相同，從而獲得單倍型特異的電泳帶格局即PCR指紋。也有人用人工合成的短寡核苷酸片段作為探針，同經過酶切的人體DNA作Southern blot，可以得出長度不等的雜交帶，雜交帶的數目和分子量的大小具有個體特異性，除非同卵雙生，幾乎沒有兩個人是完全相同的，就象人的 指紋一樣，人們把這種雜交帶圖形稱為基因指紋(gene finger-printing)。

9. 基因晶元法：又稱為DNA 微探針陣列（Micro array）。它是集成了大量的密集排列的大量已知的序列探針，通過與被標記的若干靶核酸序列互補匹配，與晶元特定位點上的探針雜交，利用基因晶元雜交圖象，確定雜交探針的位置，便可根據鹼基互補匹配的原理確定靶基因的序列。這一技術已用於基因多態性的檢測。對多態性和突變檢測型基因晶元採用多色熒光探針雜交技術可以大大提高晶元的准確性、定量及檢測范圍。應用高密度基因晶元檢測單鹼基多態性，為分析SNPs提供了便捷的方法。

10. AFLP（Amplication Fragment Length Polymorphism）法
AFLP技術是一項新的分子標記技術，是基於PCR技術擴增基因組DNA限制性片段，基因組DNA先用限制性內切酶切割，然後將雙鏈接頭連接到DNA片段的末端，接頭序列和相鄰的限制性位點序列，作為引物結合位點。限制性片段用二種酶切割產生，一種是罕見切割酶，一種是常用切割酶。它結合了RFLP和PCR技術特點，具有RFLP技術的可靠性和PCR技術的高效性。由於AFLP擴增可使某一品種出現特定的DNA譜帶，而在另一品種中可能無此譜帶產生，因此，這種通過引物誘導及DNA擴增後得到的DNA多態性可做為一種分子標記。AFLP可在一次單個反應中檢測到大量的片段。以說AFLP技術是一種新的而且有很大功能的DNA指紋技術。

11. DGGE（denaturing gradinent electrophoresis,DGGE）法
變性梯度凝膠電泳法（） DGGE法分析PCR產物，如果突變發生在最先解鏈的DNA區域，檢出率可達100％，檢測片段可達1kb，最適圍為100bp-500bp。基本原理基於當雙鏈DNA在變性梯度凝膠中進行到與DNA變性濕度一致的凝膠位置時，DNA發生部分解鏈，電泳適移率下降，當解鏈的DNA鏈中有一個鹼基改變時，會在不同的時間發生解鏈，因影響電泳速度變化的程度而被分離。由於本法是利用溫度和梯度凝膠遷移率來檢測，需要一套專用的電泳裝置，合成的PCR引物最好在5`末端加一段40bp-50bp的GC夾，以利於檢測發生於高熔點區的突變。在DGGE的基礎上，又發展了用濕度梯度代替化學變性劑的TGGE法（溫度梯度凝膠電泳temperature gradient gelelectrophoresis,TGGE）。DGGE和TGGE均有商品化的電泳裝置，該法一經建立，操作也較簡便，適合於大樣本的檢測篩選。
12. RAPD（Random amplified polymorphic DNA）法
運用隨機引物擴增尋找多態性DNA片段可作為分子標記。這種方法即為RAPD( Random amplified polymorphic DNA，隨機擴增的多態性DNA)。盡管RAPD技術誕生的時間很短, 但由於其獨特的檢測DNA多態性的方式以及快速、簡便的特點,使這個技術已滲透於基因組研究的各個方面。該RAPD技術建立於PCR技術基礎上,它是利用一系列(通常數百個)不同的隨機排列鹼基順序的寡聚核苷酸單鏈(通常為10聚體)為引物,對所研究基因組DNA進行PCR擴增.聚丙烯醯胺或瓊脂糖電泳分離,經EB染色或放射性自顯影來檢測擴增產物DNA片段的多態性,這些擴增產物DNA片段的多態性反映了基因組相應區域的DNA多態性。RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同,但對於任一特異的引物,它同基因組DNA序列有其特異的結合位點.這些特異的結合位點在基因組某些區域內的分布如符合PCR擴增反應的條件,即引物在模板的兩條鏈上有互補位置,且引物3'端相距在一定的長度范圍之內,就可擴增出DNA片段.因此如果基因組在這些區域發生DNA片段插入、缺失或鹼基突變就可能導致這些特定結合位點分布發生相應的變化,而使PCR產物增加、缺少或發生分子量的改變。通過對PCR產物檢測即可檢出基因組DNA的多態性。分析時可用的引物數很大,雖然對每一個引物而言其檢測基因組DNA多態性的區域是有限的,但是利用一系列引物則可以使檢測區域幾乎覆蓋整個基因組。因此RAPD可以對整個基因組DNA進行多態性檢測。另外，RAPD片段克隆後可作為RFLP的分子標記進行作圖分析。

B. 基因檢測包括哪些項目

1.生化檢測：通過化學手段，檢測血液、尿液、羊水或羊膜細胞樣本，檢查相關蛋白質或物質是否存在，確定是否存在基因缺陷。用於診斷某種基因缺陷，這種缺陷是因某種維持身體正常功能的蛋白質不均衡導致的，通常是檢測測試蛋白質含量。還可用於診斷苯丙酮尿症等。

2.染色體分析：染色體分析直接檢測染色體數目及結構的異常，而不是檢查某條染色體上某個基因的突變或異常。通常用來診斷胎兒的異常。

3.DNA分析：DNA分析主要用於識別單個基因異常引發的遺傳性疾病，如亨廷頓病等。DNA分析的細胞來自血液或胎兒細胞。

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基因檢測可以分為以下五類：

1.基因篩檢：主要是針對特定團體或全體人群進行檢測。大多數通過產前或新生兒的基因檢測以達到篩檢的目的。

2.生殖性基因檢測：在進行體外人工授精階段可運用，篩檢出胚胎是否帶有基因變異，避免胎兒患有遺傳性疾病。

3.診斷性檢測：多數用來協助臨床用葯指導。

4.基因攜帶檢測：基因攜帶者如果與某些特殊基因相結合，可能會導致下一代患基因疾病，通過基因攜帶者的檢測可篩檢出此種可能，作為基因攜帶者婚前檢查、生育時的參考。

5.症狀出現前的檢測：檢測目的是了解目前健康良好者是否帶有某種突變基因，而此基因與特定疾病的發生有密切的聯系。

C. 如何進行基因檢測

研究表明，轉錄因子（TF）對調節與維持細胞狀態有重要作用，且是細胞編碼重組的關鍵因素，因此可用來解釋由細胞功能或活性喪失導致的疾病病因。在現階段，研究由各種轉錄因子介導的染色體內及染色體間相互作用位點或染色質修飾復合物等方面的生物技術正在飛速發展，典型的方法包括ChIA-PET（配對末端標簽測序分析染色質相互作用），3C（染色體構象捕獲技術），4C（環形染色體構象捕獲技術），5C（復制染色體捕獲技術）等，這些技術都用於探究三維空間相近但實際位點相隔較遠的成對基因座。另外，較新的Hi-C技術能准確地識別染色體的相互作用，但不能鑒別使染色體呈環的因子。 另外，全基因組關聯研究（GWAS）試圖證明SNPs（單核苷酸多態性）普遍存在於疾病基因組中。最近來自ENCODE數據集的一項重要發現表明大多數與人類疾病有關的SNPs分布於或靠近ENCODE所標明的區域，這些區域位於基因蛋白編碼區的外圍。研究還發現這些與表型相關的SNPs往往分布於與轉錄因子結合的核小體鬆散區域（核小體由DNA和組蛋白構成，是染色體的基本結構單位）。 相信結合GWAS分析、組蛋白修飾和轉錄基因的ChIP-seq等技術，全面繪出染色體相互作用的圖譜，將會給人類疾病研究帶來新的契機。 說明： ChIA-PET技術是利用PET測序技術研究免疫沉澱後鄰近式連接的DNA 片段，以得到染色質相互作用的技術，PET測序技術的原理是打斷基因成小片段，為片段末端添加接頭，再高通量測序，對比參照基因組，以定位測序的DNA片段。局限性是只能檢測依賴蛋白質因子的染色質相互作用。 3C技術是甲醛固定細胞後，DNA或蛋白間的連接體也同時固定，用一種限制酶完全切割片段，再連接酶連接、拆分交聯體，最後進行PCR測序。 4C技術是已知一段與其他DNA作用結合的釣魚序列；在3C基礎上多了DNA環化和反向PCR的過程。 5C技術是在構建3C庫的基礎上，利用通用引物進行多連接介導的PCR擴增測序。

D. 基因檢測方法有哪些

基因是遺傳的基本單元，攜帶有遺傳信息的DNA或RNA序列，通過復制，把遺傳信息傳遞給下一代，指導蛋白質的合成來表達自己所攜帶的遺傳信息，從而控制生物個體的性狀表達。基因檢測是通過血液、其他體液、或細胞對DNA進行檢測的技術，是取被檢測者外周靜脈血或其他組織細胞，擴增其基因信息後，通過特定設備對被檢測者細胞中的DNA分子信息作檢測，分析它所含有的基因類型和基因缺陷及其表達功能是否正常的一種方法，從而使人們能了解自己的基因信息，明確病因或預知身體患某種疾病的風險。
基因檢測可以診斷疾病，也可以用於疾病風險的預測。疾病診斷是用基因檢測技術檢測引起遺傳性疾病的突變基因。應用最廣泛的基因檢測是新生兒遺傳性疾病的檢測、遺傳疾病的診斷和某些常見病的輔助診斷。
一般有三種基因檢測方法：生化檢測、染色體分析和DNA分析。
1.生化檢測
生化檢測是通過化學手段，檢測血液、尿液、羊水或羊膜細胞樣本，檢查相關蛋白質或物質是否存在，確定是否存在基因缺陷。用於診斷某種基因缺陷，這種缺陷是因某種維持身體正常功能的蛋白質不均衡導致的，通常是檢測測試蛋白質含量。還可用於診斷苯丙酮尿症等。
2.染色體分析
染色體分析直接檢測染色體數目及結構的異常，而不是檢查某條染色體上某個基因的突變或異常。通常用來診斷胎兒的異常。
常見的染色體異常是多一條染色體，檢測用的細胞來自血液樣本，若是胎兒，則通過羊膜穿刺或絨毛膜絨毛取樣獲得細胞。將之染色，讓染色體凸顯出來，然後用高倍顯微鏡觀察是否有異常。
3.DNA分析
DNA分析主要用於識別單個基因異常引發的遺傳性疾病，如亨廷頓病等。DNA分析的細胞來自血液或胎兒細胞。
基因檢測可以分為以下五類：
1.基因篩檢
主要是針對特定團體或全體人群進行檢測。大多數通過產前或新生兒的基因檢測以達到篩檢的目的。
2.生殖性基因檢測
在進行體外人工授精階段可運用，篩檢出胚胎是否帶有基因變異，避免胎兒患有遺傳性疾病。
3.診斷性檢測
多數用來協助臨床用葯指導。
4.基因攜帶檢測
基因攜帶者如果與某些特殊基因相結合，可能會導致下一代患基因疾病，通過基因攜帶者的檢測可篩檢出此種可能，作為基因攜帶者婚前檢查、生育時的參考。
5.症狀出現前的檢測
檢測目的是了解健康良好者是否帶有某種突變基因，而此基因與特定疾病的發生有密切的聯系。
臨床意義
1.用於疾病的診斷
如對結核桿菌感染的診斷，以前主要依靠痰、糞便或血液培養，整個檢驗流程需要在兩周以上，採用基因診斷的方法，不僅敏感性大大提高，而且在短時間內就能得到結果。
2.了解自身是否有家族性疾病的致病基因，預測患病風險
資料證實10%～15%的癌症與遺傳有關，糖尿病、心腦血管疾病等多種疾病都與遺傳因素有關。如具有癌症或多基因遺傳病（如老年痴呆、高血壓、糖尿病等）的人可找出致病的遺傳基因，就能夠有針對性地調整生活方式，預防或者延緩疾病的發生。
3.正確選擇葯物，避免濫用葯物和葯物不良反應
由於個體遺傳基因上的差異，不同的人對外來物質產生的反應也會有所不同，因此部分患者使用正常劑量的葯物時，可能會出現葯物過敏、紅腫發疹的現象。根據基因檢測的結果，可制定特定的治療方案，從而科學地指導使用葯物，避免葯物毒副反應。

E. DNA基因識別技術

當人類基因組研究進入一個系統測序階段時，急需可靠自動的基因組序列注釋方法和技術，以處理大量已測定的但未知功能或未經注釋的DNA序列，例如，將序列分為基因、啟動子、轉錄調控區等。基因組注釋的一個首要問題是找出所有的基因。對於基因組DNA序列中的基因識別方法，人們已研究了近二十年，這是生物信息學領域里的一個重要研究內容。由於DNA測序技術的迅速發展，我們已經得到一些完整的基因組序列，有效地解決基因識別問題顯得越來越迫切。基因識別中的一個關鍵問題是預測編碼區域。所謂編碼區域預測，一般是指預測DNA序列中編碼蛋白質的部分，即基因的外顯子部分。而基因識別的最終目標是預測完整的基因結構，正確地識別出一個基因的所有外顯子及其邊界。

識別DNA序列中蛋白質編碼區域的方法主要有兩類。一類是基於特徵信號的識別。真核基因外顯子（編碼區域）具有一些特別的序列信號，如內部的外顯子被剪切接受體位點和給體位點所界定，5』-端的外顯子一定是在核心啟動子（Core Promoter，例如TATA盒）的下游，而3』-端的外顯子的下游包含多聚A信號和終止編碼。根據這些序列特徵信號確定外顯子的邊界，從而達到識別編碼區域的目的。 然而沒有一個演算法在預測基因時僅僅檢測這些信號，因為這些信號的強度太弱，它們缺乏統計的顯著性。另一類是基於統計度量的方法，對編碼區進行統計特性分析。通過統計而獲得的經驗說明，DNA中密碼子的使用頻率不是平均分布的，某些密碼子會以較高的頻率使用，而另一些則較少使用。這樣就使得編碼區的序列呈現出可察覺的統計特異性，即「密碼子偏好性（codon biases）」。利用這一特性對未知序列進行統計學分析可以發現編碼區的粗略位置。統計度量方法主要包括：密碼子使用傾向（codon usage)、雙聯密碼統計度量（dicodon statistic measure）、核苷酸周期性分析（即分析同一個核苷酸在3,6,9,…位置上周期性出現的規律）、基因組中等值區（isochore）的分析等。

最初基因分析方法是進行簡單的核苷酸統計，而後加上剪切保守位點的檢測。以後採用了人工神經網路、隱馬爾柯夫模型等先進的信息處理和分析技術，並與同源序列搜索結合起來，通過與已知基因序列或者EST序列的比較，提高基因識別的准確率。基因識別方法又可以分成兩大類，即從頭算方法（或基於統計的方法）和基於同源序列比較的方法。從頭算方法根據蛋白質編碼基因的一般性質和特徵進行識別，通過統計值區分外顯子、內含子及基因間區域。基於同源的方法利用資料庫中現有與基因有關的信息（如EST序列、蛋白質序列），通過同源比較，幫助發現新基因。對於新的DNA序列，搜索與已知蛋白質、EST相似的區域，發現編碼區域。最理想的方法是綜合兩大類方法的優點，開發混合演算法。常見的編碼區分析工具通常將多種技術組合起來，給出對編碼區的綜合判別，如利用下文介紹的神經網路方法等。

5.5.1 最長ORFs法

對於任何給定的核酸序列（單鏈DNA或mRNA），根據密碼子的起始位置，可以按照三種方式進行解釋。例如，對於序列ATTCGATCGCAA，一種可能的密碼子閱讀順序為ATT、CGA、TCG、CAA，另外兩種可能的密碼子閱讀順序分別為A、TTC、GAT、CGC、AA和AT、TCG、ATC、GCA、A。這三種閱讀順序稱為閱讀框（reading frames）。一個開放閱讀框（ORF, open reading frame）是一個沒有終止編碼的密碼子序列。

可以用最長ORFs法識別原核基因。原核基因結構相對比較簡單，其基因識別任務的重點是識別開放閱讀框，或者說是識別長的編碼區域。辨別序列是編碼區域或是非編碼區域的一種方法是檢查終止密碼子的出現頻率。由於一共有64個密碼子，其中3個是終止密碼子，因此，如果一條核酸序列是均勻隨機分布的，那麼終止密碼子出現的期望次數為每21（»64/3）個密碼子出現一次終止密碼子。每個編碼區域只存在一個終止密碼子，該密碼子作為編碼區域的結束標志。因此，如果能夠找到一個比較長的序列，其相應的密碼子序列不含終止密碼子，那麼這段序列可能就是編碼區域。在實現基於上述思想的演算法時，掃描給定的DNA序列，在三個不同的閱讀框中尋找較長的ORF；當遇到終止密碼子以後，回頭尋找起始密碼子，以確定完整的編碼區域。

大部分早期的DNA序列數據來自於線粒體或細菌基因組，最早的基因識別方法就是針對這類序列數據而發展起來的。一個簡單的演算法，如果它能夠發現較長的ORF，並使用長度閾值（例如300bp），則該演算法將檢測到大多數基因，並且具有很好的特異性。當然，這種演算法比較簡單，不適合處理短的ORF或者交疊的ORF。

5.5.2 基於密碼子出現頻率的預測方法

真核基因遠比原核基因復雜，一方面，真核基因的編碼區域是非連續的，編碼區域被分割為若干個小片段。另一方面，真核基因具有更加豐富的基因調控信息，這些信息主要分布在基因上游區域。為了確定基因在一段序列上所處的位置，需要首先找出基因兩端的功能區域，即轉錄啟動區和終止區，然後在啟動區下游位置尋找翻譯起始密碼子，從而確定基因起始位置。為了取出外顯子，而將內含子剔除，必須識別轉錄剪切位點，即剪切給體位點和剪切接受體位點。

必須清楚，要想設計一個100%識別編碼區域的程序幾乎是不可能的。問題是如何提高一個識別演算法的敏感性Sn和特異性Sp。Sn 和Sp都應該比較高，若一個演算法的測試結果僅僅一個很高，而另一個很低，則該演算法是不成功的。例如，假設有一個識別編碼區域的演算法，它將所有介於AG和GT之間的序列片段都找出來作為識別結果，那麼該演算法的敏感性Sn將達到100%，但其特異性Sp卻近似於0%。因此，對於一個識別演算法，往往用敏感性和特異性的平均值作為衡量其准確率的指數，即(Sn+Sp)/2。在一般情況下，調整程序的參數，使得Sn»Sp。

真核DNA序列中基因的識別是一個復雜的問題，一種方法是首先通過統計分析預測編碼區域，挑選出候選的外顯子，然後利用動態規劃方法構造最優的基因結構，這個最優的基因結構被定義為一個外顯子一致的鏈。然而，直接運用這種方法會遇到概念上和計算上的困難。每一個候選的基因由許多統計參數來刻畫，但還不清楚如何將這些統計參數組合到一個打分函數中。這個問題在一定程度上可以用神經網路來解決，運用神經網路為每個候選的外顯子打分，或將神經網路與動態規劃相結合，從而構造最優基因結構。然而使用標準的動態規劃隱含說明僅僅考慮具有加和性的打分，而許多序列分析表明用非線性的函數有時會得到更好的效果。矢量動態規劃方法為利用非線性函數提供了可能。矢量動態規劃構造一組基因，並確保其中包含滿足自然單調條件的函數所對應的最優基因。

這里首先介紹一種根據各個密碼子出現頻率識別編碼區域的方法。例如，亮氨酸、丙氨酸、色氨酸分別有6個、4個和1個密碼子，將一個隨機均勻分布的DNA序列翻譯成氨基酸序列，則在氨基酸序列中上述3種氨基酸出現的比例應該為6:4:1。但是，在真實的氨基酸序列中，上述比例並不正確。這說明DNA的編碼區域並非隨機序列。

假設在一條DNA序列中已經找到所有的ORF，那麼，可以利用密碼子頻率進一步區分編碼ORF和非編碼ORF。將每個ORF轉換為相應的密碼子序列，得到一個64個狀態的馬爾柯夫鏈。這里，為每個密碼子分配一個狀態，狀態轉換概率即為一個密碼子跟隨在其他密碼子後面的概率。利用這種方法，可以計算一個ORF成為編碼區域的可能性。

在識別編碼區域的馬爾柯夫鏈模型中，一個密碼子出現的概率依賴於其前面一個密碼子。下面考慮另一個簡單的統計模型，在該模型中，假設相繼的密碼子是獨立的，不存在前後依賴關系。令fabc代表密碼子abc在編碼區域出現的頻率。給定一個不知道閱讀框的編碼序列a1,b1,c1, a2,b2,c2,…, an+1,bn+1, 對於從密碼子a1b1c1開始的閱讀框，其n個密碼子的出現概率為

同樣，在第二種和第三種閱讀框中，n個密碼子出現的概率分別如下

令Pi代表第i個閱讀框成為編碼閱讀框的概率，其值按下列公式計算：

在設計演算法時，在給定的核酸序列上移動一個長度為n的窗口，對窗口內的每個序列片段按上式計算Pi，並根據Pi的值識別編碼的閱讀框。軟體包CGC中的Codon Preference程序採用的就是這種方法。

可以將密碼子使用偏性作為編碼區域的一種統計特性。對現有的大量序列數據進行分析，不難發現：外顯子和內含子在密碼子的出現上存在著明顯的差異。

在一個基因中，第i個（i=1，64）密碼子相對使用傾向RSCUi的定義如下：

其中Obsi是該基因中第i個密碼子實際出現的次數，而Expi是對應密碼子期望的出現次數。

åaai是統計的第i個密碼子出現的次數，åsyni是所有與第i個密碼子同義密碼子出現的次數。RSCU值大於1表示相應密碼子出現的次數比期望次數高，而小於1則表示出現次數相對較少。

實驗說明，連續的6個核苷酸出現頻率的對比是預測一個窗口是否屬於編碼區域或非編碼區域的最好的單個指標。若編碼窗口的長度至少為50 bp，則最好的編碼預測准確率約為70%。假設一段DNA序列為S，從S的第i位到第j位的雙聯密碼統計度量IF6（i，j）定義為：

其中，fk是從第k位開始的雙聯密碼的頻率，Fk是該雙聯密碼隨機出現的頻率。這里假設j的取值為大於等於6。

此外，利用密碼子第三位的偏性，也可以預測編碼區域。這種方法的准確率取決於對已知基因的統計，統計樣本數必須足夠多。

利用各種統計編碼度量，可以預測一段DNA序列是否是編碼區域。許多編碼區域識別演算法都是基於這種思想的。

分析實例：

F. 檢測基因表達的方法

主要用探針檢測mRNA或用抗體檢測出表達的蛋白質(轉錄水平上對特異mRNA的檢測和翻譯水平上對特異蛋白質的檢測)

一、外源基因轉錄水平的鑒定

基因表達分為轉錄及翻譯兩階段，轉錄是以DNA（基因）為模板生成mRNA的過程，翻譯是以mRNA為模板生成蛋白質的過程，檢測外源基因的表達就是檢測特異mRNA及特異蛋白質的生成。所以基因表達檢測分為兩個水平。

即轉錄水平上對特異mRNA的檢測和翻譯水平上對特異蛋白質的檢測。轉錄水平上的檢測主要方法是Northern雜交，它是以DNA或RNA為探針，檢測RNA鏈。和Southern雜交相同，Northern雜交包括斑點雜交和印跡雜交。

也可用RT-PCR（reverse transcribed PCR）方法檢測外源DNA在植物體內的轉錄表達。其原理是以植物總RNA或mRNA為模板進行反轉錄，然後再經PCR擴增。

如果從細胞總RNA提取物中得到特異的cDNA擴增條帶，則表明外源基因實現了轉錄。此法簡單、快速，但對外源基因轉錄的最後決定，還需與Northern雜交的實驗結果結合。

二、外源基因表達蛋白的檢測

表達蛋白的檢測方法有三種：

1、生化反應檢測法：主要通過酶反應來檢測；

2、免疫學檢測法：通過目的蛋白（抗原）與其抗體的特異性結合進行檢測，具體方法有Western雜交、酶聯免疫吸附法（ELISA）及免疫沉澱法；

3、生物學活性的檢測。

Western雜交是將聚丙烯醯胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離抗原（Antigen）固定在固體支持物上（如硝酸纖維素膜，NC膜）。不同分子量大小的蛋白質在凝膠中遷移率不同，據此可確定特定的抗原存在與否以及相對豐度，或者蛋白質是否遭到降解等。

蛋白質電泳後轉到NC膜，放在蛋白質（如牛血清蛋白BSA）或奶粉溶液中，溫育，以封閉非特異性位點，然後用含有放射性標記或酶標記的特定抗體雜交，抗原-抗體結合，再通過放射性自顯影或顯色觀察。

(6)基因結構檢測方法擴展閱讀

外顯子與內含子表達過程中的相對性 從內含子與外顯子的定義來看，兩者是不能混淆的，但是真核生物的外顯子也並非都「顯」（編碼氨基酸），除了tRNA基因和rRNA基因的外顯子完全「不顯」之外，幾乎全部的結構基因的首尾兩外顯子都只有部分核苷酸順序編碼氨基酸，還有完全不編碼基酸的外顯子，如人類G6PD基因的第一外顯子核苷酸順序。

已發現一個基因的外顯子可以是另一基因的內含子，所這亦然。以小鼠的澱粉酶基因為例，來源於肝的與來源於唾液腺的是同一基因。澱粉酶基因包括4個外顯子，肝生成的澱粉酶不保留外顯子1，而唾液腺中的澱粉酶則保留了外顯子1的50bp順序，但把外顯子2與前後兩段內含子一起剪切掉，經過這樣剪接，外顯子2就變成唾液澱粉酶基因中的內含子。

同一基因在不同組織能生成不同的基因產物來源於不同組織的類似蛋白，可以由同一基因編碼產生，這種現象首先是由於基因中的增強子等有組織特異性，它能與不同組織中的組織特異因子結合，故在不同組織中同一基因會產生不同的轉錄物與轉錄後加工作用。

此外真核生物基因可有一個以一的poly(A)位點，因此能在不同的細胞中產生具有不同3』末端的前mRNA，從而會有不同的剪接方式。由於大多數真核生物基因的轉錄物是先加poly(A)尾巴，然後再行剪接，因此不同組織、細胞中會有不同的因子干預多聚腺苷酸化作用，最後影響剪接模式。

G. 在dna水平上分析基因一級結構，拷貝數變化及在染色體上位置可以採用哪些方法

基因的一級結構是指脫氧核苷酸的排列測序，解析一級結構最精確的技術就是DNA測序，第一代測序技術為Sanger測序法（雙脫氧測序法）,第二代測速技術是循環晶元測序技術，第三代測序技術是單分子測序技術；分析某種基因的種類及拷貝數，實質上就是對基因進行定性和定量分析，常用的技術包括DNA印跡技術（Southern印記）和實時定量PCR技術；基因在染色體上位置的檢測可以通過熒光分子標記法。
該答案由本人查閱資料整理歸納，如有異議，歡迎批評指正。

H. 基因檢測准確率多少

基因檢測的准確率還是很高的。

基因檢測主要是利用分子生物學技術檢測DNA、RNA的結構以及基因表達水平是否有變化，對基因作出診斷。基因檢測在遺傳性疾病中有重要的作用，可以檢測特定的基因突變來確定患有某種遺傳性疾病。另外基因診斷在腫瘤中也有重要的診斷價值，對診斷肺癌，乳腺癌以及大腸癌起到早期診斷的作用，還可以對腫瘤進行臨床分期，預測愈後，腫瘤高危人群的篩查，指導個體化治療和預防。基因檢測方法大致分為三種：生化檢測是通過生物化學分析，檢測血液、尿液、羊水或羊膜細胞樣本，檢查目標基因相關蛋白質或物質是否存在，確定是否存在基因缺陷；檢測染色體數目及結構的異常，通常用來診斷胎兒的異常；DNA分析主要用於識別單個基因異常引發的遺傳性疾病，如亨廷頓病（Huntington』s disease,HD）等，DNA分析的細胞來自血液或胎兒細胞。

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I. 檢測某一生物的基因型的方法

表現型相同：基因型不一定相同。
基因型相同：
環境相同，表現型相同。
環境不同，表現型不一定相同。
更仔細參閱：
基因型又稱遺傳型，
它反映生物體的遺傳構成，即從雙親獲得的全部基因的總和。據估計，人類的結構基因約有5萬對。因此，整個生物的基因型是無法表示的,遺傳學中具體使用的基因型，往往是指某一性狀的基因型，如白化病的基因型是cc，它只是表示這一對等位基因不能產生酷氨酸酶。所以基因型是從親代獲得的，可能發育為某種性狀的遺傳基礎。表現型是指生物體所有性狀的總和。但整個生物體的表現型是無法具體表示的。因此,實際使用的表現型,往往也是指生物發育的某一具體性狀。如體內不能產生酪氨酸酶等。表現型是生物體把遺傳下來的某一性狀發育的可能變成現實的表現。
基因型、表現與環境之間的關系
基因型、表現與環境之間的關系，可用如下公式來表示：表現型＝基因型＋環境
現以人類的優生為例,優生是生育在智力和體質方面具有優良表現型的個體,而表現型的優與劣是由基因型（遺傳）與環境共同決定的。當然在中不同性狀的發育與表現中，兩者的相對重要性是不同的。人們可以應用這個關系的原理來防治遺傳病,如苯丙酮尿症是常染色體隱性遺傳病,它是由一對隱性致病基因決定發病的，這個環境條件是體內有過量的苯丙氨酸。假若在食物中控制苯丙氨酸，食用含苯丙氨酸的量對人體來說是最低維持量的食品，致病的基因型就不能起作用，這時的表現型就可以是正常的，所以臨床上可以通過食物療法來治療苯丙酮尿症。優境學就是利用環境條件，使優良的基因型（遺傳基礎）得到充分的表現，使不良基因型的表現型得到改善。
人類的疾病幾乎都與遺傳有關，也都受環境的影響，只是不同的疾病受環境與遺傳兩個因素影響的程度不同，某些疾病明顯地受遺傳支配，而另一些疾病則受環境的顯著作用。

J. 基因檢測方法有好幾種，哪一種方式比較好

需要按照實際需求去選擇，沒有哪個最好的說法，合適的就是最好的
常用基因診斷技術：
一、Southern印跡法（Southern blot）

基本原理是：硝酸纖維膜或尼龍濾膜對單鏈DNA的吸附能力很強，當電泳後凝膠經過DNA變性處理，覆以上述濾膜，再於其上方壓上多層乾燥的吸水紙，藉助它對深鹽溶液的上吸作用，凝膠上的單鏈DNA將轉移到濾膜上。轉移是原位的，即DNA片段的位置保持不變。轉移結束後，經過80℃烘烤的DNA，將原位地固定於膜上。
當含有特定基因片段已原位轉移到膜上後，即可與同位素標記了的探針進行雜交，並將雜交的信號顯示出來。雜交通常在塑料袋中進行，袋內放置上述雜交濾膜，加入含有變性後探針的雜交溶液後，在一定溫度下讓單鏈探針DNA與固定於膜上的單鏈基因DNA分子按鹼基到互補原理充分結合。結合是特異的，例如只有β珠蛋白基因DNA才能結合上β珠蛋白的探針。雜交後，洗去膜上的未組合的探針，將Ⅹ線膠片覆於膜上，在暗盒中日光進行放射自顯影。結合了同位素標記探針的DNA片段所在部位將顯示黑色的雜交帶，基因的缺失或突變則可能導致帶的缺失或位置改變。

二、聚合酶鏈反應

近年來，基因分析和基因工程技術有了革命性的突破，這主要歸功於聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction,PCR）的發展和應用。應用PCR技術可以使特定的基因或DNA片段在短短的2－3小時內體外擴增數十萬至百萬倍。擴增的片段可以直接通過電泳觀察，也可用於進一步的分析。這樣，少量的單拷貝基因不需通過同位素提高其敏感性來觀察，而通過擴增至百萬倍後直接觀察到，而且原先需要一、二周才能作出的診斷可以縮短至數小時。

三、擴增片段長度多態性

小衛星DNA和微衛星DNA的長度多態性可以通過PCR擴增後電泳來檢出，並用於致病基因的連鎖分析，這種診斷方法稱為擴增片段長度多態性（amplified fragment length polymorphism,Amp-FLP）連鎖分析法。PCR擴增後，產物即等位片段之間的差別有時只有幾個核苷酸，故需用聚丙烯醯胺凝膠電泳分離鑒定。此法多用於突變性質不明的連鎖分析.

四、等位基因的特異寡核苷酸探針診斷法

當基因的突變部位和性質已完全明了時，可以合成等基因特異的寡核苷酸探針（allele-specific oligonucleotide,ASO）用同位素或非同位素標記進行診斷。探針通常為長20bp左右的核苷酸。用於探測點突變時一般需要合成兩種探針，與正常基因序列完全一致，能與之穩定地雜交，但不能與突變基因序列雜交；另一種與突變基因序列一致，能與突變基因序列穩定雜交，但不能與正常基因序列穩定雜交，這樣，就可以把只有一個鹼基發生了突變的基因區別開來.

PCR可結合ASO，即PCR－ASO技術，即先將含有突變點的基因有關片段進行體外擴增，然後再與ASO探針作點雜交，這樣大大簡化了方法，節約了時間，而且只要極少量的基因組DNA就可進行。

五、單鏈構象多態性診斷法

單鏈構象多態性（signle strand conformation polymorphism,SSCP）是指單鏈DNA由於鹼基序列的不同可引起構象差異，這種差異將造成相同或相近長度的單鏈DNA電泳遷移率不同，從而可用於DNA中單個鹼基的替代、微小的缺失或手稿的檢測。用SSCP法檢查基因突變時，通常在疑有突變的DNA片段附近設計一對引物進行PCR擴增，然後將擴增物用甲醯胺等變性，並在聚丙烯醯胺凝膠中電泳，突變所引起的DNA構象差異將表現為電泳帶位置的差異，從而可據之作出診斷。