蛋白活性檢測方法

A. 一般採用什麼方法檢驗蛋白質即鑒定

一般用雙縮脲試劑鑒定，雙縮脲試劑可以和蛋白質發生紫色反應。

B. 如何測定蛋白活性

根據每個細胞有一定的重量而設計的。它可以用於單細胞、多細胞以及絲狀體微生物生長的測定。將一定體積的樣品通過離心或過濾將菌體分離出來，經洗滌，再離心後直接稱重，求出濕重，如果是絲狀體微生物，過濾後用濾紙吸去菌絲之間的自由水，再稱重求出濕重。不論是細菌樣品還是絲狀菌樣品，可以將它們放在已知重量的平皿或燒杯內，於105℃烘乾至恆重，取出放入乾燥器內冷卻，再稱量，求出微生物乾重。
如果要測定固體培養基上生長的放線菌或絲狀真菌，可先加熱至50℃，使瓊脂熔化，過濾得菌絲體，再用50℃的生理鹽水洗滌菌絲，然後按上述方法求出菌絲體的濕重或乾重。
除了乾重、濕重反映細胞物質重量外，還可以通過測定細胞中蛋白質或DNA的含量反映細胞物質的量。蛋白質是細胞的主要成分，含量也比較穩定，其中氮是蛋白質的重要組成元素。從一定體積的樣品中分離出細胞，洗滌後，按凱氏定氮法測出總氮量。蛋白質含氮量為16％，細菌中蛋白質含量占細菌固形物的50％一80％，一般以65％為代表，有些細菌則只佔13％一14％，這種變化是由菌齡和培養條件不同所產生的。因此總含氮量與蛋白質總量之間的關系可按下列公式計算：
蛋白質總量＝含氮量×6.25
核酸DNA是微生物的重要遺傳物質，每個細菌的DNA含量相當恆定，平均為8.4×`10^(-5)`NG。因此從一定體積的細菌懸液中所含的細菌中提取DNA，求得DNA含量，再計算出這一定體積的細菌懸液所含的細菌總數。

C. 測定血清總蛋白的參考方法是

總蛋白的六種檢測方法
（一）凱氏定氮法
將血清與強酸一起加熱消化，使血清中的含氮化合物轉化為銨鹽，再加鹼使銨鹽成為氨進經蒸餾分離出來，最後用酸滴定測定氮量，按每克氨相當於6.25g蛋白質計算蛋白質的濃度。
應用歷史較久，結果較准確，是蛋白質測定的參考方法，但操作復雜，影響因素較多，且不少蛋白質的含氮量並非16%，不適用於日常工作，目前多用於標准蛋白的標定及校正其它的常規方法。
（二）雙縮脲法
蛋白質中的肽鍵（-CONH-）在鹼性條件下與Cu2+絡合成紫紅色復合物，產生的顏色強度在一定范圍內與蛋白質含量成正比。
此反應和二分子尿素縮合後的產物雙縮脲（H2N-CO-NH-CO-NH2）與鹼性銅溶液作用形成紫紅色的反應相似，故稱為雙縮脲反應。幾分子中含有兩個甲醯胺基(-CO-NH2)的化合物都能出現此反應。
因至少含2個-CONH-基團才能與Cu2+絡合，所以氨基酸和二肽無此反應。體液中小分子肽含量極低，故血漿中除蛋白質外幾乎不存在可與雙縮脲試劑顯色的物質，且各種蛋白質顯色程度基本相同。
此法簡便、准確、重復性好，在10-120g／L。濃度范圍內呈良好的線性關系，批內CV值<2％，但靈敏度較其它方法稍差，是目前臨床上最常規的方法。
（三）酚試劑法
蛋白質分子中的酪氨酸殘基和色氨酸殘基能夠和酚試劑中的磷鎢酸-磷鉬酸反應生成藍色化合物。Lowry改良法在酚試劑中加入Cu2+，提高了呈色的靈敏度，其中75％呈色靠銅離子產生。Lowry改良法的靈敏度為雙縮脲法的100倍左右。
由於各種蛋白質中酪氨酸和色氨酸的比例不同，如白蛋白含色氨酸為0.2％，而在一些球蛋白中色氨酸含量高達2％~3％，因此使用本法測定純粹的、單一的蛋白質較合適。此法靈敏度較高，為10~60ug／ml，因而適用於測定蛋白質含量較少的標本(如腦脊液)，但試劑反應易受還原性化合物糖類、酚類及多種葯物如水楊酸、氯丙嗪和某些磺胺葯的干擾。
（四）紫外分光光度法
蛋白質分子內的色氨酸、酪氨酸等芳香族氨基酸可使蛋白質溶液在280nm波長處有一吸收峰，依此性質可用於蛋白質定量。
由於各種蛋白質中芳香族氨基酸的含量和比例不同，血清中游離的酪氨酸和色氨酸在280nm處也有吸收，因尿酸和膽紅素在280nm處也有干擾，因而本法的准確性和特異性都受到很大的影響。
此法敏感而且簡便，由於制劑未經任何處理，蛋白質的生物活性得以保留，故常用於較純的酶和免疫球蛋白的測定。但此法需紫外分光光度計和石英比色杯。
（五）染料結合法
在酸性環境中，蛋白質分子解離出的-NH3+，可與染料的陰離子產生顏色反應。常用的染料有氨基黑、考馬斯亮藍等。這一性質可用於電泳後蛋白質的染色和血清總蛋白測定。
此法操作簡便、重復性好、靈敏度高、且干擾因素較少。缺點是特異性不高，分子量3 000以上的多肽也參與反應。另外，不同蛋白質和染料的結合力不一致，因此很難找到一種合適的物質作標准物，使此方法的應用受到限制。
（六）比濁法
用某些酸類(如二氯醋酸、磺基水楊酸等)和血清蛋白質結合產生沉澱，然後測定其濁度，與同樣處理的蛋白標准液比較，即可求得蛋白質含量。
此方法簡便，不需特殊儀器。缺點是濁度形成的強弱易受多種因素影響，如加入試劑的方法、反應時的溫度等。另外，蛋白質沉澱時易形成絮狀物，難以獲得穩定的懸浮液

D. 蛋白濃度測定的方法具體有哪些

蛋白濃度測定的方法：

1. 紫外分光光度法

紫外光譜吸收法測定蛋白質含量是講蛋白質溶液直接在紫外分光光度計中測定的方法，不需要任何試劑，操作簡單且易回收。蛋白質溶液在280nm附近有強烈的吸收，這是由於蛋白質中酪氨酸、色氨酸殘基而引起的，所以光密度受這兩種氨基酸含量的支配。另外核蛋白或提取過程中雜有的核酸對測定結果引起極大誤差，其最大吸收在260nm。所以同時測定280及260nm兩種波長的吸光度，通過計算可得較為正確的蛋白質含量。

2. 雙縮脲法

利用半飽和硫酸銨或27.8％硫酸鈉——亞硫酸鈉可使血清球蛋白沉澱下來，而此時血清白蛋白仍處於溶解狀態，因此可把兩者分開，這種利用不同濃度的中性鹽分離蛋白的方法稱為鹽方法。鹽析分離蛋白質的方法不僅用於臨床醫學，而且還廣泛地用於生物化學研究工作中，如一些特殊蛋白質—酶、蛋白激素等的分離和純化。

蛋白質和雙縮脲一樣，在鹼性溶液中能與銅離子形成紫色絡合物（雙縮脲反應），且其呈色深淺與蛋白質的含量成正比，因此可於蛋白質的定量測定。

但必須注意，此反應並非蛋白質所特有，凡分子內有兩個或兩個以上的肽鍵的化合物以及分子內有—CH2—NH2等結構化合物，雙縮脲反應也呈陽性。本實驗用27.8％硫酸鈉—亞硫酸鈉溶液稀釋血清，取出一部分用雙縮脲反應測定蛋白質的含量，剩餘部分則用濾紙過濾，使析出的球蛋白與白蛋白分離，取出濾液用同一反應測定白蛋白的含量。總蛋白與白蛋白含量之差即球蛋白的含量。白蛋白與球蛋白之比即所謂的白／球比值。

3. Folin-酚試劑法

目前實驗室較多用Folin-酚法測定蛋白質含量，此法的特點是靈敏度高，較雙縮脲高兩個數量級，較紫外法略高，操作稍微麻煩，反應約在15分鍾有最大顯色，並最少可穩定幾個小時，其不足之處是干擾因素較多，有較多種類的物質都會影響測定結果的准確性。其原理是蛋白質中含有酚基的酪氨酸，可與酚試劑中的磷鉬鎢酸作用產生蘭色化合物，顏色深淺與蛋白含量成正比。

4. 考馬氏亮藍G-250

此方法是1976年Bradform建立。染料結合法測定蛋白質的優點是靈敏度較高，可檢測到微量蛋白，操作簡便、快迅，試劑配製極簡單，重復性好，但干擾因素多。考馬氏亮藍G－250具有紅色和青色兩種色調、在酸性溶液中游離狀度下為棕紅色，當它通過疏水作用與蛋白質結合後，變成藍色，最大吸收波長從465nm轉移到595nm處，在一定的范圍內，蛋白質含量與 595nm的吸光度成正比，測定595nm處光密度值的增加即可進行蛋白質的定量。

以上便是實驗室中常見的幾種蛋白濃度測定的方法，另外還有凱氏定氮法和BCA法，有凱氏定氮法結果最精確，但操作復雜，BCA法又以其試劑穩定，抗干擾能力較強，結果穩定，靈敏度高而受到歡迎。

E. 免疫球蛋白的檢測方法

異常血清免疫球蛋白檢測方法學探討（vip資料）
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保健食品檢驗方法－－ig檢驗
sfda網站和保健食品相關網站上都可以檢索到。

關於牛初乳及其製品中免疫球蛋白G的檢測方法

溶液配製：

1） 緩沖液A： 0.05mol.L-1磷酸二氫鈉溶液（pH6.5）；

2） 緩沖液B: 0.05mol.L-1甘氨酸溶液（pH2.5）；

3）IgG貯液：sigma公司IgG配成濃度約4mg.mL-1溶液，冷凍濃縮至200mL。

樣品制備和檢測：取一定量牛初乳粉，溶解於緩沖液A，製成濃度2mg/mL的溶液，用0.45mm微濾器過濾後進樣。按下表方案使用緩沖液B梯度洗脫。控制不同進樣體積（25~200mL）產生標准響應曲線（5mg到70mg）。IgG貯液用緩沖液A稀釋後，製成IgG標准曲線（4~40mg）。通過280nm處吸收值監測洗脫液蛋白濃度。

表1 蛋白質G親合HPLC的梯度洗脫條件

時間（min） 流速（ml/min） %A %B 梯度
0 1.0 100 0 -
0.5 1.0 100 0 -
1.0 2.0 100 0 線性
1.5 2.0 0 100 -
4.0 2.0 0 100 線性
5.0 1.0 100 0 -
7.0 1.0 100 0 -

具體操作可參閱國標GB/T 5009.194- 2003和曹勁松《初乳功能性食品》第10章。

3、 RID與HPLC的比較

一般地，HPLC檢測結果將高於RID檢測結果。

我們實驗室對比研究了牛初乳IgG抗原決定簇部位（或第二抗體結合部位）和蛋白質G結合部位的變性動力學，證實：在實驗溫度（69℃~81℃）范圍內，IgG分子上蛋白質G結合部位在熱處理過程中更為耐熱，或者說IgG抗原決定簇部位相對更為熱敏感。從而，揭示了上述現象的本質：RID測到的IgG在整體變性程度上低於HPLC測到的IgG。因此，國外一些將RID和ELISA方法測定的IgG含量視為「免疫活性IgG」是比較科學的。

在各溫度下IgG分子上蛋白質G結合部位變性反應各溫度下的D值均比IgG分子上第二抗體結合部位變性反應的相應溫度下的D值大，說明IgG分子上蛋白質G結合部位在熱處理過程中要比IgG抗原決定簇部位更為耐熱。該溫度范圍內IgG分子上抗原決定簇部位熱變性活化能（270.55kJ/moL）大大低於IgG分子上蛋白質G結合部位熱變性活化能（316.42kJ/moL）。在該溫度范圍內IgG分子上第二抗體結合部位變性反應的Z值為9.34℃，IgG分子上蛋白質G結合部位變性反應的Z值為7.25℃，可認為：IgG分子上第二抗體結合部位的穩定性在上述溫度范圍內相對恆定，而蛋白質G結合部位的穩定性相對容易隨溫度發生變化。在酸性乳清溶液中，也獲得類似的研究結論。
上述研究結果即將發表於《Journal of Agricultural and Food Chemistry》和《Journal of Food Science》。

4、其它

隨著未來技術的發展，並不排除其它可能的IgG檢測方法。例如ELISA法，國內已經建立，而且有國外公司可提供試劑盒。

F. 測定鹼性蛋白酶活有哪些方法

鹼性蛋白酶酶活力檢測方法

酶活力是指酶催化某些化學反應的能力。酶活力的大小可以用在一定條件下它所催化的某一化學反應的速度來表示。測定酶活力實際就是測定被酶所催化的化學反應的速度。酶促反應的速度可以用單位時間內反應底物的減少量或產物的增加量來表示，為了靈敏起見，通常是測定單位時間內產物的生成量。由於酶促反應速度可隨時間的推移而逐漸降低其增加值，所以，為了正確測得酶活力，就必須測定酶促反應的初速度。

鹼性蛋白酶酶活測定原理 福林法原理

鹼性蛋白酶在鹼性條件下，可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸。酪氨酸為含有酚羥基的氨基酸，可與福林試劑（Folin)（磷鎢酸與磷鉬酸的混合物）發生福林酚反應。（福林酚反應：福林試劑在鹼性條件下極其不穩定，容易定量地被酚類化合物還原，生成鎢藍和鉬藍的混合物，而呈現出不同深淺的藍色。）利用比色法即可測定酪氨酸的生成量，用鹼性蛋白酶在單位時間內水解酪蛋白產生的酪氨酸的量來表示酶活力，以此計算其酶活力。

酶活力測定實驗步驟

酶液制備：精確稱取干酶粉1g（±0.001），加入10mL緩沖液（2.2.5），在小燒杯中溶解，並用玻璃棒攪拌，靜置片刻後，將上層液小心傾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量緩沖液，如此反復攪拌溶解4次，最後全部移入100mL容量瓶中。用緩沖液定容至刻度，充分搖勻，用四層紗布過濾。吸取濾液5mL，移入100mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，所得液位稀釋2000倍的酶液。（稀釋倍數具體要看待測酶樣品的酶活）

酶活定義

鹼性蛋白酶活力單位的定義：1克鹼性蛋白酶粉在pH10，40℃的條件下，每分鍾水解酪蛋白能產生1微克酪氨酸，定為一個酶活力單位。

酶活力測定注意事項

1、酶反應的溫度、pH和時間對被水解的肽鍵數量有直接的影響，因此必須嚴格控制。

2、用三氯醋酸終止反應後，過濾反應混合物所得的濾液必須是澄清的。

3、因為Folin試劑對酸性環境比較敏感，容易發生變化，因此在測定時有順序的規定，需要先加入碳酸鈉溶液形成一個鹼性環境，之後再加入Folin試劑，使其能正常發揮作用

G. 求助：蛋白酶酶活的測定方法

酶活測定方法 還原法
酶與底物在特定的條件下反應,酶可以促使底物釋放出還原性的基團。在此反應體系中添加化學試劑 ,酶促反應的產物可與該化學試劑發生反應,生成有色物質。通過在特定的波長下 比色 ,即可求 出還原產物的含量 ,從而計算出酶活力的大小 。
色原底物法
通過底物與特定的可溶性生色基團物質結合,合成人工底物。該底物與酶發生反應後 ,生色基團可被釋放出來 ,用分光光度法即可測定顏色的深淺,在與已知標准酶所做的曲線比較後 ,即可求出待測酶的活力。 粘度法
該法常用於測定纖維素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶 的活力。木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情況下可形成極高的粘度,當酶作用於粘性底物時木聚糖和β-葡聚糖會被切割成較小的分子使其粘度大 為降低。基 於Poiseuille定律我們知道 ,只要測定一定條件下溶劑和樣品溶液的運動粘度,便可計算特性粘數,並以此來判斷酶的活力。
高壓液相色譜法
酶與其底物在特定的條件下充分反應後 ,在一定的色譜條件下從反應體系中提取溶液進行色譜分析,認真記錄保留時間和色譜圖,測量各個樣的峰高和半峰高,計算出酶促反應生成物的含量 ,從而換算出酶活力的數值。
免疫學方法
常用 於酶活性分析的免疫學方法包括:免疫電泳法 、免疫凝膠擴散法。這兩種方法都是根據酶與其抗體之間可發生特定的沉澱反應 ,通過待測酶和標准酶的比較,最終確定酶活力。免疫學方法檢側度非常靈敏,可檢側出經過極度稀釋後樣品中的酶蛋白,但其缺點是不同廠家生產的酶產品需要有不同特定的抗體發生反應。
瓊脂凝膠擴散法
將酶作用的底物與瓊脂混合熔融後 ,倒入培養皿中或載波片上製成瓊脂平板。用打孔器在瓊脂平面上打出一個約4-5mm半徑 的小孔。在點加酶樣並培養24h以後 ,用染色劑顯色或用展開劑展開顯出水解區,利用水解直徑和酶活力關系測定酶活力。

H. 確定血清白蛋白純度和生物活性鑒定方法 並且確定所用試劑儀器，急求，謝謝

標准曲線製作—考馬斯亮藍法測蛋白質含量

一、 標准曲線 一般用分光光度法測物質的含量，先要製作標准曲線，然後根據標准曲線查出所 測物質的含量。因此，製作標准曲線是生物檢測分析的一項基本技術。

二、 蛋白質含量測定方法 1、 凱氏定氮法 2、 雙縮脲法 3、 Folin-酚試劑法 4、 紫外吸收法 5、 考馬斯亮藍法 三、 考馬斯亮藍法測定蛋白質含量—標准曲線製作 （一）、試劑： 1、 考馬斯亮藍試劑： 考馬斯亮藍G—250 100mg溶於50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，雍 蒸餾水稀釋至1000ml,濾紙過濾。最終試劑中含0.01%（W/V）考馬斯亮藍G—2 50,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。 2、 標准蛋白質溶液： 純的牛血清血蛋白，預先經微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，根據其純度同0.15 mol/LNaCl配製成100ug/ml蛋白溶液。 （二）、器材： 1、722S型分光光度計使用及原理（）。 2、移液管使用（）。 （三）、標准曲線製作： 試管編號 0 1 2 3 4 5 6 100ug/ml標准蛋白（ml） 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.15mol/L NaCl （ml） 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 考馬斯亮藍試劑 （ml） 5 5 5 5 5 5 5 搖勻，1h內以1號管為空白對照,在595nm處比色 A595nm

2、以A595nm為縱坐標，標准蛋白含量為橫坐標（六個點為10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐標軸上繪制標准曲線。 1）、利用標准曲線查出回歸方程。 2）、用公式計算回歸方程。 3）、或用origin作圖 ，測出回歸線性方程。即A595nm=a×X( )+6 一般相關系數應過0.999以上，至少2個9以上。 4）、繪圖時近兩使點在一條直線上，在直線上的點應該在直線兩側。 （四）、蛋白質含量的測定： 樣品即所測蛋白質含量樣品（含量應處理在所測范圍內），依照操作步驟1操作， 測出樣品的A595nm，然後利用標准曲線或回歸方程求出樣品蛋白質含量。 一般被測樣品的A595nm值在0.1—0.05之間，所以上述樣品如果A595nm值太 大，可以稀釋後再測A595nm值，然後再計算。 （五）、注意事項： 1、 玻璃儀器要洗滌干凈。 2、 取量要准確。 3、 玻璃儀器要乾燥，避免溫度變化。 4、 對照：用被測物質以外的物質作空白對照。

I. 蛋白葯物生物學活性檢測方法有哪些

一、MTT比色法檢測細胞活性
（一）原理
活細胞內線粒體琥珀酸脫氫酶能催化無色的MTT形成藍色的甲肷，其形成的量與活細胞數和功能狀態呈正相關。對細胞活力有影響的表達蛋白活性檢測可以通過MTT比色法進行。
（二）試劑准備
1、青鏈黴素溶液（100X）：青黴素100萬U，鏈黴素100萬U，溶於100mlddH2O中,抽濾除菌。
2、L15基礎培養基：1000mlL15培養基，加2g碳酸氫鈉，10ml 100X青鏈黴素，5mlHEPES。
3、MTT液：5mg/ml溶於L15基礎培養基。
4、SDS處理液：20gSDS，50μl二甲基甲醯胺，加雙蒸水50ml溶解。
5、L-多聚賴氨酸：50μg溶於1ml雙蒸水中。
6、L15基礎培養基溶解的不同濃度的蛋白液。
（三）操作步驟（以背根神經節細胞培養為例）
1、無菌條件下取新生一天的SD大鼠背根神經節（DRG）。
2、鏡下去除神經根和外膜，放入1ml 0.1%膠原酶中37℃消化30min，每5min搖勻一次。
3、洗去膠原酶，吹打分散後，接種於預先塗有L-多聚賴氨酸的96孔培養板中，每孔含100μl無血清L15培養基，細胞約800個。
4、實驗組分別加入純化的表達蛋白（分別以不同的蛋白濃度），陰性對照加入等體積表達蛋白的溶劑。
5、37℃ 5%CO2培養48hr後，每孔加入10μl MTT，37℃ 5%CO2孵育4hr。
6、加入100μl 20%的SDS處理液，37℃孵育20hr。
7、用EL×800微孔酶標儀測定OD570值，數據分析。