檢測特異性蛋白的一般方法

Ⅰ 檢測蛋白質表達量的實驗方法有哪些，western-blotting的原理，方法

蛋白質印跡（免疫印跡試驗）即Western Blot物、物化免疫遺傳用種實驗其基本原理通特異性抗體凝膠電泳處理細胞或物組織品進行著色通析著色位置著色深度獲特定蛋白質所析細胞或組織表達情況信息
蛋白質印跡由瑞士米歇爾弗雷德希物研究所（Friedrich Miescher Institute）Harry Towbin1979提尼爾·伯奈特（Neal Burnette）於1981所著《析物化》（Analytical Biochemistry）首稱Western Blot蛋白免疫印跡（Western Blot）電泳離細胞或組織總蛋白質凝膠轉移固相支持物NC膜或PVDF膜用特異性抗體檢測某特定抗原種蛋白質檢測技術現已廣泛應用於基蛋白水平表達研究、抗體性檢測疾病早期診斷等面

Ⅱ 比SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳更加靈敏的蛋白質鑒別方法有什麼

你說的靈敏指的是特異性還是靈敏度？SDS-PAGE只是個定性的鑒別方法。
特異性上像WB，ELISA方法，原理是抗原抗體反應，能識別特異的蛋白。
靈敏度上HPLC一般是作為蛋白純度指標的檢定方法。

Ⅲ 常用的血清蛋白質含量測定方法有哪些

四種血清總蛋白質的測定的方法：

1.基於蛋白分子中含有酪氨酸和色氨酸而使用的酚試劑比色法 由於各種蛋白質分子中上述兩種氨基酸的組成比例不同，特別是白蛋白含色氨酸為0.2%，而γ-球蛋白中含量達2%-3%，導致較大的差異。Lowry的改良法在酚試劑中加入Cu2+，集中原法和雙縮脲反應兩者的作用，使呈色靈敏度提高。其中75%的呈色依賴於Cu2+.反應產物最佳吸收峰在650-750nm，方法靈敏度為雙縮脲方法的100倍左右。有利於檢測較微量的蛋白質。但試劑反應仍易受多種化合物的干擾。

2.紫外測定法 採用280nm和215/225紫外吸收值，計算蛋白質含量280nm 是由於蛋白質分子中存在芳香族氨基酸所致。方法的特異性和准確性受蛋白分子中該種氨基酸的含量比例影響甚大。尿酸和肝紅素在280nm附近有干擾。紫外區200-225nm是肽健的強吸收峰。在此區域其吸收值為280nm的10-30倍，將血清稀釋1000-2000倍可以消除干擾物質的影響。

3.採用沉澱反應進行散射比濁法 用磺柳酸、三氯醋酸等配方，此方法甚為簡便，不需特殊儀器，技術關鍵在於：①選擇最佳試劑濃度及溫度；②混勻技術；③選用的標准；④待測標本中的蛋白濃度。

4.染料結合法 蛋白質可與某些染料特異結合，如氨基黑（amino black）與考馬亮藍（comassive brilliant blue ）。這一性質除了可以用於電泳後的蛋白質區帶染色，亦可用於總蛋白質的定量。缺點是多種蛋白質與染料的結合力不一致。考馬亮藍在與蛋白質結合後的吸收峰從465nm移向595nm，這一性質可用分光光度法來定量檢測。

Ⅳ 蛋白濃度測定的方法具體有哪些

蛋白濃度測定的方法：

1. 紫外分光光度法

紫外光譜吸收法測定蛋白質含量是講蛋白質溶液直接在紫外分光光度計中測定的方法，不需要任何試劑，操作簡單且易回收。蛋白質溶液在280nm附近有強烈的吸收，這是由於蛋白質中酪氨酸、色氨酸殘基而引起的，所以光密度受這兩種氨基酸含量的支配。另外核蛋白或提取過程中雜有的核酸對測定結果引起極大誤差，其最大吸收在260nm。所以同時測定280及260nm兩種波長的吸光度，通過計算可得較為正確的蛋白質含量。

2. 雙縮脲法

利用半飽和硫酸銨或27.8％硫酸鈉——亞硫酸鈉可使血清球蛋白沉澱下來，而此時血清白蛋白仍處於溶解狀態，因此可把兩者分開，這種利用不同濃度的中性鹽分離蛋白的方法稱為鹽方法。鹽析分離蛋白質的方法不僅用於臨床醫學，而且還廣泛地用於生物化學研究工作中，如一些特殊蛋白質—酶、蛋白激素等的分離和純化。

蛋白質和雙縮脲一樣，在鹼性溶液中能與銅離子形成紫色絡合物（雙縮脲反應），且其呈色深淺與蛋白質的含量成正比，因此可於蛋白質的定量測定。

但必須注意，此反應並非蛋白質所特有，凡分子內有兩個或兩個以上的肽鍵的化合物以及分子內有—CH2—NH2等結構化合物，雙縮脲反應也呈陽性。本實驗用27.8％硫酸鈉—亞硫酸鈉溶液稀釋血清，取出一部分用雙縮脲反應測定蛋白質的含量，剩餘部分則用濾紙過濾，使析出的球蛋白與白蛋白分離，取出濾液用同一反應測定白蛋白的含量。總蛋白與白蛋白含量之差即球蛋白的含量。白蛋白與球蛋白之比即所謂的白／球比值。

3. Folin-酚試劑法

目前實驗室較多用Folin-酚法測定蛋白質含量，此法的特點是靈敏度高，較雙縮脲高兩個數量級，較紫外法略高，操作稍微麻煩，反應約在15分鍾有最大顯色，並最少可穩定幾個小時，其不足之處是干擾因素較多，有較多種類的物質都會影響測定結果的准確性。其原理是蛋白質中含有酚基的酪氨酸，可與酚試劑中的磷鉬鎢酸作用產生蘭色化合物，顏色深淺與蛋白含量成正比。

4. 考馬氏亮藍G-250

此方法是1976年Bradform建立。染料結合法測定蛋白質的優點是靈敏度較高，可檢測到微量蛋白，操作簡便、快迅，試劑配製極簡單，重復性好，但干擾因素多。考馬氏亮藍G－250具有紅色和青色兩種色調、在酸性溶液中游離狀度下為棕紅色，當它通過疏水作用與蛋白質結合後，變成藍色，最大吸收波長從465nm轉移到595nm處，在一定的范圍內，蛋白質含量與 595nm的吸光度成正比，測定595nm處光密度值的增加即可進行蛋白質的定量。

以上便是實驗室中常見的幾種蛋白濃度測定的方法，另外還有凱氏定氮法和BCA法，有凱氏定氮法結果最精確，但操作復雜，BCA法又以其試劑穩定，抗干擾能力較強，結果穩定，靈敏度高而受到歡迎。

Ⅳ 特異性蛋白質譜帶的檢出方法法有哪些

通常可以用抗體檢出；如果知道沒有其他的蛋白與其分子量相同的話，可以根據其分子量檢出；如果特異性蛋白質與GFP重組的話，也可用熒光檢出；如果具有可檢測的酶的活性的話，可以用酶活性檢出；如果知道與某種特定的分子有結合作用的話，可以用這種特定的分子檢出；如果知道其有其他特定的理化或生化性質的話可以用相應的性質檢出。

Ⅵ 蛋白質組的分析鑒定方法主要有哪些

為探究生物進程的分子機制,需要確定介導這個過程的蛋白質-蛋白質間的相互作用.研究蛋白質間相互作用的主要技術總結如下：一、酵母雙雜交系統酵母雙雜交系統是當前廣泛用於蛋白質相互作用組學研究的一種重要方法.其原理是當靶蛋白和誘餌蛋白特異結合後,誘餌蛋白結合於報道基因的啟動子,啟動報道 基因在酵母細胞內的表達,如果檢測到報道基因的表達產物,則說明兩者之間有相互作用,反之則兩者之間沒有相互作用.將這種技術微量化、陣列化後則可用於大 規模蛋白質之間相互作用的研究.在實際工作中,人們根據需要發展了單雜交系統、三雜交系統和反向雜交系統等.Angermayr等設計了一個SOS蛋白介 導的雙雜交系統.可以研究膜蛋白的功能,豐富了酵母雙雜交系統的功能.此外,酵母雙雜交系統的作用也已擴展至對蛋白質的鑒定.二、噬茵體展示技術在編碼噬菌體外殼蛋白基因上連接一單克隆抗體的DNA序列,當噬菌體生長時,表面就表達出相應的單抗,再將噬菌體過柱,柱上若含目的蛋白,就會與相應抗體 特異性結合,這被稱為噬菌體展示技術.此技術也主要用於研究蛋白質之間的相互作用,不僅有高通量及簡便的特點,還具有直接得到基因、高選擇性的篩選復雜混 合物、在篩選過程中通過適當改變條件可以直接評價相互結合的特異性等優點.目前,用優化的噬菌體展示技術,已經展示了人和鼠的兩種特殊細胞系的cDNA文 庫,並分離出了人上皮生長因子信號傳導途徑中的信號分子.三、等離子共振技術表 面等離子共振技術(Surface Plasmon Resonance,SPR)已成為蛋白質相互作用研究中的新手段.它的原理是利用一種納米級的薄膜吸附上「誘餌蛋白」,當待測蛋白與誘餌蛋白結合後,薄 膜的共振性質會發生改變,通過檢測便可知這兩種蛋白的結合情況.SPR技術的優點是不需標記物或染料,反應過程可實時監控.測定快速且安全,還可用於檢測 蛋白一核酸及其它生物大分子之間的相互作用.………………

Ⅶ 為了定位某種特異蛋白在細胞中的含量或者分布,可以採取什麼方法

免疫組化，是應用免疫學基本原理——抗原抗體反應，即抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細胞內抗原（多肽和蛋白質），對其進行定位、定性及相對定量的研究，稱為免疫組織化學技術(immunohistochemistry)或免疫細胞化學技術(immunocytochemistry)。

抗體和抗原之間的結合具有高度的特異性，免疫組織化學正是利用了這一原理。先將組織或細胞中的某種化學物質提取出來，以此作為抗原或半抗原，通過免疫動物後獲得特異性的抗體，再以此抗體去探測組織或細胞中的同類的抗原物質。由於抗原與抗體的復合物是無色的，因此還必須藉助於組織化學的方法將抗原抗體結合的部位顯示出來，以其達到對組織或細胞中的未知抗原進行定性，定位或定量的研究

Ⅷ 抗原抗體雜交

抗原抗體雜交就是Western雜交，原理
Western雜交是將蛋白質電泳、印跡、免疫測定融為一體的特異性蛋白質的檢測方法。其原理是：生物中含有一定量的目的蛋白。先從生物細胞中提取總蛋白或目的蛋白，將蛋白質樣品溶解於含有去污劑和還原劑的溶液中，經SDS-PAGE電泳將蛋白質按分子量大小分離，再把分離的各蛋白質條帶原位轉移到固相膜（硝酸纖維素膜或尼龍膜）上，接著將膜浸泡在高濃度的蛋白質溶液中溫育，以封閉其非特異性位點。然後加入特異抗性體（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）與一抗結合後，再加入能與一抗專一性結合的帶標記的二抗（通常一抗用兔來源的抗體時，二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗體），最後通過二抗上帶標記化合物（一般為辣根過氧化物酶或鹼性磷酸酶）的特異性反應進行檢測。根據檢測結果，從而可得知被檢生物（植物）細胞內目的蛋白的表達與否、表達量及分子量等情況。
Western 雜交技術是一種蛋白質的固定和分析技術，是將已用聚丙烯醯胺凝膠或其它凝膠或電泳分離的蛋白質轉移到硝酸纖維濾膜上，固定在濾膜上的蛋白質成分仍保留抗原活性及與其它大分子特異性結合的能力，所以能與特異性抗體或核酸結合，其程序Southern Blot相似，故稱為Western Blot,第一抗體與膜上特異抗原結合後，再用標記的二抗(同位素或非同位素的酶)來檢測，此方法可檢測1ng抗原蛋白。Western雜交方法靈敏度高，通常可從植物總蛋白中檢測出50ng的特異性的目的蛋白。
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試劑配製
(1)轉移電泳緩沖液：20mmol/L Tris HCL pH8.0
150mmol/L 甘氨酸
加14.5g Tris粉 67.08g甘氨酸於4L水中，加入1200mL
甲醇，加水至6L
(2)麗春紅S溶液：0.5%麗春紅S
1%乙酸
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操作步驟：
(1)用已制備好的SDS-PAGE分離的蛋白凝膠。
(2)用一張濾紙，剪成與膠同樣大小，在轉移電泳緩沖液中預濕，放在Scotch-Brit Pad上，在膠的陰性端放上濾紙，膠的表面用該緩沖液浸濕，排出所有氣泡。
(3)在膠的陽極面放置同樣大小浸濕的硝酸纖維素膜，排出氣泡，再在濾膜的陽極端放置一張濾紙，排出氣泡，再放一個Scotch-Brit Pad。
(4)將以上「三明治」樣裝置放入一個塑料支撐物中間，將支撐物放入電轉移裝置中，加入電轉移緩沖液。
(5)接通電源：使膠上的蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，電壓為14V 4℃轉移4小時或過夜。
(6)將濾膜放入麗春紅S溶液中5分鍾，蛋白染色水中脫色2分鍾，照像，用印度墨水將分子量標准染色，在水中完全脫色。
(7)將濾膜放在塑料袋中，每3張加入5mL封閉緩沖液(1克速溶去脂奶粉溶於100ml PBS中)，封閉特異性抗體結合位點，室溫1h，搖動，倒出封閉緩沖液。
(8)在封閉緩沖液中稀釋第一抗體，加入後室溫放置1小時，將濾膜轉到塑料盒中，用200mL PBS洗四次，搖動。
(9)在封閉緩沖液中稀釋辣根過氧化物酶標記的二抗，重復步驟8。
(10)將濾膜放在100mL新配製的DAB底物溶液中，大約2～3分鍾就可顯色，用水沖洗終止反應、照像。
結果分析：分析陽性(顯色)條帶的分子量大小，而且根據信號(顏色)強弱分析蛋白表達量。

Ⅸ 用什麼方法檢測細胞與組織內特異性蛋白

人類基因組(genome)含有3萬-5萬個可單拷貝的結構基因,但在一個細胞生長的特定條件下,往往只有少數基因表達.有些基因幾乎普遍地在所有細胞活躍地處於表達狀態,並保證其表達產物的功能.如多數酵解酶類蛋白,鈣調節蛋白.此外,多數細胞均有其細胞骨架的特定組分,或產生特定代謝的酶.這些蛋白在各細胞中表現出它的組織特異性(tissue-speificprotein),當有關細胞損害過程中,它們在血循環中可以出現,可以反應該細胞的特異損害.這一事實被利用於監測某組織是否進行性損害的一種非損傷性的手段,並正在發展中. 有幾種方法可以檢測出特殊蛋白的組織特異性,如果該蛋白本身就是酶,可以直接測定酶的活性.例如肌酸激酶在骨骼肌中含量很高,但它們並不存在於肝內.血清中該酶的活性可以反應肌肉的損害,特別是骨骼肌的病變--肌萎縮症,或心肌損害.如果該蛋白並非具有酶活性,但可以表現一定的抗原性,可用於制備相應的抗體,用相應的免疫學方法來檢測.新的組織特異性蛋白質也可以通過高解析度的雙相電泳色譜而定位,可以比較不同的組織,而檢出特殊器官中特異性蛋白的存在. 一個真核細胞的胞質部分(往往指細胞在去除其亞細胞的結構組分--包括線粒體和內質網及核微粒等成分後,殘留下的可溶性部分),往往尚含有20%-30%高濃度蛋白質溶液,各個蛋白質之間具有弱的相互作用