臨床檢測結核桿菌的耐葯譜的方法

『壹』 肺結核的診斷方法有哪些

1．病史和症狀體征

（1）症狀體征情況：肺結核患者的症狀一般沒有特異性，但明確症狀的發展過程對結核病診斷有重要參考意義。體征對肺結核的診斷意義有限。

（2）診斷治療過程：確定患者是新發現還是已發現病例。不少肺結核患者首次就診多在綜合醫院，且接受治療，應記錄首次診斷情況特別是痰排菌情況、用葯品種、用葯量和時間、堅持規律用葯情況等，這對將來確定治療方案有重要價值。如果是復發患者，治療史對判斷耐葯情況有參考意義。

（3）肺結核接觸史：主要是家庭內部接觸史，對鄰居、同事、宿舍等有無肺結核患者也應了解。記錄接觸患者的病情、排菌情況、治療方案和用葯規律情況、接觸時間、接觸密切程度等。

2．影像學診斷

胸部X 線檢查是診斷肺結核的重要方法，可以發現早期輕微的結核病變，確定病變范圍、部位、形態、密度、與周圍組織的關系、病變陰影的伴隨影像；判斷病變性質、有無活動性、有無空洞、空洞大小和洞壁特點等。肺結核病影像特點是病變多發生在上葉的尖後段和下葉的背段，密度不均勻、邊緣較清楚和變化較慢，易形成空洞和播散病灶。診斷最常用的攝影方法是正、側位胸片，常能將心影、肺門、血管、縱隔等遮掩的病變以及中葉和舌葉的病變顯示清晰。

CT 能提供橫斷面的圖像，減少重疊影像，易發現隱蔽的病變而減少微小病變的漏診；比普通胸片更早期顯示微小的粟粒結節；能清晰顯示各型肺結核病變特點和性質，與支氣管關系，有無空洞，以及進展惡化和吸收好轉的變化；能准確顯示縱隔淋巴結有無腫大。

常用於對肺結核的診斷以及與其他胸部疾病的鑒別診斷，也可用於引導穿刺、引流和介入性治療等。

3．痰結核分枝桿菌檢查

確診肺結核病的主要方法，也是制訂化療方案和考核治療效果的主要依據。每一個有肺結核可疑症狀或肺部有異常陰影的患者都必須查痰。

（1）痰標本的收集：肺結核患者的排菌具有間斷性和不均勻性的特點，傳染性患者查一次痰也許查不出，所以要多次查痰。菌陽患者1 個痰標本塗片檢查約80% 陽性，2 個痰標本塗片檢查約90%陽性，3 個痰標本塗片檢查約95% 陽性。通常初診患者要送三份痰標本，包括清晨痰、夜間痰和即時痰，如無夜間痰，宜在留清晨痰後2 ～ 3 小時再留一份痰標本。復診患者每次送兩份痰標本。無痰患者可採用痰誘導技術獲取痰標本。

（2）痰塗片檢查：簡單、快速、易行和可靠的方法，但欠敏感。

每毫升痰中至少含5000 ～ 10000 個細菌時可呈陽性結果。常採用的是齊－尼氏染色法。痰塗片檢查陽性只能說明痰中含有抗酸桿菌，不能區分是結核分枝桿菌還是非結核性分枝桿菌，由於非結核性分枝桿菌少，故痰中檢出抗酸桿菌有極重要的意義。

（3）培養法：結核分枝桿菌培養為痰結核分枝桿菌檢查提供准確可靠的結果，常作為結核病診斷的金標准。同時也為葯物敏感性測定和菌種鑒定提供菌株。結核分枝桿菌培養費時較長，一般為2 ～ 6周，陽性結果隨時報告，培養至8 周仍未生長者報告陰性。常用的培養方法為改良羅氏法和小川法。近期採用測定細菌代謝產物的BACTEC TB460 或BACTEC MGIT 960 法，約2 周左右可獲得結果。

（4）葯物敏感性測定：主要為臨床耐葯病例的診斷、制定合理的化療方案以及流行病學監測提供依據。

（5）其他檢測技術：如聚合酶鏈式反應（PCR）、核酸探針檢測特異性DNA 片段、色譜技術檢測結核硬脂酸和分枝菌酸等菌體特異成分以及採用免疫學方法檢測特異性抗原和抗體等，使結核病快速診斷取得一些進展，但這些方法仍在研究階段，尚需改進和完善。

4．纖維支氣管鏡檢查

纖維支氣管鏡檢查常應用於支氣管結核和淋巴結支氣管炎的診斷，支氣管結核表現為黏膜充血、潰瘍、糜爛、組織增生、形成瘢痕和支氣管狹窄，可以在病灶部位鉗取活體組織進行病理學檢查、結核分枝桿菌培養。對於肺內結核病灶，可以採集分泌物或沖洗液標本做病原體檢查，也可以經支氣管肺活檢獲取標本檢查。

5．結核菌素試驗

廣泛應用於檢出結核分枝桿菌的感染，而非檢出結核病。結核菌素試驗對兒童、少年和青年的結核病診斷有參考意義。由於許多國家和地區廣泛推行卡介苗接種，結核菌素試驗陽性不能區分是結核分枝桿菌的自然感染還是卡介苗接種的免疫反應。因此，在卡介苗普遍接種的地區，結核菌素試驗對檢出結核分枝桿菌感染受到很大限制。目前世界衛生組織和國際防癆和肺病聯合會推薦使用的結核菌素為純蛋白衍化物（purified protein derivative，PPD）PPDRT23，以便於國際結核感染率的比較。

結核菌素試驗選擇左側前臂曲側中上部l/3 處，0.lml（5IU）皮內注射，試驗後48 ～ 72 小時觀察和記錄結果，手指輕摸硬結邊緣，測量硬結的橫徑和縱徑，得出平均直徑=（橫徑＋縱徑）/2，而不是測量紅暈直徑，硬結為特異性變態反應，而紅暈為非特異性反應。

硬結直徑≤ 4mm 為陰性，5 ～ 9mm 為弱陽性，10 ～ 19mm 為陽性，≥ 20 或雖＜ 20mm 但局部出現水泡和淋巴管炎為強陽性反應。結核菌素試驗反應愈強，對結核病的診斷，特別是對嬰幼兒的結核病診斷愈重要。凡是陰性反應結果的兒童，一般來說，表明沒有受過結核分枝桿菌的感染，可以排除結核病。但在某些情況下，也不能完全排除結核病，因為結核菌素試驗可受許多因素影響，結核分枝桿菌感染後需4 ～ 8 周才建立充分變態反應，在此之前，結核菌素試驗可呈陰性；營養不良、HIV 感染、麻疹、水痘、癌症、嚴重的細菌感染包括重症結核病如粟粒性結核病和結核性腦膜炎等，結核菌素試驗結果則多為陰性和弱陽性。

『貳』 耐葯結核病的臨床表現

以下為耐葯結核病高發人群：
1、復治失敗患者或慢性患者；
2、耐葯結核病患者接觸者；
3、初治失敗；
4、短程化療2或3個月末痰菌仍陽性患者；
5、復發或返回患者；
6、暴露於耐葯結核病爆發或流行機構者；
7、耐葯結核病高流行地區；
8、服用質量差或質量不明抗結核葯物史者；
對以上患者均應行痰的結核菌培養及葯物敏感試驗明確是否為耐葯患者。 1、在耐葯結核病的化學治療中，WHO根據葯物的療效、使用經驗和葯物分類將抗結核葯物分為5組。
第1組即一線口服抗結核葯物：異煙肼(H)、利福平(R)、乙胺丁醇(E)、吡嗪醯胺(Z)、利福布汀(Rfb)；
第2組即注射用抗結核葯物：卡那黴素（Km）、丁胺卡鈉黴素（Am）、捲麴黴素（Cm）、鏈黴素(Sm)；
第3組即氟喹諾酮類葯物：氧氟沙星(Ofx)、左氧氟沙星(Lfx)、莫西沙星(Mfx)；第4組即口服抑菌二線抗結核葯物：乙硫異煙胺(Eto)、丙硫異煙胺(Pto)、環
絲氨酸(Cs)、特立齊酮(Trd)、對氨基水楊酸(PAS)；
第5組即療效尚不確切的抗結核葯物：氯法齊明(Cfz)、利奈唑胺(Lzd)、阿
莫西林/克拉維酸(Amx/Clv)、氨硫脲(Thz)、亞胺培南/西司他汀(Ipm/Cln)、大劑量異煙肼（H）、克拉黴素(Clr)。
最新的研究結果顯示，利奈唑胺對結核分枝桿菌具有強大的殺菌作用，臨床用於治療MDR-TB也取得了一定療效。二芳基喹啉類葯物、硝基咪唑吡喃類葯物、二胺類葯物、吡咯類化合物以及甲硫達嗪等對MTB均顯示了良好的殺菌活性，部分葯物正在進行臨床試驗中。
2. 耐葯結核病化療的基本原則：
(1)對耐葯結核病患者應進行早期診斷和及時治療。
(2)根據患者的用葯史、耐葯MTB菌株的流行情況以及可供選用的葯物設計化療方案。
(3)化療方案中至少應含有4種確定有效或幾乎確定有效的核心葯物(1～4組中的敏感葯物或從未使用過的葯物)。
(4)葯敏試驗結果出來前應根據國家有關規范，按照患者的結核病類型(Ⅰ～Ⅳ)給予相應的經驗性治療，待葯敏試驗結果出來後再根據病情調整用葯。需要指出的是，葯敏試驗必須是實驗室質量可以得到保證，且應具有良好的可重復性和較高的可信度。異煙肼和利福平的准確度最高；而E、Z、和S等准確度較低，第4、5組葯物可靠性也未完全肯定，因此，這些葯物的葯敏試驗結果不能完全預測該葯臨床治療是否有效或無效，在實際選葯時可不完全依賴其實驗室結果。
(5)按照5組抗結核葯物順序選葯，在1～4組抗結核葯物不足以組成有效的耐葯結核病化療方案時才考慮從第5組葯物中選擇用葯。
(6) 選用第4組葯物時應首選Eto/Pto，因其成本較低且療效確切。如果不考慮成本，應首先選用PAS，其腸衣制劑耐受性較好。如果需要從第4組葯物選用2種葯物，通常使用Cs加用Pto/Eto或PAS。Pto/Eto和PAS合用具有很高的胃腸道不良反應發生率，因此只有當第4組內的葯物全部需要選用時，才考慮將這兩種葯物聯合使用。
(7) 同一類葯物不能聯合使用，例如注射用抗結核葯物、氟喹諾酮類葯物等。
(8) 單向耐葯時務必遵循階梯用葯原則，逐級使用。
(9) 具非完全性雙向交叉耐葯的抗結核葯物例如利福類中的利福平、利福噴汀和利福布丁以及氟喹諾酮類中Ofx、Lfx和Mfx等，當耐R或Ofx時可以從利福噴汀和Rfb或Lfx和Mfx中選用，但對後者耐葯時則不能再使用前者。
(10) 具完全性雙向交叉耐葯的抗結核葯物類如氨基糖苷類中的Km和Amk、硫胺類中的Eto和Pto以及Cs和Trd，當其中任一葯物耐葯時，不能再選用同組中的另一葯物。
(11)採用全程每日用葯法。
(12)實施全程督導下化學治療管理(DOTS)。
(13)及時發現和處理抗結核葯物的不良反應。
3. 耐葯結核病化療方案的制訂：
化療仍然是耐葯結核病的主要治療手段，其化療方案應根據患者用葯史、耐葯情況以及本地區耐葯結核分枝桿菌菌株的流行情況等進行綜合制定。
單耐葯結核病往往為初始耐葯或原發性耐葯結核病，使用初治結核病標准化療方案將仍然有效。但由於此時的初治結核病標准化療方案存在著治癒率下降或增加復發的可能性，因此，對於單耐葯結核病尤其是單耐R，其化療方案應進行適當調整，以盡量避免可能存在的治療失敗和產生獲得性耐葯的風險。
多耐葯結核病的耐葯情況比單耐葯結核病要復雜許多，耐葯組合形式多樣，可分為2種葯耐葯、3種葯耐葯和4種葯耐葯3種基本類型，對於這些患者再採用標准化療方案治療會產生更大的風險，應針對各種耐葯組合的形式進行相應的葯物調整，以確保方案中有4種有效或幾乎有效的核心葯物。
MDR-TB化學治療的基本策略：
(1)標准化治療方案：該方案是指根據某國家或某地區有代表性的耐葯監測資料和不同類別患者而設計的一組治療方案，同一國家(地區)或同一類別的所有患者使用同一種治療方案。
(2)個體化治療方案：該方案則是根據每個患者抗結核治療史和葯敏試驗結果來確定的，不同患者的方案不同。
(3)經驗性治療方案：該治療方案是根據每個患者既往用葯史和某國家(地區)既往有代表性的耐葯監測資料進行確定，並可根據葯敏試驗結果進行調整，這類治療方案主要適合於不能進行葯敏試驗的地區。該基本策略也適用於其他類型耐葯結核病。
目前尚缺乏治療XDR-TB的有效化療方案，往往以營養支持、緩解症狀、改善呼吸功能、控制其他病原體感染等措施為主。對於低代氟喹諾酮類葯物耐葯而高代敏感以及注射用抗結核葯物中的Amk或Cm仍然敏感或可能敏感的話，可以再嘗試從第5組療效不確切葯物中選用2種以上葯物組成化療方案。 1、免疫治療
耐葯肺結核患者常常免疫功能低下，尤其是重症患者提高細胞免疫功能，提高吞噬細胞的吞噬能力，對消滅結核分枝桿菌有積極意義。目前研究最為活躍且比較成熟的兩類免疫制劑有細胞因子制劑如干擾素-γ(IFN-γ)和白細胞介素-2（IL-2）和母牛分枝桿菌菌苗等。
2、中醫葯治療
中醫葯通過辨證論治，對每個結核病患者進行機體調節來提高其免疫功能，改善患者的全身狀況及臨床症狀，如咯血、咳嗽、飲食、低熱、盜汗等，從而達到輔助治療耐葯結核病的作用。
3、營養支持治療
耐葯結核病可導致營養不良，而耐葯結核病患者也可因營養不良而使病情進一步惡化。因此，對耐葯結核病患者給予營養支持治療很有必要。如可添加維生素和礦物質成分，對全身情況極差、重度營養不良者可予補充脂肪乳劑、白蛋白等。
總之，耐葯結核病的治療應採取以化學治療為主的綜合性治療措施，才能取得最佳的療效。

『叄』 怎麼面對結核菌的耐葯性

結核菌的耐葯可由自發突變產生（原發性耐葯）或由用葯不當經突變選擇產生（繼發性耐葯）。但多耐的產生主要可能由於後者。耐葯基因在染色體上，對不同葯物的耐葯基因不相連接，所以聯合用葯治療有效。對異煙肼耐葯與katG基因丟失有關。易感株有該基因，耐葯株無。利福平主要作用於RNA多聚酶。編碼該酶的基因(rpoB)突變則引起對利福平耐葯。1999年國內報道7株耐利福平株全部rpoB基因發生突變。敏感株則否。科學家還發現這種細菌的遺傳選擇率低。它們通過一種稱為遺傳漂變（genetic drift）的過程積累它們的DNA的突變，而且幾乎沒有抑制這些突變的選擇壓力。由於這個原因，帶來耐葯性的突變不會從基因庫中消失，而會持續存在於種群中。

通常，帶來耐葯性的遺傳突變會對細菌造成損害，因為它們的獲得是以細菌的其他機制被削弱為代價的。細菌的這種另外的機制抑制著它們的耐葯性。但是這對於結核病並非如此。

『肆』 敘述結核桿菌的檢驗程序

結核桿菌與麻風桿菌是分枝桿菌屬中的主要病原菌。
結核桿菌菌體細長略帶彎曲，有分枝生長趨勢。菌體含脂量高，與其抗酸特性、抵抗力特性、致病性與免疫性等都有密切關系。該菌營養要求高，生長緩慢，形成「菜花狀」菌落。

一、結核桿菌檢驗程序
結核病人病灶中查到結核桿菌，是病原學診斷的重要依據，根據感染部位不同，可採集病人的痰、尿、糞便、腦脊液、胸腹水、胃液等，按以下程序進行檢驗。

二、結核桿菌培養特性
1. 液體培養基（蘇通氏培養基、小川培養基、血清酸性培養基等）結核桿菌生長表現：標本材料經前處理（即酸鹼處理，可液化標本，也可殺死雜菌，還可濃縮集菌）後接種液體培養基，35℃培養1-2周，由於表面生物，可在培養基表面表成污灰、乾燥、有皺褶的菌膜。
2. 固體培養基（改良羅氏培養基、丙酮酸鈉培養基等）結核桿菌生長表現：標本材料經前處理後，接種固體培養基，37℃培養2-4周，在培養基表面可形成乳白或米黃色、不透明、粗糙顆粒狀或節狀堆聚的菌落，呈現「菜花狀」。
3. 結核桿菌快速培養檢測方法：無菌手續將前處理後的材料塗片，置液體培養基中，35℃恆溫箱CO2培養箱內培養，3-5日後，每隔日取出一玻片，染色鏡檢，可快速獲得結果。

三、齊~尼（Ziehl-Neelsen）抗酸染色法
【原理】
結核桿菌對苯胺染料不易著色，若加溫或延長染色時間使其著色後，再用3%鹽酸酒精處理也不易脫色，再經美蘭復染，結核桿菌及其他分枝桿菌仍呈紅色，而非抗酸菌和細胞雜質等呈藍色。
【材料】
1. 結核病人痰液：採取清晨第一口粘痰，或濃縮集落菌法處理過的痰標本。
2. 抗酸染色液
3. 載物玻片、玻片夾、酒精燈、臘筆等。
【方法】
1. 無菌手續採取痰液塗片，自然乾燥，火焰固定。
2. 用臘筆將塗面局部隔開，滴加石炭酸復紅染液，酒精燈上加熱至出現蒸氣。切勿沸騰，亦不可使染液乾涸。如有乾涸的趨勢，應及時補加染液。持續染色5-8分鍾，待冷後流水漂去多餘的染液。
3. 用3%鹽酸酒精清脫色，脫至塗面無色為止，約1-3分鍾，自來水沖洗。
4. 滴加呂氏美蘭染液復雜30秒~1分鍾，水洗。自然乾燥或吸干後油鏡檢查。
【結果】
1. 結核桿菌呈現細長，略有彎曲的紅色菌體，有的可表現出分枝特徵，有的菌體表現有多數濃染顆粒。結核桿菌大多分散排列，亦可以見到有縱行條索狀排列。
2. 塗片染色能查到結核桿菌者，一般需要每毫升痰液內含菌量至少應有500個以上，甚至需達到5萬以上。故材料多進行濃縮集菌處理，以提高檢出陽性率，也造成在染色標本片觀察中，不一定每個視野都能看到結核桿菌。
3. 結核桿菌易發生變異，在陳舊培養基或臨床治療後標本材料中，結核桿菌往往菌體斷裂，或形成非抗酸性革蘭氏陽性的短桿狀、球狀顆粒，亦稱Much顆粒。
4. 標本已經高壓滅菌處理，不影響染色結果，也保證操作者的安全。

四、熒光染色法
此系用金胺熒光素染擴酸性細菌的方法，簡便易行，但不具特異性。金胺染色法有多種、現列於後表，可選擇使用，應用熒光顯微鏡檢查結果。

五、結核桿菌毒力試驗——動物試驗法

【材料】
1. 動物：體重200~250克豚鼠2隻
2. 結核桿菌培養物或結核病人檢驗材料（痰、尿、糞、腹水等材料經濃縮集菌）
3. 注射器及消毒用材料等。
【方法】
1. 選取結核菌素試驗為陰性的豚鼠兩只。
2. 吸取結核桿菌懸液或病人檢材，注入豚鼠腹股溝皮下0.1ml
3. 注射後每周定期檢查一次，觀察豚鼠腹股溝淋巴結是否腫大，局部變硬，化膿及體重減輕、體溫升高等症狀。
4. 給豚鼠作結核菌素試驗，是否出現陽性結果。
5. 6周後，將豚鼠進行解剖，觀察淋巴結是否腫大，有無乾酪性病變，肝、脾、肺等是否腫大，表面有無灰白色結節病灶，取可疑病灶進行塗片染色鏡檢和分離培養。若為陽性結果，可報告「動物接種後××天查到有結核菌感染」。如無症狀及病變者，可報告為陰性。

六、結核桿菌濃縮集菌法（以處理痰標本為例）
【材料】
結核病人24小時痰液，細口瓶，0.02%酚紅液、汽油，NaOH，無菌生理鹽水等。
【方法】
(一)漂浮法：
1. 取24小時痰液15毫升，裝入細口瓶內，加入2倍量0.5%NaOH搖勻，高壓滅菌或煮沸20—30分鍾殺菌。
2. 待冷後加入汽油2毫升（二甲苯也可以），用力振盪20—30分鍾，用生理鹽水加至液面與瓶口齊，靜置半小時。
3. 取瓶口表面油狀物塗於載物玻片上，微微加熱，干後再加，如此重復5—6次，至厚度適宜，烘乾待冷，抗酸染色，油鏡頭檢查。

(二)沉澱法：
1. 取痰液1份或2倍量4%NaOH，高壓無菌或煮沸20—30分鍾後，加入0.02%酚紅指示劑0.1毫升，劇烈振盪混勻，亦可置37℃水浴消化30分鍾。
2. 矯正PH為7.0，3000轉/分離心30分鍾，棄去上清液。
3. 取沉澱物塗片染色鏡檢。若進行分離培養和動物接種，可免去高壓滅菌或煮沸的程序。

附錄：抗酸染液的配製
1. 石炭酸復紅液：稱取鹼性復紅4克，溶於95%酒精100毫升中成飽和液。再取飽和液10毫升與5%石炭酸溶液90毫升混勻即成。
2. 3%鹽酸酒精：取濃鹽酸3毫升，95%酒 97毫升混合。
3. 呂弗勒氏鹼性美蘭液：稱取美蘭2克，溶於95%酒精100毫升中，配成飽和液，取飽和液30毫升，再加入蒸餾水100毫升及10%氫氧化鉀水溶液0.1毫升即成。

『伍』 結核桿菌用什麼方法檢測

結核桿菌培養特性 1. 液體培養基（蘇通氏培養基、小川培養基、血清酸性培養基等）結核桿菌生長表現：標本材料經前處理（即酸鹼處理，可液化標本，也可殺死雜菌，還可濃縮集菌）後接種液體培養基，35℃培養1-2周，由於表面生物，可在培養基表面表成污灰、乾燥、有皺褶的菌膜。 2. 固體培養基（改良羅氏培養基、丙酮酸鈉培養基等）結核桿菌生長表現：標本材料經前處理後，接種固體培養基，37℃培養2-4周，在培養基表面可形成乳白或米黃色、不透明、粗糙顆粒狀或節狀堆聚的菌落，呈現「菜花狀」。 3. 結核桿菌快速培養檢測方法：無菌手續將前處理後的材料塗片，置液體培養基中，35℃恆溫箱CO2培養箱內培養，3-5日後，每隔日取出一玻片，染色鏡檢，可快速獲得結果。 詳細的檢測方法生物幫上面有的，蛋白質互作 http://www.bio1000.com/zt/protein/232119.html

『陸』 什麼樣叫耐葯性結核有什麼症狀

結核病是一種經呼吸道傳播的慢性傳染病，在全球廣泛流行。如果病人感染的結核分枝桿菌對一種或一種以上的抗結核葯物產生了耐葯性，即為耐葯結核病。WHO 2008年報道顯示，全球結核病總耐葯率為20.0%，耐多葯率為5.3%，估計全球耐多葯結核病為50萬例，其中，被WHO認定的27個耐葯高負擔國家佔了病例總數的85%。特別是隨著人口的增長、世界范圍內的旅行和人口流動的增加，耐葯性肺結核病例更趨上升態勢，每年約增加30萬新病例。耐葯結核病的流行持續威脅著結核病控制工作已取得的進展，廣泛耐葯結核病的出現更加劇了這一威脅。
根據耐葯種類分為以下四種：
1、單耐葯：結核病患者感染的結核桿菌體外被證實對一種一線葯物抗結核葯物耐葯。
2、多耐葯：結核病患者感染的結核桿菌體外被證實對不同時包括異煙肼、利福平在內的一種以上的一線抗結核葯物耐葯。
3、耐多葯（MDR－TB）：結核病患者感染的結核桿菌體外被證實至少對異煙肼、利福平耐葯。
4、廣泛耐多葯（XDR－TB）：結核病患者感染的結核桿菌體外被證實除了至少對兩種主要一線抗結核葯物異煙肼、利福平耐葯外，還對任何氟喹諾酮類抗生素（如：氧氟沙星）產生耐葯，以及三種二線抗結核注射葯物（如：捲麴黴素、卡那黴素、丁胺卡那黴素等）中的至少一種耐葯。
根據病人是否接受過抗結核葯物治療以及耐抗結核葯物的種數耐葯結核病可分為：原發性耐葯、初始耐葯、獲得性耐葯、耐多葯結核。
1、原發性耐葯結核：指沒有接受過抗結核葯物治療而發生結核桿菌耐葯。
2、初始耐葯結核：指經臨床評估後，不能充分肯定以往沒有接受過抗結核葯物治療)或治療小於1個月而發生的結核桿菌耐葯。包括原發性耐葯和末發現的獲得性耐葯。
3、獲得性耐葯結核：指接受過抗結核葯物治療時間大於1個月而發生的結核桿菌耐葯。
4、耐多葯結核(MDR-TB)：指至少同時耐利福平和異煙肼的結核病人。
耐葯結核病臨床表現與普通結核病無明顯差別，臨床症狀多種多樣，輕重不等，與患者的年齡、機體的免疫狀態、營養狀態、並存疾病、入侵的結核分枝桿菌的毒力、菌量及病變部位及嚴重程度等均有關系。臨床可表現發熱、不同程度咳嗽、咳痰，部分患者可有咯血，病變廣泛時可有呼吸困難等。肺外耐葯結核病的臨床表現據不同發病部位而不同。

『柒』 如何用PCR技術檢測結核桿菌

結核桿菌可以導致全身性疾病，特別是在發展中國家，其發病率較高，危害性極大.近幾年結核桿菌的變異性較大，對抗癆葯物的耐葯性增加，從而使結核病的發病大幅度增高.雖然傳統的塗片抗酸染色、細菌培養以及胸片檢查對大部分結核能作出正確的診斷，但對某些病人亦可造成誤診或漏診;動物接種雖特異性較高，但因時間較長，不能滿足臨床快速診斷的需要.近幾年也出現了幾種快速診斷方法，但也存在較大的缺陷，如短期培養後抗原免疫原性分析，即用放免方法或酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測BACTEC培養瓶中被培養標本所分泌的抗原，該方法可在BACTEC瓶本身鑒定出細菌之前，結合ELISA和塗片抗酸染色有效地鑒別典型和非典型分枝桿菌，敏感性較高，但存在培養時間長，重復性尚差的缺點.另一種是短期培養後核酸探針雜交法，即用特異性DNA探針與BACTEC瓶中培養的細菌染色體DNA雜交.該方法能有效地防止培養的假陰性結果，但卻易發生假陽性結果，加之採用的方法較為復雜和繁瑣，又有涉及同位素操作之嫌等，因而近來已較少應用.上面兩種方法都要藉助細菌培養來進行，雖然在時間上比傳統培養大大縮短，但缺乏快速診斷的優勢.近幾年興起的PCR方法基本實現了快速、靈敏、准確地診斷結核的目的，並且該方法正趨於常規化地應用於臨床一般實驗室.應用PCR方法檢測結核桿菌的首要條件是設計一對特異性DNA引物.該引物所引導的DNA擴增序列應是結核桿菌獨有的，且是結核桿菌的保守序列，這樣才能保證檢測結果的特異性.PCR方法的另外幾個關鍵因素是:①DNA提取，即對有限的結核桿菌應盡量地將其DNA完整、全部地提取;②TaqDNA聚合酶的活性;③PCR產物的檢測方法，即將PCR產物進行快速、靈敏、安全、准確的檢測.

一、結核桿菌DNA的提取

在該技術上，目前仍無一種統一常規化的方法.現有各方法都存在著提取DNA不足的缺點，因此，敏感性受到影響.現在主要的細菌裂解方法是:①蛋白酶K加表面活性劑法;②蛋白變性劑加表面活性劑煮沸法;③反復凍融法;④超聲波法;⑤溶菌酶加表面活性劑法.提取DNA的方法主要有:①酚一氯仿提取法:即用酚一氯仿抽提含有裂解菌體的溶液，然後用乙醇從抽提後的溶液中沉澱DNA.有的學者將硅酮加入酚一氯仿中，使水相和有機相的界面更牢固，這樣不但能減少抑制因子混入水相，而且使DNA提取量比未加硅酮方法高20%～30%;②Chaotrop-silica法:用二氧化硅(sio2)吸附裂解菌體釋放出的DNA，該二氧化硅用70%乙醇洗滌，而後乾燥，最後用雙蒸水洗脫(55℃).有報道認為該方法可以消除痰中的某些抑制因子.有的學者發現未預裂解的結核桿菌直接煮沸進行PCR的效果與預先處理的相仿，提示結核桿菌不預裂解也可直接進PCR.但加入的菌數應<約1000個，否則細菌蛋白會對PCR產生抑製作用.

二、引物的設計

根據不同型結核桿菌的序列，目前常在下列幾種序列內進行引物設計.

(一)編碼結核桿菌抗原的基因序列

1.編碼65-KDa蛋白抗原的基因序列:結核桿菌65-KDa蛋白抗原為存在於所有分枝桿菌細胞壁中的熱休克蛋白，也是一種交叉反應蛋白.所以依據該序列設計合成的引物，PCR能擴增出所有分枝桿菌的靶DNA片段，沒有屬內特異性.這種PCR較適用於結核病高發區大規模篩選和流行病普查.另外，對65-KDa蛋白基因的PCR擴增產物進行限制性酶切分析(RFLP)，也可以准確地檢測出結核桿菌的屬內歸屬.

2.編碼MPB64蛋白的基因序列：MPB64蛋白為結核桿菌復合群(MTBC，包括人型結核桿菌、牛型結核桿菌、BCG、非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌)所特有.根據該蛋白的基因序列設計的引物進行PCR，對MTBC模板DNA顯示出高的特異性.

3.編碼38-KDa蛋白抗原b(Pab)的DNA序列:該序列僅存在於人型和牛型結核桿菌.採用在此基因內設計合成的引物和探針進行PCR，只能擴增人型和牛型結桿菌的DNA序列，能檢出少至10個結核桿菌的純化DNA.

4.編碼32-KDa蛋白的基因序列:32-KDa是蛋白分枝桿菌的一種分泌蛋白，由它的基因序列設計的引物和探針進行PCR，可以特異地檢測出分枝桿菌的DNA片段，能檢測出50fg的純化DNA，相當於10個結核桿菌.

5.編碼MPB70抗原的基因序列:MPB70為牛型結核桿菌所特有，由該基因序列設計的引物進行PCR，對牛型結核桿菌的檢測具有高度的特異性和敏感性.

(二)結核桿菌基因組重復序列

1.克隆DNA序列:目前所應用的DNA序列都是MTBC所特有，拷貝數在10個以上，包括亞克隆重組質粒pPH7301和克隆質粒PMTb4，分別含KpnI-SmaI插入片段和EcoRI-BamHI插入片段.根據這些基因序列設計的引物，其檢出限在20個結核桿菌以下.

2.插入序列:結核桿菌的插入序列主要有IS6110和IS986，它們僅見於MTBC.這兩種插入序列在基因組中的拷貝數為1--20個，選擇插入序列作為擴增的靶序列，可以得到較高的敏感性和特異性.尤其是IS6110，是目前進行臨床PCR檢測的首選區段.

(三)人型結核桿菌特異序列

mtp40是人型結核桿菌特異性DNA片段，Portillo等選擇mtp40作為靶序列，用PCR檢測結核桿菌，結果只能擴增人型結核桿菌DNA，敏感性達到10fg純化DNA量.

(四)分枝桿菌dnaJ基因

該基因為分枝桿菌共有，但種間又存在差別，在該基因序列內設計合成的引物和探針用於PCR檢測，能檢出50fg的純化分枝桿菌DNA，相當於10個結核桿菌.並可用於區分結核桿菌和非典型結核桿菌的鑒別診斷.

(五)rRNA序列

用「通用」引物在逆轉錄酶作用下，將16SRNA逆轉錄合成cDNA，然後對cDNA進行PCR擴增，檢出限達0.1fg化的結核桿菌rRNA.臨床標本中少至10個結核桿菌亦可被檢出，該方法由於加了一步反轉錄過程相對增加了難度，臨床一般少用.

三、PCR產物的檢測方法

通常PCR產物的檢測方法是經瓊脂糖電泳後，用溴化乙錠染色，然後在紫外燈下觀察或進一步採用標記的DNA探針雜交.為了進一步提高檢測的靈敏度，現多在引物和探針的標記上進行改進.由於放射性標記物的危害性，現多採用非放射性標記，如生物素、熒光素、酶及化學發光劑.Wilson等在巢式PCR的內側引物上分別摻入生物素和地高辛配基，這樣PCR產物兩端就分別帶有生物素和地高辛配基.PCR產物上的生物素和附著在微型滴定板表面的生物素蛋白結合，使PCR產物附著在滴定板上，另一端的地高辛配基和加入的抗地高辛配基鹼性磷酸脂酶結合形成抗地高辛配基鹼性磷酸脂酶偶合物，利用該偶合物405nm的吸收峰做光密度(OD)測定.另外，還可用吖啶酯標記探針進行雜交，用硼酸鈉將未雜交的探針分解，然後加入H2O2溶液和NaOH溶液使吖啶酯水解，最後測量吖啶的光通量.雖然這些方法安全、快速、但其敏感性還需進一步提高，操作還需進一步簡化.

四、PCR檢測結核桿菌的敏感性和特異性

(一)PCR的特異性

PCR特異性的關鍵首先取決於所選靶序列的特異性.現在常用的靶序列有:①分枝桿菌共有的靶序列，如65-KDa蛋白基因序列;②MTBC特有的靶序列，如MpB64蛋白基因序列、IS6110序列.③人型結核桿菌特異的靶序列，如mpt40序列.引物設計對PCR的特異性也至關重要.引物序列在靶DNA上的專一性、以及引物的特異性和保守性，以及引物本身的許多特性，如G+C含量引物3'未端序列的特異性和保守性及引物長度等都影響PCR的特異性，另外在設計引物時也要防止出現引物間的過多配對，以免形成過多的引物聚合體，造成非特異性擴增.

PCR擴增TB的特異性除上述先決條件外，也與PCR反應本身有極重要的關系.其中退火溫度是一個重要因素，退火溫度過低時，引物易發生非特異性結合，造成非特異性擴增.由於結核桿DNA中G+C含量高，因此可以適當提高退火溫度，以獲得更高的特異性.

另外，PCR緩沖液的組成，尤其是Mg2+濃度對PCR的特異性也有較大影響，Mg2+濃度過高，會提高PCR產物的產量，但同時也會增加非特異性擴增.

(二)PCR的敏感性

PCR的敏感性很高，一般可以檢測出1～100fg純化的結核桿菌DNA，相當於1～20個結核桿菌，這種敏感性明顯高於塗片法和培養法.PCR還可以檢出培養法易發生失敗的病例，從而大大提高菌陰結核病的診斷.另外PCR檢測TBDNA不受抗癆治療的影響，可以准確觀察抗癆治療的效果，防止血清學方法所帶來的假陰性結果.PCR敏感性受下列因素影響:①擴增靶序列的拷貝數.一般認為，結核桿菌染色體中含靶序列拷貝數越多，PCR敏感性越高，如38-KDa蛋白的基因序列在結核桿菌染色體中只有一個，而IS6110序列的拷貝數卻有10～12個，結果PCR敏感性後者比前者高100倍;②PCR的循環次數.在一定程度上，PCR循環次數越多，其敏感性就越高，但要合適.因為，循環次數過多會增加非特異性問題，造成結果判斷上的失誤，產生假陽性結果;③結核桿菌DNA的提取技術.處理標本時首先要富集(如離心)標本中的TB，使單位體積內TB含量變高，從而增加了起始模板數，有利於提高PCR的靈敏性.同時提取過程要盡可能減少抑製成份，並提高DNA的提取率.④PCR產物的檢測方法.雖然DNA探針雜交要比直接電泳法敏感性高得多，但步驟繁瑣，這也是影響PCR臨床應用的原因之一.但一般情況下，直接電泳法的敏感性完全能夠達到檢測的需要.

五.PCR在結核病臨床診斷中的應用

PCR檢測結核桿菌的優點決定了它在臨床上的應用價值和范圍，PCR檢測TB的優點主要表現如下:

1.能早期診斷TB菌血症:在TB感染的早期，特別是在TB病灶通過血源性外傳播時、及在外周血中存在極少量的TB時，PCR就能給於擴增並確診.此外，由於外周血中TB的含量甚微，又沒有新的病灶形成，因而血清學方法和物理方法均難以達到確診的目的，而對這類病灶的早期診斷在臨床治療上具有指導意義，因為早期菌血症是較易控制的，並可以防止繼發性TB病灶的形成.

2.時間短;PCR檢測TB僅需2-4h對於某些培養法難以實施的病例，PCR法則行之有效，同時提高了敏感性和特異性，可以檢測到1個TB菌.

3.有利於鑒別診斷:對於肺結核來說，其中的結核球和成人型原發性結核等，經常易於同肺癌的診斷相混淆.病灶中心部位經常出現既未見TB又未見癌細胞的壞死區.此時塗片檢測常是陰性的.在這種情況下，PCR檢測就顯得特別有效.它不但可以擴增能著色的活菌，還可以擴增已死亡的，但DNA尚未降解的死菌，從而確定這樣的病灶是惡性還是良性.在許多情況下，TB可以導致腦膜炎、胸膜炎、腹膜炎等.塗片法盡管在診斷上具有直接、簡便的優點，但敏感性差就局限了它的診斷范圍和實用價值.PCR檢測這類標本，可以說極其有效.其極高的特異性和敏感性可以很容易地確定TB性腦膜炎及TB性胸腹水.另外，對於腎結核、泌尿生殖系統結核的診斷，PCR都可以予以完成.

4.抗癆治療的評價:對於抗癆治療效果的評價，以前的方法顯得軟弱無力.而PCR法則可以通過定期檢測，採用定量PCR法確切地評價抗癆葯物的療效及殘存菌的數量和活性度.在體內一般情況下，細菌死後，其蛋白系統很快崩潰，而DNA則能相對較長時間地保存下來.這些DNA在某種情況下又會復活.所以，細胞的死亡最可靠的評價指標是其基因DNA的完全降解.特別是在許多問題未搞清楚以前，更應該以DNA的降解來判定病原體的死與活.從理論上講，PCR擴增結果將是最可靠的療效評價指標.

5.修正以往所謂「正確」的觀念:致病菌與機體的防禦系統是一對激烈的矛盾，致病菌可以以任何方式和通路打擊人體的防禦系統，以便其生存和繁殖.在健康人群和周圍環境中都攜帶或存在有大量的TB，但何時何地才會造成機體致病呢?以往認為TB很少存在於外周血，這主要是因為外周血中查不到TB，或TB已被局限在肺組織中.但很難讓人相信的是，肺部血管極其豐富，淋巴組織和血管網共同構成人體的細胞外液貯存和交換的場所.所以，二者之間的交換是經常的.這種交換就包括能透過毛細血管壁的致病菌.當然，對於TB來講，大多數細菌將被機體的免疫器官禁固起來.但仍有不少「漏網之魚」，只是以前所用的方法敏感性及特異性均不夠.但在某些情況下，如情緒低落、過度勞累、感冒等情況下，機體防禦系統功能減弱，就會造成致病菌的攻擊發生疾病.所以PCR技術對於評估臨床療效、疫情的檢控、發病機理的探討均有十分重要的意義.

六、PCR在檢測TB中的注意事項

PCR如操作不嚴格會出現假陽性和假陰性結果.

發生假陽性最常見的原因是:樣品間的污染和擴增產物的污染.樣品間的交叉污染最易發生在樣品的處理過程之中.如大家共用一個加樣器、剪刀、位置等，因此在處理活檢標本時，用剪刀剪碎組織塊，每個標本用後，剪刀應在火上燒數分鍾，以徹底清除污染在剪刀上的DNA.對於液態標本的處理，盡可能在同一管子內處理.用具應為一次性的.要解決好擴增物的污染，最佳的方式是減少操作的時間，簡化操作手續並使用一次性離心管及接頭.因為擴增產物的量一般很高，易於污染實驗室任何地方.所以減少打開反應管的次數會降低假陽性的發生率.

『捌』 關於多重耐葯菌監測，包括哪些內容

具體如下：

加強對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）、耐萬古黴素腸球菌（VRE）、產超廣譜β-內醯胺酶（ESBLs）的細菌和多重耐葯的鮑曼不動桿菌等實施目標性監測。

及時發現、早期診斷多重耐葯菌感染患者和定植患者，加強微生物實驗室對多重耐葯菌的檢測及其對抗菌葯物敏感性、耐葯模式的監測，根據監測結果指導臨床對多重耐葯菌醫院感染的控制工作。

多重耐葯菌（MDRO）主要時指對臨床使用的三類或三類以上抗菌葯物同時呈現耐葯的細菌，常見的有耐甲氧金黃葡萄球菌（MRSA），耐萬古黴素腸球菌（VRE），產超光譜β-內醯胺酶（ESBLS）細菌，耐碳青黴稀類抗菌葯物腸桿菌（CRE），耐碳青黴稀類抗菌葯物鮑曼不動桿菌（CR-AS），多重耐葯/泛耐葯性銅綠假單胞菌（MDR/PDR-PA）和多重耐葯結核分枝桿菌等。

抗菌葯物在人類戰勝各種感染性疾病的過程中發揮了關鍵作用，但由於抗菌葯物不合理使用﹑免疫抑制劑應用以及侵入性操作的開展，導致多重耐葯菌（MORO）的感染形勢日益嚴峻，由於多重耐葯菌存在對多種抗菌葯物無效的特徵，且常定植於患者體內形成潛在感染源，故一旦在醫院內出現感染或傳播，將十分難以控制，給治療和防控帶來很大壓力。

(8)臨床檢測結核桿菌的耐葯譜的方法擴展閱讀：

醫療機構應當採取措施，有效預防和控制多重耐葯菌的傳播。主要包括：

（一）加強醫務人員的手衛生。

醫務人員對患者實施診療護理活動過程中，應當嚴格遵循手衛生規范。醫務人員在直接接觸患者前後、對患者實施診療護理操作前後、接觸患者體液或者分泌物後、摘掉手套後、接觸患者使用過的物品後以及從患者的污染部位轉到清潔部位實施操作時，都應當實施手衛生。手上有明顯污染時，應當洗手；無明顯污染時，可以使用速干手消毒劑進行手部消毒。

（二）嚴格實施隔離措施。

醫療機構應當對多重耐葯菌感染患者和定植患者實施隔離措施，首選單間隔離，也可以將同類多重耐葯菌感染患者或者定植患者安置在同一房間。不能將多重耐葯菌感染患者或者定植患者與氣管插管、深靜脈留置導管、有開放傷口或者免疫功能抑制患者安置在同一房間。

醫務人員實施診療護理操作中，有可能接觸多重耐葯菌感染患者或者定植患者的傷口、潰爛面、粘膜、血液和體液、引流液、分泌物、痰液、糞便時，應當使用手套，必要時使用隔離衣。完成對多重耐葯菌感染患者或者定植患者的診療護理操作後，必須及時脫去手套和隔離衣。

（三）切實遵守無菌技術操作規程。

醫務人員應當嚴格遵守無菌技術操作規程，特別是實施中心靜脈置管、氣管切開、氣管插管、留置尿管、放置引流管等操作時，應當避免污染，減少感染的危險因素。

（四）加強醫院環境衛生管理。

醫療機構應當加強診療環境的衛生管理，對收治多重耐葯菌感染患者和定植患者的病房，應當使用專用的物品進行清潔和消毒，對患者經常接觸的物體表面、設備設施表面，應當每天進行清潔和擦拭消毒。出現或者疑似有多重耐葯菌感染暴發時，應當增加清潔和消毒頻次。

四、加強抗菌葯物的合理應用

醫療機構應當認真落實《抗菌葯物臨床應用指導原則》和《衛生部辦公廳關於進一步加強抗菌葯物臨床應用管理的通知》（衛辦醫發〔2008〕48號）要求，嚴格執行抗菌葯物臨床應用的基本原則，正確、合理地實施抗菌葯物給葯方案，加強抗菌葯物臨床合理應用的管理，減少或者延緩多重耐葯菌的產生。

五、加強對醫務人員的教育和培訓

醫療機構應當對全體醫務人員開展有關多重耐葯菌感染及預防、控制措施等方面知識的培訓，強化醫務人員對多重耐葯菌醫院感染控制工作的重視，掌握並實施預防和控制多重耐葯菌傳播的策略和措施，保障患者的醫療安全。

六、加強對醫療機構的監管

地方各級衛生行政部門應當高度重視多重耐葯菌的醫院感染預防與控制工作，加強對醫療機構的監督、管理和指導，促進醫療機構切實實施預防、控制多重耐葯菌感染的各項工作措施，保障醫療安全。

『玖』 結核病的實驗室檢查具體有什麼呢

結核病的實驗室檢查有這些：

（1）結核菌細菌學檢查痰塗片查抗酸桿菌是WHO推薦的肺 結核診斷方法，是全世界的結核病實驗室都在使用的最基本的細菌學檢 查方法。痰塗片檢查不僅可以明確結核病傳染源，而且十分經濟，符合 我國國情。塗片的優點是簡便、快速、價廉。塗片的缺點是陽性率低。 結核菌培養仍是目前診斷支氣管結核病（MTB)的金標准，缺點是培養 時間長，特異性差。(2) 免疫學檢測技術

① 皮膚變態反應：結核菌素或PPD實驗，臨床意義同前。

② 結核抗體測定：目前常用的檢測方法主要有ELISA、免疫層析試 驗、免疫印跡試驗和蛋白晶元技術等檢測血清抗體方法。

③ 結核抗原測定和循環免疫復合物（CIC)測定。

(3) 干擾素分析為體外測定結核菌抗原刺激誘發的T淋巴細胞分 泌y干擾素（IFN-y)的方法。(4) 分子生物學方法檢測核酸雜交、聚合酶鏈式反應（PCR)可 檢測樣本中的結核桿菌核酸，並能鑒別耐葯株。

(5) 血沉多增快，結合臨床表現及X線檢查可協助判斷結核病的 活動性。