基因多態性的檢測方法

㈠ 基因檢測方法有好幾種，哪一種方式比較好

需要按照實際需求去選擇，沒有哪個最好的說法，合適的就是最好的
常用基因診斷技術：
一、Southern印跡法（Southern blot）

基本原理是：硝酸纖維膜或尼龍濾膜對單鏈DNA的吸附能力很強，當電泳後凝膠經過DNA變性處理，覆以上述濾膜，再於其上方壓上多層乾燥的吸水紙，藉助它對深鹽溶液的上吸作用，凝膠上的單鏈DNA將轉移到濾膜上。轉移是原位的，即DNA片段的位置保持不變。轉移結束後，經過80℃烘烤的DNA，將原位地固定於膜上。
當含有特定基因片段已原位轉移到膜上後，即可與同位素標記了的探針進行雜交，並將雜交的信號顯示出來。雜交通常在塑料袋中進行，袋內放置上述雜交濾膜，加入含有變性後探針的雜交溶液後，在一定溫度下讓單鏈探針DNA與固定於膜上的單鏈基因DNA分子按鹼基到互補原理充分結合。結合是特異的，例如只有β珠蛋白基因DNA才能結合上β珠蛋白的探針。雜交後，洗去膜上的未組合的探針，將Ⅹ線膠片覆於膜上，在暗盒中日光進行放射自顯影。結合了同位素標記探針的DNA片段所在部位將顯示黑色的雜交帶，基因的缺失或突變則可能導致帶的缺失或位置改變。

二、聚合酶鏈反應

近年來，基因分析和基因工程技術有了革命性的突破，這主要歸功於聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction,PCR）的發展和應用。應用PCR技術可以使特定的基因或DNA片段在短短的2－3小時內體外擴增數十萬至百萬倍。擴增的片段可以直接通過電泳觀察，也可用於進一步的分析。這樣，少量的單拷貝基因不需通過同位素提高其敏感性來觀察，而通過擴增至百萬倍後直接觀察到，而且原先需要一、二周才能作出的診斷可以縮短至數小時。

三、擴增片段長度多態性

小衛星DNA和微衛星DNA的長度多態性可以通過PCR擴增後電泳來檢出，並用於致病基因的連鎖分析，這種診斷方法稱為擴增片段長度多態性（amplified fragment length polymorphism,Amp-FLP）連鎖分析法。PCR擴增後，產物即等位片段之間的差別有時只有幾個核苷酸，故需用聚丙烯醯胺凝膠電泳分離鑒定。此法多用於突變性質不明的連鎖分析.

四、等位基因的特異寡核苷酸探針診斷法

當基因的突變部位和性質已完全明了時，可以合成等基因特異的寡核苷酸探針（allele-specific oligonucleotide,ASO）用同位素或非同位素標記進行診斷。探針通常為長20bp左右的核苷酸。用於探測點突變時一般需要合成兩種探針，與正常基因序列完全一致，能與之穩定地雜交，但不能與突變基因序列雜交；另一種與突變基因序列一致，能與突變基因序列穩定雜交，但不能與正常基因序列穩定雜交，這樣，就可以把只有一個鹼基發生了突變的基因區別開來.

PCR可結合ASO，即PCR－ASO技術，即先將含有突變點的基因有關片段進行體外擴增，然後再與ASO探針作點雜交，這樣大大簡化了方法，節約了時間，而且只要極少量的基因組DNA就可進行。

五、單鏈構象多態性診斷法

單鏈構象多態性（signle strand conformation polymorphism,SSCP）是指單鏈DNA由於鹼基序列的不同可引起構象差異，這種差異將造成相同或相近長度的單鏈DNA電泳遷移率不同，從而可用於DNA中單個鹼基的替代、微小的缺失或手稿的檢測。用SSCP法檢查基因突變時，通常在疑有突變的DNA片段附近設計一對引物進行PCR擴增，然後將擴增物用甲醯胺等變性，並在聚丙烯醯胺凝膠中電泳，突變所引起的DNA構象差異將表現為電泳帶位置的差異，從而可據之作出診斷。

㈡ 如何用PCR方法檢測基因的多樣性

多態性（polymorphism）是指處於隨機婚配的群體中，同一基因位點可存在2種以上的基因型。在人群中，個體間基因的核苷酸序列存在著差異性稱為基因（DNA）的多態性(gene polymorphism)。這種多態性可以分為兩類，即DNA位點多態性(site polymorphism)和長度多態性 (longth polymorphism)。

基因多態性的主要檢測方法簡述如下：
1．限制性片段長度多態性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）：由DNA 的多態性，致使DNA 分子的限制酶切位點及數目發生改變，用限制酶切割基因組時，���鈉�問�亢兔扛銎�蔚某ざ染筒煌��此�降南拗菩雲�緯ざ榷嗵�裕�賈孿拗破�緯ざ確⑸�謀淶拿蓋形壞悖�殖莆�嗵�暈壞恪W鈐縭怯肧outhern Blot/RFLP方法檢測，後來採用聚合酶鏈反應（PCR）與限制酶酶切相結合的方法。現在多採用PCR-RFLP法進行研究基因的限制性片段長度多態性。

2．單鏈構象多態性（SSCP）：是一種基於單鏈DNA構象差別的點突變檢測方法。相同長度的單鏈DNA如果順序不同，甚至單個鹼基不同，就會形成不同的構象。在電泳時泳動的速度不同。將PCR產物經變性後，進行單鏈DNA凝膠電泳時，靶DNA中若發生單個鹼基替換等改變時，就會出現泳動變位（mobility shift），多用於鑒定是否存在突變及診斷未知突變。

3．PCR-ASO探針法（PCR-allele specific oligonucleotide, ASO）：即等位基因特異性寡核苷酸探針法。在PCR擴增DNA片段後，直接與相應的寡核苷酸探雜交，即可明確診斷是否有突變及突變是純合子還是雜合子。其原理是：用PCR擴增後，產物進行斑點雜交或狹縫雜交，針對每種突變分別合成一對寡核苷酸片段作為探針，其中一個具有正常序列，另一個則具有突變鹼基。突變鹼基及對應的正常鹼 基勻位於寡核苷酸片段的中央，嚴格控制雜交及洗脫條件，使只有與探針序列完全互補的等位基因片段才顯示雜交信號，而與探針中央鹼基不同的等位基因片段不顯示雜交信號，如果正常和突變探針都可雜交，說明突變基因是雜合子，如只有突變探針可以雜交，說明突變基因為純合子，若不能與含有突變序列的寡核苷探針雜交，但能與相應的正常的寡核苷探針雜交，則表示受檢者不存在這種突變基因。若與已知的突變基因的寡核苷探針勻不能雜交，提示可能為一種新的突變類型。

4. PCR-SSO法：SSO技術即是順序特異寡核苷酸法（Sequence Specific Oligonucleotide, SSO）。原理是PCR基因片段擴增後利用序列特異性寡核苷酸探針，通過雜交的方法進行擴增片段的分析鑒定。探針與PCR產物在一定條件下雜交具有高度的特異性，嚴格遵循鹼基互補的原則。探針可用放射性同位素標記，通過放射自顯影的方法檢測，也可以用非放射性標記如地高辛、生物素、過氧化物酶等進行相應的標記物檢測。

5. PCR-SSP法：序列特異性引物分析即根據各等位基因的核苷酸序列，設計出一套針對每一等位基因特異性的（allele-specific）、或組特異性 (group-specific)的引物，此即為序列特異性引物（SSP）。SSP只能與某一等位基因特異性片段的鹼基序列互補性結合，通過PCR特異性地擴增該基因片段，從而達到分析基因多態性的目的。

6. PCR-熒光法：用熒游標記PCR引物的5』端，熒光染料FAM和JOE呈綠色熒光，TAMRA呈紅色熒光，COUM 呈蘭色熒光，不同熒游標記的多種引物同時參加反應，PCR擴增待檢測的DNA，合成的產物分別帶有引物5』端的染料，很容易發現目的基因存在與否。

7. PCR-DNA測序：是診斷未知突變基因最直接的方法，由於PCR技術的應用，使得DNA 測序技術從過去的分子克隆後測序進入PCR直接測序。PCR產物在自動測序儀上電泳後測序。常用方法有：Sanger雙脫氧末端終止法;Maxam-Gilbert化學裂解法；DNA測序的自動化。目前DNA順序全自動激光測定法是最先進的方法。

8. PCR指紋圖法（PCR-fingerprints）：實用於快速的同種異型DR/Dw配型。在DR/DW純合子及雜合子個體中，每種DR單倍型及每種單倍型組合所產生的單鏈環狀結構的大小、數目和位置各異，由於同質雙鏈和異質雙鏈之間的分子構象不同。因此，在非變性聚丙烯醯胺凝膠電泳時，它們的遷移率各不相同，從而獲得單倍型特異的電泳帶格局即PCR指紋。也有人用人工合成的短寡核苷酸片段作為探針，同經過酶切的人體DNA作Southern blot，可以得出長度不等的雜交帶，雜交帶的數目和分子量的大小具有個體特異性，除非同卵雙生，幾乎沒有兩個人是完全相同的，就象人的 指紋一樣，人們把這種雜交帶圖形稱為基因指紋(gene finger-printing)。

9. 基因晶元法：又稱為DNA 微探針陣列（Micro array）。它是集成了大量的密集排列的大量已知的序列探針，通過與被標記的若干靶核酸序列互補匹配，與晶元特定位點上的探針雜交，利用基因晶元雜交圖象，確定雜交探針的位置，便可根據鹼基互補匹配的原理確定靶基因的序列。這一技術已用於基因多態性的檢測。對多態性和突變檢測型基因晶元採用多色熒光探針雜交技術可以大大提高晶元的准確性、定量及檢測范圍。應用高密度基因晶元檢測單鹼基多態性，為分析SNPs提供了便捷的方法。

10. AFLP（Amplication Fragment Length Polymorphism）法
AFLP技術是一項新的分子標記技術，是基於PCR技術擴增基因組DNA限制性片段，基因組DNA先用限制性內切酶切割，然後將雙鏈接頭連接到DNA片段的末端，接頭序列和相鄰的限制性位點序列，作為引物結合位點。限制性片段用二種酶切割產生，一種是罕見切割酶，一種是常用切割酶。它結合了RFLP和PCR技術特點，具有RFLP技術的可靠性和PCR技術的高效性。由於AFLP擴增可使某一品種出現特定的DNA譜帶，而在另一品種中可能無此譜帶產生，因此，這種通過引物誘導及DNA擴增後得到的DNA多態性可做為一種分子標記。AFLP可在一次單個反應中檢測到大量的片段。以說AFLP技術是一種新的而且有很大功能的DNA指紋技術。

11. DGGE（denaturing gradinent electrophoresis,DGGE）法
變性梯度凝膠電泳法（） DGGE法分析PCR產物，如果突變發生在最先解鏈的DNA區域，檢出率可達100％，檢測片段可達1kb，最適圍為100bp-500bp。基本原理基於當雙鏈DNA在變性梯度凝膠中進行到與DNA變性濕度一致的凝膠位置時，DNA發生部分解鏈，電泳適移率下降，當解鏈的DNA鏈中有一個鹼基改變時，會在不同的時間發生解鏈，因影響電泳速度變化的程度而被分離。由於本法是利用溫度和梯度凝膠遷移率來檢測，需要一套專用的電泳裝置，合成的PCR引物最好在5`末端加一段40bp-50bp的GC夾，以利於檢測發生於高熔點區的突變。在DGGE的基礎上，又發展了用濕度梯度代替化學變性劑的TGGE法（溫度梯度凝膠電泳temperature gradient gelelectrophoresis,TGGE）。DGGE和TGGE均有商品化的電泳裝置，該法一經建立，操作也較簡便，適合於大樣本的檢測篩選。
12. RAPD（Random amplified polymorphic DNA）法
運用隨機引物擴增尋找多態性DNA片段可作為分子標記。這種方法即為RAPD( Random amplified polymorphic DNA，隨機擴增的多態性DNA)。盡管RAPD技術誕生的時間很短, 但由於其獨特的檢測DNA多態性的方式以及快速、簡便的特點,使這個技術已滲透於基因組研究的各個方面。該RAPD技術建立於PCR技術基礎上,它是利用一系列(通常數百個)不同的隨機排列鹼基順序的寡聚核苷酸單鏈(通常為10聚體)為引物,對所研究基因組DNA進行PCR擴增.聚丙烯醯胺或瓊脂糖電泳分離,經EB染色或放射性自顯影來檢測擴增產物DNA片段的多態性,這些擴增產物DNA片段的多態性反映了基因組相應區域的DNA多態性。RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同,但對於任一特異的引物,它同基因組DNA序列有其特異的結合位點.這些特異的結合位點在基因組某些區域內的分布如符合PCR擴增反應的條件,即引物在模板的兩條鏈上有互補位置,且引物3'端相距在一定的長度范圍之內,就可擴增出DNA片段.因此如果基因組在這些區域發生DNA片段插入、缺失或鹼基突變就可能導致這些特定結合位點分布發生相應的變化,而使PCR產物增加、缺少或發生分子量的改變。通過對PCR產物檢測即可檢出基因組DNA的多態性。分析時可用的引物數很大,雖然對每一個引物而言其檢測基因組DNA多態性的區域是有限的,但是利用一系列引物則可以使檢測區域幾乎覆蓋整個基因組。因此RAPD可以對整個基因組DNA進行多態性檢測。另外，RAPD片段克隆後可作為RFLP的分子標記進行作圖分析。

㈢ aldh2基因多態性如何檢測

測序，RFLP，RT-PCR，晶元，HRM，dHPLC，很多方法都可以檢測。

㈣ 如何用dnasp分析多態性原理是什麼

RAPD技術是建立在PCR技術的基礎上，它用一系列(通常數百個)不同的隨機排列鹼基序列的寡核苷酸單鏈(一般為10個bp)作為引物，對所研究的基因組DNA進行單引物擴增。模板DNA經90—94變性 解鏈後在較低溫度(36～37℃)下退火，這時形成的單鏈模板會有許多位點與引物互補配對，在 72℃下，通過鏈延伸，形成雙鏈結構，完成DNA合成。重復上述過程，即可產生片段大小不等的擴增產物，通過電泳分離和顯色便可得到許多不同的條帶，從中 篩選出特徵性條帶。擴增產物片段的多態性反映了基因組DNA的多態性。如果基因組在這些區域內發生DNA片段插入、缺失或鹼基突變就可能導致這些特定結合 位點的分布發生相應的變化，而使PCR產物增加、缺少或發生分子量的改變。因此，通過對PCR產物的檢測即可測出基因組DNA在這些區域的多態性。進行 RAPD分析時，可用引物的數量很大，雖然對每個引物而言，其檢測基因組DNA多態性的區域是有限的，但是利用一系列引物則可以使檢測區域幾乎覆蓋整個基 因組。因此，RAPD可以對整個基因組DNA進行多態性檢測。

RAPD技術的優點：
①不使用同位素，減少了對工作人員健康的危害；
②可以在物種沒有任何分子生物學研究 的情況下分析其DNA多態性；
③對模板 DNA的純度要求不高；
④技術簡單，無需克隆DNA探針，無需進行分子雜交；
⑤靈敏度高，可提供豐富的多態性；
⑥RAPD引物沒有嚴格的種屬界限，同一套 引物可以應用於任何一種生物的研究，因而具有廣泛性、通用性。
但是，RAPD技術較易受到各種因素的影響。無論是模板的質量和濃度，短的引物序列，PCR的循環次數，基因組DNA的復雜性，技術設備等，都有可 能是RAPD技術重復性差的直接原因。目前，多從以下幾個方面來提高反應的穩定性：
①操作規范，反應體系的組成要力求一致，盡可能地使RAPD反應標准 化；
②提高擴增片段的解析度；
③將RAPD標記轉化為SCAR標記後再進行常規的PCR分析，可以提高反應的穩定性及可靠性。
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㈤ 基因多態性檢測方法有哪些

1．限制性片段長度多態性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）：由DNA 的多態性，致使DNA 分子的限制酶切位點及數目發生改變，用限制酶切割基因組時，所產生的片段數目和每個片段的長度就不同，即所謂的限制性片段長度多態性

㈥ 要做基因多態性分析，哪種方法提取DNA要好點

1．限制性片段度態性（Restriction Fragment Length PolymorphismRFLP）：由DNA 態性致使DNA 限制酶切位點及數目發改變用限制酶切割基組所產片段數目每片段度同即所謂限制性片段度態性導致限製片段度發改變酶切位點稱態性位點早用Southern Blot/RFLP檢測採用聚合酶鏈反應（PCR）與限制酶酶切相結合現採用PCR-RFLP進行研究基限制性片段度態性
2．單鏈構象態性（SSCP）：種基於單鏈DNA構象差別點突變檢測相同度單鏈DNA順序同甚至單鹼基同形同構象電泳泳速度同PCR產物經變性進行單鏈DNA凝膠電泳靶DNA若發單鹼基替換等改變現泳變位（mobility shift）用於鑒定否存突變及診斷未知突變

㈦ 常用的基因突變檢測方法有哪些

1、焦磷酸測序法

測序法的基本原理是雙脫氧終止法，是進行基因突變檢測的可靠方法，也是使用最多的方法。但其過程繁瑣、耗時長，靈敏度不高，對環境和操作者有危害，故在臨床應用中存在一定的限制。

焦磷酸測序法適於對已知的短序列的測序分析，其可重復性和精確性能與SangerDNA測序法相媲美，而速度卻大大的提高。

焦磷酸測序技術產品具備同時對大量樣品進行測序分析的能力。為大通量、低成本、適時、快速、直觀地進行單核苷酸多態性研究和臨床檢驗提供了非常理想的技術操作平台。

2、微數字聚合酶鏈反應

該方法為將樣品作大倍數稀釋和細分，直至每個細分試樣中所含有的待測分子數不超過1個，再將每個細分試樣同時在相同條件下聚合酶鏈反應後，通過基因晶元逐個計數。該方法為絕對定量的方法。

3、聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性分析技術

聚合酶鏈式反應（PCR）是一種用於放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加。該法一般用於檢測已知的突變位點。

因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發、皮膚或血液，只要能分離出一丁點的DNA，就能用PCR加以放大，進行比對。這也是「微量證據」的威力之所在。

由1983年美國Mullis首先提出設想，1985年由其發明了聚合酶鏈反應，即簡易DNA擴增法，意味著PCR技術的真正誕生。到如今2013年，PCR已發展到第三代技術。1976年，台灣科學家錢嘉韻，發現了穩定的Taq DNA聚合酶，為PCR技術發展也做出了基礎性貢獻。

PCR是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈，低溫（經常是60°C左右）時引物與單鏈按鹼基互補配對的原則結合，再調溫度至DNA聚合酶最適反應溫度（72°C左右）。

DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈。基於聚合酶製造的PCR儀實際就是一個溫控設備，能在變性溫度，復性溫度，延伸溫度之間很好地進行控制。

4、高效液相色譜法

該方法是基於發生錯配的雜合雙鏈DNA與完全匹配的純合雙鏈DNA解鏈特徵的差異而進行檢測的，可檢測出含有單個鹼基的置換、插入或缺失的異源雙鏈片段。

與測序法相比，該法簡單、快速，不僅可用於已知突變的檢測，還可用於未知突變的掃描。但只能檢查有無突變，不能檢測出突變類型，結果判斷容易出錯。

5、單鏈構象異構多態分析技術

依據單鏈DNA在某一種非變性環境中具有其特定的第二構象，構象不同導致電泳的遷移率不同，從而將正常鏈與突變鏈分離出來。與測序法相比，靈敏性更高。

㈧ PCR-RFLP檢測基因多態性的機理和主要實驗步驟

基因多態性的產生原因是一個也可以是多個核酸序列有所差異，而不產生顯性的生物結果．

造成的對於實驗原理的影響是，該差異通常造成產生一個酶切位點的特性，而無差異則不具有，也可以是原來有，差異後消失．總之可以利用酶切來判斷有無這種差異．

PCR的作用主要是擴充酶切原料，所以PCR的引物設計在你下一步要切割的兩側即可，PCR通常的高效擴充大約是復制100-500個BP的產物，當然隨著現代技術的提高，也沒有必要強行復合這個原則．

另外，由於將來切完了要電泳看，所以最好設計的時候切的位置不在中心．當然這點我覺得不是那麼重要了．

PCR完跑跑電泳試試，能清晰看到就好．

然後就內切酶來切，注意避免incomplete digest,就是最好切的時間充足BUFFER濃度要正確．

切完了跑，能看出不同的，就是有差異．

舉例，原本含有GGACCC，有差異的是GGGCCC，那麼原本的不能被APAI 切，有差異的能．

PCR復制，不管是啥，把這段爭議的包含在裡面，然後APAI切了跑．比如說復制500BP，切了以後理論是200+300

如果完全不切，只見500，那就是沒差異序列存在．

如果既有500，也有200 +300， 那麼就可能是一個序列有，另外一個無．當然，也可能是酶切不徹底，要避免．

如果只有200+300，那麼就是兩個序列都有．

最後基本上定論還是需要SEQUENCING來定． RFLP常常是用來SCREENING一下．