1. 免疫測定方法是怎樣的
農葯殘留免疫分析方法(Immunoassay,IA)是以抗原與抗體的特異性、可逆性結合反應為基礎,把抗體作為生物化學檢測器對化合物、酶或蛋白質等物質進行定性和定量分析的一門技術。免疫反應涉及抗原與抗體分子間的立體化學、電荷、氫鍵和偶極間的綜合應用,具有常規理化分析技術無可比擬的選擇性和高靈敏度,常適宜於復雜基質中痕量組分的分析。自20世紀80年代初,Hammock等(1980)首先將免疫分析應用於農葯殘留分析以來,該法得到不斷改進和發展,並涌現出諸多各具特色的免疫分析方法。如放射免疫分析法(RIA)、酶免疫分析法(EIA)、熒光免疫分析法(FIA)、化學發光免疫分析法(CLIA)、免疫金沉析法等。由於免疫化學分析技術具有簡單、快速、靈敏及價廉的特點,能在野外和實驗室內進行大批量的篩選試驗等優點,已經成為農葯殘留分析領域中最有發展和應用潛力的痕量分析技術之一。
1.半抗原的設計與合成
農葯相對分子質量一般小於1000,不具備刺激機體產生針對農葯抗原決定簇的特異性,需與大分子物質連接後才能刺激機體產生抗體。在對某一農葯進行免疫分析前,一般要對農葯分子進行結構修飾或重新設計、合成出相應的半抗原。半抗原的結構對方法的檢出限和選擇性至關重要。Jung等認為半抗原的設計與合成一般要符合幾個原則1:
1免疫競爭性反應的總體原則
(1)半抗原結構中應具備適當末端活性基團。如-NH2、-COOH、-OH、-SH等,可直接與載體(一般為蛋白質)耦聯。
(2)理想的半抗原。與載體連接後應保證該特徵結構能最大程度地為免疫活性細胞識別和結合,以制備出具有預期選擇性和親和性的抗體。因此,活性基團與載體之間應具備一定長度的間隔臂,一般為4~6個碳鏈長度(0.5~0.8nm),太短則載體的空間位阻影響免疫系統對半抗原的識別,過長則可能因氫鍵(某些極性間隔臂)或疏水交互作用(非極性間隔臂)使半抗原發生「折疊」。同時,間隔臂一般為非極性,且除供耦聯的活性基團外,不應有其他高免疫活性的結構,如苯環、雜環等,以降低抗體對間隔臂的識別和間隔臂對待測物結構特徵的影響;間隔臂還應遠離待測物的特徵結構部分和官能團,有利高選擇性和高親和性抗體的產生。
(3)半抗原應能最大限度模擬待測分子結構,特別是立體結構:半抗原設計還應考慮結構中盡量保留芳香環。據統計,半抗原結構中有芳香環形成的抗原具有較強的免疫原性,可使機體產生較強的免疫應答,平均成功率大約為1/3,而未含芳香環的半抗原成功率僅佔1/11。
(4)半抗原的設計應考慮到有毒理學意義的代謝產物,以及待測物是單一品種或者某一類農葯。設計時需相應地突出特定農葯的結構或者一類農葯中共有的結構特徵。對應的抗體稱為單一特異性抗體或者簇特異性抗體,而簇特異性抗體可用於多殘留分析。
2. 免疫學檢驗常用技術有哪些
以下是幾種常用的免疫學技術:
1.免疫熒光技術
免疫熒光技術是利用熒光素標記的抗體(或抗原)檢測組織、細胞或血清 中的相應抗原(或抗體)的方法。由於熒光抗體具有安全、靈敏的特點,因此已 廣泛應用在免疫熒光檢測和流式細胞計數領域。根據熒光素標記的方式不同,可 分為直標熒光抗體和間標熒光抗體。間標熒光抗體中一抗並不直接連接熒光素, 而是先將一抗結合到蛋白,然後帶有熒光素的二抗再結合至一抗。通過二抗的結 合,能將信號進行放大,因此能在一定程度上提高檢測的靈敏度,但是隨之帶來 的高背景也降低了檢測的特異性。近年來,隨著熒光素和熒光檢測技術的不斷進 步,熒光檢測的靈敏度已經接近同位素檢測的水平,直接標記的熒光抗體逐漸取 代間接標記抗體。這些標記了熒光素的抗體直接結合至抗原,大大提高了檢測的 特異性,使檢測的結果更加准確可靠。熒光檢測技術的發展,使得免疫熒光技術 在傳染病診斷上有廣泛的用途,如在細菌、病毒、螺旋體感染的疾病,檢查IgM 抗體,做為近期接觸抗原的標志。利用單克隆熒光直接標記抗體鑒定淋巴細胞的 亞類。通過流式細胞儀,針對細胞表面不同抗原,可以同時使用多種不同的熒光 抗體,對同一細胞進行多標記染色。
2.放射免疫檢測
放射免疫檢測技術是目前靈敏度最高的檢測技術,利用放射性同素標記抗 原(或抗體),與相應抗體(或抗原)結合後,通過測定抗原抗體結合物的放射 性檢測結果。放射性同位素具有pg 級的靈敏度,且利用反復曝光的方法可對痕 量物質進行定量檢測。但放射性同位素對人體的損傷也限制了該方法的使用。
3.酶聯免疫吸附試驗(ELISA)
酶聯免疫檢測是目前應用最廣泛的免疫檢測方法。該方法是將二抗標記上 酶,抗原抗體反應的特異性與酶催化底物的作用結合起來,根據酶作用底物後的 顯色顏色變化來判斷試驗結果,其敏感度可達ng 水平。常見用於標記的酶有辣 根過氧化物酶(HRP)、鹼性磷酸酶(AP)等。由於酶聯免疫法無需特殊的儀器, 檢測簡單,因此被廣泛應用於疾病檢測。常用的方法有間接法、夾心法以及BAS -ELISA。間接法是先將待測的蛋白抱被在孔板內,然後依次加入一抗、標記了 酶的二抗和底物顯色,通過儀器(例如酶標儀)定量檢測抗原。這種方法操作簡 單但由於高背景而特異性較差。目前已逐漸被夾心法取代。夾心法利用二種一抗 對目標抗原進行捕獲和固定,在確保靈敏度的同時大大提高了反應的特異性。近 年來,抗原的定量檢測技術也不斷推陳出新。近年來,在夾心法ELISA 的基礎上, 開發了多抗原檢測試劑盒,能同時檢測微量液相樣本中多個抗原含量。這項技術 的應用大大縮短了診斷的時間,提高診斷的可靠性和及時性。
4.免疫金膠體技術
膠體金技術經過30 多年的發展到現在已日趨成熟,該方法是將二抗標記上 膠體金顆粒,利用抗原抗體間的特異性反應,最終將膠體金標記的二抗吸附於滲 濾膜上,此方法簡單,快速,廣泛應用於臨床篩查。
3. 免疫學中的 瓊脂免疫試驗方法及結果判定
怎樣用傳統生物學檢測技術來檢測馬鈴薯中的農殘留
生物技術檢測方法具有特異的生物識別功能、極高的選擇性,它可與現代的物理化學方法相結合,產生一些簡單、結果精確、靈敏、專一、微量和快速、成本低廉的檢測方法,因此其在食品檢驗中佔有越來越重要的地位。
在食品檢驗中應用的幾種生物檢測技術
1 免疫法
免疫法是最靈敏的生物檢測方法,具有高特異性和高靈敏性(靈敏度可達1ppb,1ppm)、操作簡便、再現性好,應用前景看好。用免疫法可進行蛋白質檢測,由於不同蛋白質的物理、化學性質差別極小,只能通過各種免疫方法或標記探針法加以區別。
(1) 熒光抗體法
將熒光抗體溶液滴加於固定的標本上,一定時間後用緩沖液沖洗,若有相應抗原存在,即與熒光抗體結合,在熒光顯微鏡下即可看到發熒光的抗體復合物。熒光抗體法在微生物污染鑒定中經常使用,最常用於沙門氏菌的檢測。
(2) 放射免疫法
靈敏度高,但操作相對復雜,放射免疫法同位素半衰期短,保存及操作不便。目前應用情況受到限制。
(3) 酶聯免疫吸附法
是一種基本的酶免疫檢測方法,其選擇性好、靈敏度高、快速、易操作、結果判斷客觀准確、實用性強。酶免疫法和其他免疫法一樣,都是以抗體和抗原的特異性結合為基礎的。以酶或輔酶為標記物,標記抗原或抗體,用酶促反應的放大作用來顯示初級免疫學反應。
酶聯免疫吸附法除可檢測食品中的毒素、殘留農及微生物外還可用於營養素的測定。
(4) 凝集反應法
當有電解質存在時,顆粒狀的抗原與其特異性的抗體結合並生成可見凝集塊的反應稱為凝集反應,有直接反應和間接反應法。利用凝集反應可測定抗體的效價,也可用於細菌、病毒等的分類。
(5) 沉澱反應法
沉澱反應法常見的是一種瓊脂擴散試驗。單向擴散是利用不同抗原抗體在瓊脂中不同的擴散速度而會在瓊脂中出現幾條相互分離的沉澱帶。雙向擴散則是利用抗原抗體都向中間層―――瓊脂擴散而形成沉澱帶,根據分離沉澱帶的數量可確定抗原抗體種類。
(6) 免疫擴散法
利用蛋白質在半固體基質上的擴散作用,使抗原和抗體在濃度比例合適的部位產生沉澱帶或沉澱環,從而檢測蛋白質。如血清中IgG、IgA、IgM含量的測定。
(7) 免疫電泳法
免疫電泳法是將電泳和瓊脂擴散沉澱反應相結合的一種方法,即先將血清或蛋白質抗原在瓊脂凝膠中進行電泳。帶電的蛋白質抗原向負極移動,加入抗血清後,不同區點的抗原再與抗體進行沉澱,當相應抗原抗體接觸,在適當比例下形成弧形沉澱帶,根據沉澱帶的位置對蛋白質的各組分進行檢測。如免疫球蛋白含量的測定。
4. 從免疫學和分子生物學討論現代生物技術在食品檢測中的應用
生物技術檢測方法具有特異的生物識別功能、極高的選擇性,它可與現代的物理化學方法相結合,產生一些簡單、結果精確、靈敏、專一、微量和快速、成本低廉的檢測方法,因此其在食品檢驗中佔有越來越重要的地位。
在食品檢驗中應用的幾種生物檢測技術
1 免疫法
免疫法是最靈敏的生物檢測方法,具有高特異性和高靈敏性(靈敏度可達1ppb,1ppm)、操作簡便、再現性好,應用前景看好。用免疫法可進行蛋白質檢測,由於不同蛋白質的物理、化學性質差別極小,只能通過各種免疫方法或標記探針法加以區別。
(1) 熒光抗體法
將熒光抗體溶液滴加於固定的標本上,一定時間後用緩沖液沖洗,若有相應抗原存在,即與熒光抗體結合,在熒光顯微鏡下即可看到發熒光的抗體復合物。熒光抗體法在微生物污染鑒定中經常使用,最常用於沙門氏菌的檢測。
(2) 放射免疫法
靈敏度高,但操作相對復雜,放射免疫法同位素半衰期短,保存及操作不便。目前應用情況受到限制。
(3) 酶聯免疫吸附法
是一種基本的酶免疫檢測方法,其選擇性好、靈敏度高、快速、易操作、結果判斷客觀准確、實用性強。酶免疫法和其他免疫法一樣,都是以抗體和抗原的特異性結合為基礎的。以酶或輔酶為標記物,標記抗原或抗體,用酶促反應的放大作用來顯示初級免疫學反應。
酶聯免疫吸附法除可檢測食品中的毒素、殘留農葯及微生物外還可用於營養素的測定。
(4) 凝集反應法
當有電解質存在時,顆粒狀的抗原與其特異性的抗體結合並生成可見凝集塊的反應稱為凝集反應,有直接反應和間接反應法。利用凝集反應可測定抗體的效價,也可用於細菌、病毒等的分類。
(5) 沉澱反應法
沉澱反應法常見的是一種瓊脂擴散試驗。單向擴散是利用不同抗原抗體在瓊脂中不同的擴散速度而會在瓊脂中出現幾條相互分離的沉澱帶。雙向擴散則是利用抗原抗體都向中間層―――瓊脂擴散而形成沉澱帶,根據分離沉澱帶的數量可確定抗原抗體種類。
(6) 免疫擴散法
利用蛋白質在半固體基質上的擴散作用,使抗原和抗體在濃度比例合適的部位產生沉澱帶或沉澱環,從而檢測蛋白質。如血清中IgG、IgA、IgM含量的測定。
(7) 免疫電泳法
免疫電泳法是將電泳和瓊脂擴散沉澱反應相結合的一種方法,即先將血清或蛋白質抗原在瓊脂凝膠中進行電泳。帶電的蛋白質抗原向負極移動,加入抗血清後,不同區點的抗原再與抗體進行沉澱,當相應抗原抗體接觸,在適當比例下形成弧形沉澱帶,根據沉澱帶的位置對蛋白質的各組分進行檢測。如免疫球蛋白含量的測定。
2 酶檢測法
酶檢測法就是用酶來測定某些用一般化學方法難於檢測的食品成分的含量或測定食品中某些特殊酶的活性或含量。其最大特點就是特異性強。所以常用於分析結構和物理化學性質比較相近的同類物質的分別鑒定。如測定食品中殘存有機農葯的含量、微生物污染或了解食品的制備、保存情況。
酶檢測法的樣品一般不需要進行很復雜的預處理,由於酶的催化效率很高,反應條件溫和,酶檢測法的檢測速度也比較快。常用的有以下方法:
(1) 終點測定法
在以待測物質為底物的酶反應中,如果使底物能夠接近完全地轉化為產物,而且底物或產物又具有某種特徵性質,通過直接測定轉化前後底物的減少量、產物的增加量或輔酶的變化等就可以定量待測物質。
(2) 動力學測定法
在反應體系中精確加入一定數量的酶,測定反應物或產物變化的速度。測定的參數可以是吸光度、熒光度、pH值等。
(3) 多酶偶聯測定法
當被測定的底物或反應產物沒有易於檢測的物理化學手段時,可採用兩種或兩種以上的酶進行連續式或平行式的偶聯反應,使底物通過兩步或多步反應,轉化為易於檢測的產物,從而測定待測物質的含量。例如葡萄糖的定量測定。
(4) 利用輔酶作用或抑制劑作用測定法
如果待測物質可作為某種酶專一的輔酶或抑制劑,則這種物質的濃度和將其作為輔酶或抑制劑的酶的反應速度之間有一定關聯,因此通過測定該酶的反應速度就能進行這種物質的定量。嘌呤、核甙酸、維生素、輔酶及食品中農葯、殺蟲劑的檢驗可用此法。
(5) 通過酶反應循環系統的高靈敏度測定法
對於極微量的物質進行酶法檢測時,由於靈敏度的原因,在很多情況下不能應用通常的終點測定法,可設計一個酶反應循環系統來提高檢測靈敏度。
(6) 酶標免疫檢測法
抗體與相應的抗原具有選擇和結合的雙重功能。若要測定樣品中抗原的含量,就將酶與待測定抗原的對應抗體結合在一起,製成酶標抗體。然後將酶標抗體與樣品液中待測抗原,通過免疫反應結合在一起,形成酶―抗體―抗原復合物,通過測定復合物中酶的含量就可得出待測抗原的含量。此法可用於食品的污染檢測,尤其適用於毒素的快速檢測。
(7) 放射性同位素測定法
酶的活性可以採用同位素標記的底物進行測量。經酶解後隨時間所生成的放射性產物含量與酶的濃度成正比。也可用放射性同位素的底物在酶的作用下得到的產物,分離測定產物的同位素含量。此法可用於需要進行極微量的分析或因新發現的酶還未找到適當的分析法時的測定。
3 核酸探針技術
核酸探針技術又名基因探針技術或核酸分子雜交技術,具有敏感性高(可檢出10-9―10-12的核酸)和特異性強等優點。兩條不同來源的核酸鏈如果具有互補的鹼基序列,就能夠特異性的結合而成為分子雜交鏈。據此,可在已知的DNA或RNA片段上加上可識別的標記(如同位素標記、生物素標記等),使之成為探針,用以檢測未知樣品中是否具有與其相同的序列,並進一步判定其與已知序列的同源程度。
核酸探針技術已被廣泛應用於進出口動植物及其產品的檢驗。用於檢驗食品中一些常見的致病菌及產毒素菌,如大腸桿菌、沙門氏菌等多種病原體的檢驗。近年來,放射性同位素標記的核酸探針正越來越多地用於產腸毒素性大腸桿菌的快速檢測。
4 多聚酶鏈反應技術
多聚酶鏈反應技術是一種極敏感的分子生物學方法,是一項DNA體外擴增技術,在體外對特定的雙鏈DNA片段進行高效擴增,故又稱基因體外擴增法。
多聚酶鏈反應技術快速、特異、敏感,在食品中致病菌的檢測方面具有很大的應用潛力。如可用於單核細胞增多症李氏桿菌、金黃色葡萄球菌、頑固性梭狀芽胞桿菌、沙門氏菌等的檢測。
5 基因晶元技術
基因晶元技術能同時將大量探針固定於支持物上,可以一次性對樣品大量序列進行檢測和分析,從而解決了傳統核酸印跡雜交技術的操作繁雜、自動化程度低、操作序列數量少、檢測效率低等不足,是一種在生物技術產品檢測中極有發展前景和應用價值的技術,也是近年來國內外研究的熱點,基因晶元檢測技術完全可能成為21世紀最具活力的檢測技術之一。
基因晶元檢測技術可以判斷該植物是否含有外來的基因序列,而鑒定該植物是否為生物技術作物。
6 免疫感測器
免疫感測器是根據生物體內抗原-抗體特異性結合並導致化學變化而設計的生物感測器,其主要由感受器、轉換器和放大器組成。免疫感測器是多學科邊緣交叉的產物,其研究涉及到電化學、物理、生物、免疫學和計算機等領域的相關知識。
免疫感測器主要有:酶免疫感測器、電化學免疫感測器(電位型、電流型、電導型、電容型)、光學免疫感測器(標記型、非標記型)、壓電晶體免疫感測器、表面等離子共振型免疫感測器和免疫晶元等。
基於抗原-抗體特異性結合的工作原理,免役感測器在食品檢測中的應用主要體現在對生物性危害的檢測。如可用於致病菌、生物毒素、農葯、獸葯等的檢測。
5. 免疫學檢驗最常用的方法拜託各位了 3Q
以下是幾種常用的免疫學技術: 1.免疫熒光技術 免疫熒光技術是利用熒光素標記的抗體(或抗原)檢測組織、 細胞或血清 中的相應抗原(或抗體)的方法。由於熒光抗體具有安全、 靈敏的特點,因此已 廣泛應用在免疫熒光檢測和流式細胞計數領域。 根據熒光素標記的方式不同,可 分為直標熒光抗體和間標熒光抗體。 間標熒光抗體中一抗並不直接連接熒光素, 而是先將一抗結合到蛋白,然後帶有熒光素的二抗再結合至一抗。 通過二抗的結 合,能將信號進行放大,因此能在一定程度上提高檢測的靈敏度, 但是隨之帶來 的高背景也降低了檢測的特異性。近年來, 隨著熒光素和熒光檢測技術的不斷進 步,熒光檢測的靈敏度已經接近同位素檢測的水平, 直接標記的熒光抗體逐漸取 代間接標記抗體。這些標記了熒光素的抗體直接結合至抗原, 大大提高了檢測的 特異性,使檢測的結果更加准確可靠。熒光檢測技術的發展, 使得免疫熒光技術 在傳染病診斷上有廣泛的用途,如在細菌、病毒、 螺旋體感染的疾病,檢查IgM 抗體,做為近期接觸抗原的標志。 利用單克隆熒光直接標記抗體鑒定淋巴細胞的 亞類。通過流式細胞儀,針對細胞表面不同抗原, 可以同時使用多種不同的熒光 抗體,對同一細胞進行多標記染色。 2.放射免疫檢測 放射免疫檢測技術是目前靈敏度最高的檢測技術, 利用放射性同素標記抗 原(或抗體),與相應抗體(或抗原)結合後, 通過測定抗原抗體結合物的放射 性檢測結果。放射性同位素具有pg 級的靈敏度,且利用反復曝光的方法可對痕 量物質進行定量檢測。 但放射性同位素對人體的損傷也限制了該方法的使用。 3.酶聯免疫吸附試驗(ELISA) 酶聯免疫檢測是目前應用最廣泛的免疫檢測方法。 該方法是將二抗標記上 酶,抗原抗體反應的特異性與酶催化底物的作用結合起來, 根據酶作用底物後的 顯色顏色變化來判斷試驗結果,其敏感度可達ng 水平。常見用於標記的酶有辣 根過氧化物酶(HRP)、鹼性磷酸酶(AP)等。 由於酶聯免疫法無需特殊的儀器, 檢測簡單,因此被廣泛應用於疾病檢測。常用的方法有間接法、 夾心法以及BAS -ELISA。間接法是先將待測的蛋白抱被在孔板內, 然後依次加入一抗、標記了 酶的二抗和底物顯色,通過儀器(例如酶標儀)定量檢測抗原。 這種方法操作簡 單但由於高背景而特異性較差。目前已逐漸被夾心法取代。 夾心法利用二種一抗 對目標抗原進行捕獲和固定, 在確保靈敏度的同時大大提高了反應的特異性。近 年來,抗原的定量檢測技術也不斷推陳出新。近年來, 在夾心法ELISA 的基礎上, 開發了多抗原檢測試劑盒, 能同時檢測微量液相樣本中多個抗原含量。這項技術 的應用大大縮短了診斷的時間,提高診斷的可靠性和及時性。 4.免疫金膠體技術 膠體金技術經過30 多年的發展到現在已日趨成熟,該方法是將二抗標記上 膠體金顆粒,利用抗原抗體間的特異性反應, 最終將膠體金標記的二抗吸附於滲 濾膜上,此方法簡單,快速,廣泛應用於臨床篩查。
6. 免疫學的檢測方法
免疫學檢測方法可分為體液免疫和細胞免疫。
7. 細胞免疫功能檢測常用有哪幾種方法
細胞免疫(CMⅠ)是由多種細胞相互作用的結果。免疫細胞間相互作用導致多種細胞因子的釋放。因此細胞功能測定不僅涉及T細胞的數量和功能與包括各類因子活性測定,因此評價機體的細胞免疫功能不僅程序復雜,且很難標准化。
一、遲發型過敏反應的體外檢測方法
皮膚試驗和接觸性過敏的誘發是檢測遲發型過敏反應(DTH)的兩種常用方法。皮膚試驗中誘發對曾經使病人致敏的抗原的再次應答,而接觸性過敏是測試受者對從未接觸過的物質發生致敏的能力。
1.皮膚試驗 用皮膚試驗診斷DTH,常用的抗原有結核菌純蛋白衍生物(PPD)、腮腺炎病毒、念珠菌素等,在人類試驗時在前臂皮內注射少量可溶性抗原,24~48小後,測量紅腫硬結的大小,硬結直徑大於10mm即被看作為陽性。表明受試者對該病原菌有了一定的細胞免疫能力,若皮試無反應,可用更高濃度的抗原重復試驗,若仍無反應即為陰性,需排除皮試技術誤差,也可能受試者從未接觸過此抗原,也可能由於細胞免疫功能缺損,或由於細胞免疫功能缺損,或由於嚴重感染(麻疹、慢性播散性結核)造成的無反應性。
2.接觸性過敏常應用低分子量化合物如二硝基氯苯(DNCB)誘生接觸性過敏。化合物與皮膚蛋白質結合而導至DTH反應。在動物試驗時,初次皮膚上塗抹DNCB後間隔7~10天再激發刺激,則皮膚出現即為陽性。此試驗人類已不使用。
二、細胞免疫的體外檢測方法
體外檢測淋巴細胞的數量和功能,最易採集的是血標本,首先需分離或純化淋巴細胞,一般使用萄聚糖-泛影葡胺配成比重為1.077的淋巴細胞分層液,當將血液重疊於淋巴細胞分層液之上離心時,由於紅細胞(1.092)、多形核白細胞(1.090)、淋巴細胞(1.070)的比重不同而相互分開。淋巴細胞和單核細胞在血漿和分層液交界處形成一薄層。仔細分出這一薄層的細胞,其中淋巴細胞佔80%,單核細胞佔20%,淋巴細胞中T細胞佔80%,B細胞佔4%~10%,其作為非DT、非B細胞。
1.T細胞計數
(1)E花環法:人類T細胞表面有SRBC受體(CD2)能與SRBC結合形成玫瑰花環樣結構,將經分層液分離現的RBM懸液與SRBC在含有血清的平衡鹽水中混合,經37℃培養5~10分鍾放4℃過夜,取細胞懸計數,外周血淋巴細胞中約70%~80%淋巴細胞結成花環即為T細胞。目前此方法已用來分離T細胞,而不用做T細胞計數。
(2)用單克隆抗體計數T細胞:將人的PBM分成三等份,分別用小鼠抗人CD3、CD4和CD8的單克隆抗體作第一抗體與細胞結合,再用FITC標記的兔抗小鼠IgG抗體作第二抗體進行間接免疫熒光染色,在熒光顯微鏡下或流式細胞儀檢測結果,在PBM中被CD3抗體染上熒光的細胞稱為CD3 細胞即總T細胞。正常人在PBM中T細胞佔70%~80%。正常人的CD4 細胞和CD8 細胞之和應與CD3 細胞數一致。CD4 細胞與CD8 細胞的比值正常人約為2/1而艾滋病患者則比值小於1.7。
2.T細胞活化試驗 T細胞能被非特異的物質稱為有絲分裂原所激活而向淋巴母細胞轉化。T細胞轉化過程可伴隨有DNA、RNA、蛋白質的合成增加,最圖導致細胞分裂。在光學顯微鏡下可計數轉化後的淋巴細胞數,也可用氚標記的胸腺嘧啶核苷(3HTdR)摻入正在分裂的淋巴細胞,用液閃測定儀檢查摻入正在分裂的淋巴細胞,用液測量儀檢查摻入的3H-TdR的多少確定淋巴細胞轉化率。最近有一種不用同位素,又可用儀器測量的淋巴細胞增殖反應的檢查法,稱為MTT檢測法,MTT是一種甲氮唑鹽,它是細胞線粒體脫氫酶的底物,細胞內的酶可將MTT分解產生藍黑色甲(fromazan)產物。該產物的多少與活性細胞數正相關。結果可用酶標檢測儀(595mm)測量匯豐銀行密度,做為MTT法的檢查指標。此法的結果與3H-TdR摻入法平行,並能反應試驗中的活細胞數。
3.細胞毒試驗 TC細胞、NK細胞、LAK細胞、TIL細胞對其靶細胞有直接的細胞毒(殺傷)作用。常用的栓測細胞毒效應的方法是51Cr-Na2Cro4鹽水溶液與靶細胞胞混合,於37℃培養1小時左右,51Cr即可進入靶細胞,與胞漿蛋白結合,洗去游離的51Cr後,即可得到51Cr標記的靶細胞,將待檢細胞毒性的細胞與51Cr標記的靶細胞混合(比例約為50:1或100:1)靶細胞被殺傷越多,釋放到上清液中的液游離的51Cr越多,且不能被其他細胞吸收。用γ射線測量儀檢測上清液中的cpm值,即可計算出待檢細胞殺傷活性的高低。
細胞毒試驗檢測Tc細胞效應功能是否健全,及經IgG介導的ADCC效應,或NK細胞在抗腫瘤免疫中的作用是有意義的。
4.混合淋巴細胞的反應(MIR) 是體外研究T細胞的較好的方法,雙向MLR常被用來篩選骨髓移植的供體。來自不同供體的淋巴細胞分別與病人的淋巴細胞混合培養4~5天,在最後8小時摻入51TdR摻入法測T細胞的反應性。或用細胞毒法觀察受刺激的T細胞與活的靶細胞混合(靶細胞來自與刺激細胞相同的個體)如果T細胞受刺激後產生了細胞毒T細胞,可殺死活的細胞,根據靶細胞釋放51Cr的多少算出T細胞移動抑制因子)和LIF(白細胞移動抑制因子)來評估細胞免疫功能。近年來應用測定IL-2的免疫酶技術,操作簡單,並能定量以取代了MIF和LIF的測定。單個核細胞與分裂原一起培養24小時,然後測定清液中的IL-2活性。在細胞免疫功能缺損時,特別是AIDS病人,IL-2分泌明顯降低。而有些疾病,如多發性硬化、類風濕關節炎、移植排斥反應等病人體內血清中IL-2水平升高,表明病人T細胞活性增高。發生移植排斥反應的病人尿中IL-2也可升高。
也可用酶聯免疫吸附試驗測定各種體液中活化的T細胞脫落的IL-2受體(CD25),一般來說IL-2的水平和IL-2受體水平是平行的,IL-2和IL-2受體的檢測可用於對某些疾病的監測,如移桿排斥、自身免疫病以及接受免疫抑制治療的病人。
對體外培養的細胞進行細胞因子產生能力檢測是檢查細胞培養上清液中細胞因子的生物活性或抗原性。現已可用核酸雜交技術,即從組織中或細胞中提取RNA,與同位素或酶標記的該種細胞因子的cDNA探針作分子雜交試驗,即印跡(dot blotting)或Northern印跡,若查出有某種因子的mRNA存在,即說明該細胞在所處培養條件下有產生某種細胞因子的能力。
8. 免疫分析方法有哪些
(1)放射免疫分析法(radioimmunoassay,RIA)。RIA技術是使用以放射性同位素(如125I、32P、3H等)作標記的抗原或抗體,用γ-射線探測儀或液體閃爍計數器測定γ-射線或β-射線的放射性強度,來測定抗體或抗原量的技術。它包括以標記抗原為特點的放射免疫分析和以標記抗體為特點的免疫放射分析(immunoradiometricassay,IRMA)。前者以液相競爭結合法居多,既測大分子抗原又測小分子抗原;後者以固相法測大分子抗原為主。
RIA在早期建立的農葯免疫分析方法中佔了很大比重,建立了狄氏劑、艾氏劑、2,4-D和2,4,5-T、對硫磷和百草枯等農葯的放射免疫分析法。盡管該方法靈敏度非常敏銳(RIA通常為10-9g、10-12g,甚至10-15g),應用范圍廣,但進行RIA需使用昂貴的計數器,也存在放射線輻射和污染等問題,因此在農葯殘留檢測領域的應用和發展受到了一定的限制,並逐步為其他免疫分析方法所取代。
(2)酶免疫分析法(enzymeimmunoassay,EIA)。EIA是繼RIA之後發展起來的一項免疫分析技術。其檢測原理與放射免疫法類似,但所用的標記物為酶,它將抗原、抗體的特異性免疫反應和酶的高效催化作用有機結合起來,通過測定結合於固相的酶的活力來測定被測定物的量。用做標記物的酶有辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)和鹼性磷酸酶(alkalinephosphatase,AKP)、葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase,GO)、脲酶(urease)等。酶標記反應的固相支持物有聚苯乙烯塑料管、膜等。目前大多數採用96孔酶標板(MTP)作為固相支持物。這種板的檢測容量大,樣本數量多,只需有台簡單的酶標儀就可得出准確的檢測數據。也有學者採用磁珠作為固相材料進行EIA研究,其原理是將高分子材料(聚苯乙烯、聚氯乙烯等)包裹到金屬小顆粒(Fe2O3,Fe3O4)外面,再通過化學方法鍵合上氨基(-NH2)、羧基(-COOH)、羥基(-OH)等活性基團,再與抗體或抗原耦聯,製成免疫性微珠。該方法的優點是微珠比表面積大,吸附能力強,能懸浮在液相中快速均勻的捕獲樣品中的待測物,通過外加磁場後能夠實現微珠與樣品液的快速分離,從而減少檢測時間、提高檢測靈敏度。
由於酶標試劑制備容易、穩定、價廉,酶免疫分析的靈敏度接近放射免疫技術,故近年來EIA技術發展很快,已開發了多種EIA方法。其中酶聯免疫法(,ELISA)是目前農葯殘留檢測中應用最廣泛的酶免疫分析技術。
(3)熒光免疫分析法(fluorescenceimmunoassay,FIA)。FIA檢測的基本原理是將抗原抗體的高度特異性與熒光的敏感可測性有機地結合,以熒光物質作為示蹤劑標記抗體、抗原或半抗原分子,制備高質量的特異性熒光試劑。當抗原抗體結合物中的熒光物質受到紫外光或藍光照射時,能夠吸收光能進入激發態。當其從激發態回復基態時,能以電磁輻射形式放射出所吸收的光能,產生熒光。繪制農葯濃度-熒光強度曲線,可以定性、定量檢測樣品中的農葯殘留量。
適用於抗體、抗原或半抗原分子標記的熒光素須符合要求:①應具有能與蛋白質分子形成穩定共價鍵的化學基團,或易轉變成這類反應形式而不破壞其熒光結構;②標記後,熒光素與抗體或抗原各自的化學結構和性質均不發生改變;③熒光效率高,與蛋白質結合的需要量很少;④熒光素與蛋白質結合的過程簡單、快速,游離的熒光素及其降解產物容易除去;⑤結合物在一般儲存條件下性能穩定,可保存使用較長時間。
(4)化學發光免疫分析法(luminescentimmunoassay,LCIA)。LCIA又可分為化學發光免疫測定(chemiluminescentimmunoassay,CLCIA)和生物發光免疫測定(bio-luminescentImmunoassay,BLCIA)。
1976年,Shroeder首先用生物素(B)-親和素(A)系統建立了均相化學發光免疫測定技術,爾後Halman和Velan又將其引伸到非均相體系,現已滲入到生物學研究的各個領域。其原理是以發光指示抗原與抗體的結合,當發游標記物與相應的抗體或抗原結合後,底物與酶作用,或與發光劑產生氧化還原反應,或使熒光物質(例如紅熒烯等)激發,釋放光能。最後用光度計測定其發光強度,進行定量分析。常用發游標記物有辣根過氧化物酶(HRP)、魯米諾(luminol)、異魯米諾(isoluminol)、咯粉鹼(lophine)、光澤精(lucigen)、雙(2、4、6-三氯苯)草酸酯、聯苯三酚和6[N-(4-二氨基丁基)-N-乙基]-氨基-2,3-二氫吩嗪-1,4-二酮(ABEI)等。用上述發游標記物標記的抗體(或抗原)在一定的pH緩沖溶液中與相應的抗原(或抗體)結合時,在協同因子(例如H2O2等)的作用下發光,其發光強度與被測物的濃度成正比,故可以用於定量分析。
發光免疫測定具有特異性強、靈敏度高(檢測限量達10-15mol/L)、快速(1~3h)、發光材料易得等優點。但其發光過程和強度常受到發光物質本身的化學結構、介質的pH、協同發光物質和金屬離子雜質等影響。
(5)金免疫層析分析法(goldimmuno-chromatographyassay,GICA)。GICA檢測原理是將配體(抗體或抗原)以線狀包被固化於硝酸纖維素膜等微孔薄膜上,膠體金標記另以配體或其他物質並以干態固定在吸水材料上,通過毛細作用,使樣品溶液在層析條上泳動,當泳動至膠體金標記物處時,如樣品中含有待檢受體,則發生第一步高度特異性的免疫反應,形成的免疫復合物繼續泳動至線狀包被區時,發生第二步高度特異性的免疫反應,形成的免疫復合物被截留在包被的線狀區,通過標記的膠體金而顯紅色條帶(檢測帶),而游離的標記物則越過檢測帶,與結合的標記物自動分離。通過檢測帶上顏色的有無或色澤深淺來實現定性或定量測定2。
2金標試紙條檢測
GICA法具有快速(5~20min)、廉價、結果明確、無需復雜操作技巧和特殊設備、攜帶方便等優點。但相對於其他免疫分析方法,該方法檢測靈敏度稍低,主要適合現場快速定性或半定量測定。目前該方法已被應用於醫學和生物學等眾多研究領域,尤其在發達國家已經得到了廣泛的應用。
(6)免疫分析與儀器分析技術的聯用技術。使用單一的IA技術進行農葯殘留分析獲得的信息量少,而理化分析方法的選擇性又比較差。Kramer等人將免疫分析法和液相色譜法(LC)聯合起來使用,從而簡化了分析方法,提高了檢測效率。LC-IA的聯用,將LC的高分離能力和IA的高靈敏性和高特異性融為一體。該分析法尤其適合多組分殘留分析和微量分析。免疫分析與氣相色譜/質譜(GC/MS)的聯用可減少結構相似的農葯或代謝產物分析中的交叉反應,以降低假陽性。
9. 特異性最高,靈敏度最強,目前臨床上應用最廣泛的免疫檢測技術是
咨詢記錄 · 回答於2021-12-22