檢測細胞周期的方法

❶ 細胞周期測定

兒童白血病細胞DNA含量及細胞周期的臨床分析
劉愛國 胡 群 陶紅芳 張柳清 胡 迎
華中科技大學附屬同濟醫院兒科(湖北 武漢) 430030
中國圖書分類號 R725·2 文獻標識碼 B 文章編號 1001-4411 (2008) 07-0980-03
【摘 要】 目的:探討小兒急性白血病(AL)患者骨髓細胞周期分布與分型和治療的關系。方法:應
定96例小兒AL骨髓單個核細胞DNA含量和細胞周期。結果:不同類型的AL異倍體發生率不同,急性淋巴
異倍體率55·7% (44/79),明顯高於急性非淋巴細胞白血病(ANLL)的29·41% (5/17), T-ALL異倍體
高於B-ALL (41·67% ),統計學差異均有顯著意義。AL初診病例和復發病例的G0/G1期細胞比例高於完全
G2M+S期比例低於完全緩解組和對照組(P<0·05),完全緩解組和對照組無顯著差異。結論:圖像分析系統
異倍體的分析,有利於判斷高危ALL,對細胞周期的測定給化療個體化提供了具體的參考指標。
【關鍵詞】 兒童白血病 DNA含量 細胞周期 圖像分析系統
C linical implication ofDNA content assay and cell cycle distribution in
cute leukem ia
LIUAi-Guo, HU Qun, TAO Hong-Fang et al·Department ofPediatrics, TongjiHospital, HUST,
China
〔Abstract〕 Objective:To investigate the distribution ofmarrow cell cycle and the relationshipwith the types o
peutic effects in childhood acute leukemia (AL)·M ethods:Mononuclear cellularDNA contents in bonemarrowwere
nalysis system in 96 patientswith childhoodAL·Results:The proportion ofpatientswith DNA-aneuploidwas differen
ofAL: DNA-aneuploid in the patientswithALLwas 55·7% (44/79), much higher than that in the children withA
17)·Statistically significantdifferenceswere found between the T-ALL group and B-ALL group in the DNA- aneu
vs 41·67%,P<0·05)·The leukemia cell cycle distribution indicated thatG0/G1-phase compartment in untreate
group were higher than in complete remission group and normal controls, G2M+S-phase compartmentwere lower tha
sion group and normal controls (P<0·05)·There were no significant differences in cell cycle distribution between
group and normal controls·Conclusion:The analysis ofAL, especiallyALL aneuploid, by image analysis system can
guishing the high riskALL from the standard riskALL, and the determination of cell cycle distribution can provide a c
for chemotherapy·
〔Key words〕 Childhood leukemia; DNA content; Cell cycle; Image analysis system
細胞DNA含量及細胞周期的變化與白血病發生、發展及
轉歸有密切的關系。快速分析白血病細胞的動力學變化,可
以評估其增殖能力,初步判斷化療的療效。研究白血病細胞
的DNA指數和細胞周期的變化,對協助臨床診斷和制定個體
化的化療方案有著重要意義。經典的細胞周期分析方法為流
式細胞儀,但儀器和試劑昂貴限制了其在臨床的廣泛應用。
筆者採用圖像分析系統檢測不同病程的兒童白血病細胞DNA
指數、倍體的改變和細胞周期的變化,以及這種變化與臨床
的關系,報道如下。
1 資料與方法
1·1 對象及分組 2003年4月~2005年8月兒科血液病房
住院急性白血病(AL) 96例,,男60例,女36例,年齡8個
月~14歲,平均7·1歲。其中急性淋巴細胞白血病(ALL )
79例(初治31例,復發/難治5例,完全緩解43例),急性
非淋巴細胞白血病(ANLL) 17例(初治8例,復發/難治4
例,完全緩解5例)。所有病例均經細胞學及免疫學檢查確
診。
1·2 方法 分別選取不同病程的白血病患兒及正常對照組骨
髓穿刺塗片標本,空氣中乾燥至少1 h,多聚甲醛固定30 min,
然後進行Feulgen染色〔1〕。採用CMIAS-B圖像分析系統測定
細胞核DNA相對含量及DNA指數(DI),同時分析不同細胞
周期的細胞所佔百分比。
1·3 DNA倍體判斷標准 根據DI判斷, DI系樣本的G0/G1
期細胞與正常二倍體G0/G1期細胞熒光強度之比。DI正常范
圍為0·9~1·1, DI<0·9為亞二倍體, DI>1·1為超二倍體,
亞二倍體和超二倍體均為異倍體。
1·4 統計學方法 應用SPSS 8·0軟體,進行χ2檢驗和t檢
驗。
2 結果
2·1 DNA異倍體檢出情況 79例ALL檢出DNA-異倍體
44例,異倍體率55·7%其中48例B-ALL檢出異倍體20
例,異倍體率41·67%, 31例T-ALL檢出異倍體24例,異
倍體率77·42% ,兩個不同免疫類型ALL出現異倍體的陽性
率有顯著差異(χ2=9·76, P<0·05)。檢出的5例亞二倍體
中,全部為T-ALL。17例ANLL檢出異倍體5例,異倍體率
29·41%,與ALL組比較有顯著性差異(χ2= 3·84, P<
0·05)。見表1。對照組10例無異倍體檢出。
2·2 細胞周期分布 AL初治組患兒的G0/G1(% )明顯高
於完全緩解組(t=2·83,P<0·05)和
P<0·05), S+G2/M (% )則明顯低於
2·06,P<0·05)和對照組(t=2·74,P<
復發/難治組差異無顯著意義(t分別為1·
0·05)。進一步分析ALL組和ANLL組,各
著差異性。見表2。
表1 AL異倍體檢出率(
組別初診緩解
ALL 58·06 (18 /31) 48·84 (21 /43)
B-ALL 55·00 (11 /20) 26·92 (7 /26)
T-ALL 90·91 (10 /11) 64·71 (11 /17)
ANLL 25·00 (2 /8) 20·00 (1 /5)
表2 AL不同病情細胞周期
組別nG0/G1S G
初診39 89·8±5·3 9·4±8·9 2·7
完全緩解48 72·9±6·5 19·1±10·1 7·4
復發/難治9 83·5±7·1 8·3±5·3 9·4
對照10 70·4±5·4 22·1±4·5 7·3
3 討論
DNA異倍體是腫瘤的特異性標志已為
體改變在白血病中很常見,國內外均有報
體檢出率約為50%〔1〕,本試驗79例AL異
與文獻報道相符,其中T-ALL異倍體檢出
二倍體集中出現於T-ALL中,而B-ALL
41·67% ,明顯低於T-ALL。從診斷AL
T-ALL、亞二倍體均作為高危因素,由此
不好與異倍體的出現特別是亞二倍體有關〔
檢出率明顯高於ANLL組,從遺傳學角度
制,表明ANLL患兒的染色體異常較多地
而不是數目異常,這可能是臨床ANLL較
因之一〔2〕。
ALL初診組及難治/復發組DNA異倍
其中難治/復發組與CR組的差異更為顯著,
義。隨著患者的完全緩解, DNA異倍體率
有部分CR患者存在DNA異倍體。故此類
師重視,以最大限度地延長患者長期生存率
文獻記載,白血病細胞的細胞周期比
處於S期和G2M +S期的細胞比例比正
劉愛國等 兒童白血病細胞DNA含量及細胞周期的臨床分析 第7期
G2M+S期比例代表該細胞群體中增殖細胞的數量,從另一側
面反映細胞的增殖狀態。本實驗顯示, AL組患兒骨髓細胞的
G0/G1(% )明顯高於緩解組和正常對照組,而S%及S+
G2/M (% )明顯低於緩解組和對照組,說明了白血病骨髓細
胞從G0/G1期至S期之間存在運行阻滯,表明白血病骨髓細
胞的增殖能力低於正常。亞二倍體ALL患兒的骨髓細胞增殖
能力低,故預後相對較差。而超二倍體骨髓細胞的增殖分化
需要復制合成更多的遺傳物質, S期相對延長,進入S期的細
胞增多,因而臨床上對於超二倍體的ALL患兒,聯合使用作
用於S期白血病細胞的葯物,能達到更佳的治療效果〔3〕。
故我們認為,在評定AL患者危險度和制定化療方案時,
除可以MDR作為依據外,患者DNA指數及DNA異倍體率以
及細胞周期分析均可作為重要參考指標。
4 參考文獻
1 PuiCH, CristWM, Look ATet al·Biology and
cytogenetic abnormalities in childhood
leukemia·Blood, 1990, 76: 1449~1463
2 陳日玲,陳銘珍,蔡康榮et al·流式細胞儀
DNA含量的臨床意義·實用兒科臨床雜志,
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3 HirtA, Werren EM, LuethyARet al·Cell cyc
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ilarities in the proliferation ofnormal and leukem
Haemato,l 1992, 80: 189~193
op

❷ 流式細胞儀測定細胞周期各時相的原理和基本步驟（不用說具體使用的量）

在細胞培養液中加入模擬核苷酸EdU （比較老的方法也可以用BrdU）。培養一小時 後，更換為正常的培養液繼續培養。模擬核苷酸可以像天然核苷酸一樣被細胞攝取並整合入新合成的DNA。

培養一段時間後（一般小於一個細胞周期），固定細胞。根據所使用模擬核苷酸的不同，使用不同的方法。EdU，改變緩沖液的pH值，就會發出熒光。而BrdU則需用熒光抗體識別，需要對細胞膜和核膜進行通透處理。

再加入PI對DNA染色。

在二維坐標圖上，橫坐標設為線性PI熒光強度，縱坐標設為模擬核苷酸的熒光強度（log）。

典型的圖就像下面一樣：

G1, G2 和S期就按照圖中的劃分來做。G1期的細胞沒有新合成DNA，所以BrdU信號是陰性，而PI的信號位於1倍體期。S期是正在合成DNA，所以BrdU都是陽性。G2期是已經合成好了2倍的DNA，所以位於2倍體期，信號是G1期的一倍。這個圖中，G1 PI信號是300， G2就是600.

❸ 細胞周期檢測方法即PI法的操作步驟

1. 細胞培養：取對數生長期的細胞，按1×106cells/ mL以1mL接種24孔板或2mL接種於6孔板內，進行所需的處理（比如加入葯物），特定時間後終止培養，進行下一步的實驗。

2. 細胞固定： 800rpm離心5min，收集細胞沉澱，棄上清，用預冷PBS洗滌兩次，加入預冷75%乙醇，於4℃固定4h以上。

3. 細胞染色：1500rpm離心5min，棄上清，以3mL的PBS洗滌一次，加入400uL溴化乙錠（PI，50ug/mL），100ul RNase A（100ug/mL ），4℃避光孵育30min。

4. 流式分析： 以標准程序用流式細胞儀檢測，一般計數2~3萬個細胞，結果用細胞周期擬和軟體ModFit分析。

❹ 求細胞周期檢測方法：PI法操作步驟

1. 細胞培養：取對數生長期的細胞，按1×106cells/ mL以1mL接種24孔板或2mL接種於6孔板內，進行所需的處理（比如加入葯物），特定時間後終止培養，進行下一步的實驗。

2. 細胞固定： 800rpm離心5min，收集細胞沉澱，棄上清，用預冷PBS洗滌兩次，加入預冷75%乙醇，於4℃固定4h以上。

3. 細胞染色：1500rpm離心5min，棄上清，以3mL的PBS洗滌一次，加入400uL溴化乙錠（PI，50ug/mL），100ul RNase A（100ug/mL ），4℃避光孵育30min。

4. 流式分析： 以標准程序用流式細胞儀檢測，一般計數2~3萬個細胞，結果用細胞周期擬和軟體ModFit分析。

❺ 細胞周期如何檢測

碘化丙啶（propidium iodide, PI）檢測凋亡細胞
早期死亡細胞膜通透性狀態的不同是區分細胞凋亡和壞死的一個重要指標，凋亡細胞在進入最終溶解階段前，胞膜通透性無明顯改變，相對分子質量大的與DNA結合的熒光染料（如PI）不能時入凋亡細胞內，而相對分子質量小的熒光染料（如Hoechest 3342或33258等）仍能被細胞攝取。應用流式細胞儀或熒光顯微鏡可區分和壞死細胞，細胞內DNA出現Hoechest 3342標記而不出現PI標記的為凋亡細胞。
主要操作步驟如下：①組織塊用0.25%胰酶消化30min~1h。②200~400目篩網過濾細胞，獲得單細胞懸液。③75％乙醇（-20℃預冷）固定細胞1h。④加入PI（終濃度50g／mL）和無DNA酶污染的RNA酶（終濃度50g／mL）1mL染色30min~1h。⑤流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡
細胞凋亡情況觀察及凋亡率檢測
培養48h後細胞分為兩部分，一部分行碘化丙啶( pI )染色，倒置相差顯微鏡下觀察細胞核形態變化。另一部分以胰酶消化後收集， 以1800r／min離心5min，棄培養基，用4℃預冷的PBS洗細胞2次，離心去PBS，加入 4℃預冷的70％的乙醇 4℃固定1h，離心棄去固定液， 用 4℃預冷PBS 3ml 洗細胞2次，加人1ml PI，4℃避光30mi n 。採用流式細胞儀檢測凋亡率。
http://www.biomart.cn/article/9/42/47/162/7437.htm 流式檢測細胞周期
要點： 最關鍵的就是減少細胞碎片和單細胞懸液的制備！
1、細胞消化要理想，資料顯示最好消化時加EDTA，可使流式做的很漂亮；
2、細胞消化後不可吹打過度，減少細胞破碎；以後的吹打也要注意，尤其是固定後的細胞容易破碎；
3、 細胞用PBS洗滌離心，轉速不超過1000r/min，有文獻用800r/min；可考慮在此過程中用300目的尼龍網過濾一遍細胞（有人主張用鋼網，以 減少細胞與尼龍網粘連的損失，本人認為鋼網易損傷細胞，DNA外溢也會造成細胞粘連，所以在細胞數足夠的情況下，首選尼龍網）；
4、離心後的固定，標准做法是將細胞懸液加入預冷70％酒精，而不是向細胞中加酒精，這樣是為了減少細胞聚集，這一點很重要，很多人都忽視了！ 5、一般選擇4℃固定過夜；
6、加染液前的洗滌仍要注意離心轉速的問題；
7、 關於PI染液的組成及配方，應主要以文獻為主，PI（作用為DNA染色劑）的濃度從0.5μg/ml,20μg/ml，到50μg/ml都見報道，響應的 求助顯示都可出良好結果，RNAs酶（由於PI也可染RNA，故要去除RNA）一般濃度為50μg/ml，配方中的Triton-X-100（曲拉通）主 要是通透細胞膜使PI能進入細胞核。 8、檢測時細胞要達到1～2×106個細胞（實際檢測是1萬到2萬個細胞），為了既保持初始條件相同，又可搜 集到足夠的細胞，應選用多孔培養板，在搜集細胞時，濃度大、抑制強的組可多搜集些孔，以保證檢測的細胞數量。如果細胞數量太低，技師為了減少對流式細胞儀 的損傷，就會選擇高速流（一般的檢測用低速流，誤差小），檢測的質量就會大大下降，數據的說服力就下降了！

❻ 細胞周期長短到底是怎麼測定的

A 不同時候，很多環境因素不一樣。比如清晨和正午的溫度不同，酶活性不同，細胞周期相應的也不同。
B 上面的例子說了，溫度會影響。
C 解離的材料是離體的，當然就不影響細胞周期。解離時間過短，細胞分開不夠，重疊在一起，不好觀察，誤差很大；解離時間過長，細胞破裂，誤差也很大。
D 器材不會影響細胞周期。 舉個例子：PH測定時，紫色石蕊試液的用量會不會影響結果？當然不會（正常用量范圍哈）
綜上，選C
你的懸賞金太少了，你看我打好多字呦！要不是我曉得答案，我還真沒動力回答你。

❼ 細胞周期常用的測定方法

測定細胞周期的方法很多，有同位素標記法、細胞計數法等。

❽ 細胞周期數據分析求助

細胞周期至少有兩種做法，最常見的如下圖分析：

這個是BrdU和7-AAD方法檢測細胞周期。紅色的gate就是G1期，綠色的就是S期，橙色的就是G2/M期。BrdU, PI, 或者EdU方法和這個一樣分析

如果單用PI等DNA染料染色，需要專業軟體來分析計算了。

比如這個圖，是DNA染料單染，其中粉色部分是G1期，黃色部分是S期，綠色部分是G2/M期。中間的分布一般是通過FlowJo這樣的軟體計算自動生成的。

❾ 流式檢測細胞周期都有哪些染色方法

從分類上來說，一般有兩類：第一類是只染DNA。這類方法比較簡單，用酒精固定細胞後，直接加含有RNA酶的熒光染料，比如PI等，然後就可以直接上機。
第二類另外加了一個步驟，在細胞培養液中加入核苷酸的模擬物，比如BrdU或者EdU。細胞新合成的DNA上就會有這些物質。在不同時間點收集細胞，用DNA染料染DNA的同時，還以用抗體或者化學發光法染核苷酸模擬物也發熒光。這個方法的有點就是不僅可以像第一類方法一樣，看到處於細胞周期各個期的百分率，另外還可以看到有多少DNA是新合成的。是一個動態的過程。

❿ 怎樣測量細胞周期

細胞周期指一次分裂結束至下一次分裂結束（間期開始到下一次間期開始），通過顯微鏡的觀察計算這個過程所需要的時間