單抗陽性菌株檢測方法

⑴ 單克隆抗體在臨床上的應用

1．檢驗醫學診斷試劑 作為檢驗醫學實驗室的診斷試劑，單克隆抗體以其特異性強、純度高、均一性好等優點，廣泛應用於酶聯免疫吸附試驗、放射免疫分析、免疫組化和流式細胞儀等技術。並且單克隆抗體的應用，很大程度上促進了商品化試劑盒的發展。目前，應用單克隆抗體製作的商品化試劑盒廣泛應用於： ①病原微生物抗原、抗體的檢測； ②腫瘤抗原的檢測； ③免疫細胞及其亞群的的檢測； ④激素測定； ⑤細胞因子的測定。 單克隆抗體對抗原的識別，與多克隆抗體有很大的不同。不同試劑盒因使用的單克隆抗體不同，識別抗原的位點不同，導致檢測結果有一定差異。因此，標准化問題還需要進一步研究。 2．蛋白質的提純 單克隆抗體是親和層析中重要的配體。將單克隆抗體吸附在一個惰性的固相基質（如Speharose 2B、4B、6B等）上，並制備成層析柱。當樣品流經層析柱時，待分離的抗原可與固相的單克隆抗體發生特異性結合，其餘成分不能與之結合。將層析柱充分洗脫後，改變洗脫液的離子強度或pH，欲分離的抗原與抗體解離，收集洗脫液便可得到欲純化的抗原。 3． 腫瘤的導向治療和放射免疫顯像技術 將針對某一腫瘤抗原的單克隆抗體與化療葯物或放療物質連接，利用單克隆抗體的導向作用，將葯物或放療物質攜帶至靶器官，直接殺傷靶細胞，稱為腫瘤導向治療。另外，將放射性標記物與單克隆抗體連接，注入患者體內可進行放射免疫顯像，協助腫瘤的診斷。目前單克隆抗體主要為鼠源性抗體，異種動物血清可引起人體過敏反應。因此，制備人-人單克隆抗體或人源化抗體更為重要，但此方面仍未取得明顯進展。

⑵ 單克隆抗體的制備技術路線和關鍵點

動物的選擇與免疫

1．動物的選擇 純種BALB/C小鼠，較溫順，離窩的活動范圍小，體弱，食量及排污較小，一般環境潔凈的實驗室均能飼養成活。目前開展雜交瘤技術的實驗室多選用純種BALA/C小鼠。

2．免疫方案 選擇合適的免疫方案對於細胞融合雜交的成功，獲得高質量的McAb至關重要。一般在融合前兩個月左右根據確立免疫方案開始初次免疫，免疫方案應根據抗原的特性不同而定。

（1）可溶性抗原免疫原性較弱，一般要加佐劑，半抗原應先制備免疫原，再加佐劑。常用佐劑：福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑。

初次免疫 抗原1～50μg加福氏完全佐劑皮下多點注射或脾內注射（一般0.8～1ml,0.2ml/點）

↓3周後

第二次免疫 劑量同上，加福氏不完全佐劑皮下或ip（腹腔內注射）（ip劑量不宜超過0.5ml）

↓3周後

第三次免疫 劑量同一，不加佐劑，ip（5～7天後采血測其效價）

↓2～3周

加強免疫，劑量50～500μg為宜，ip或iv（靜脈內注射）

↓3天後

取脾融合

目前，用於可溶性抗原（特別是一些弱抗原）的免疫方案也不斷有所更新，如：①將可溶性抗原顆粒化或固相化，一方面增強了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改變抗原注入的途徑，基礎免疫可直接採用脾內注射。③使用細胞因子作為佐劑，提高機體的免疫應答水平，增強免疫細胞對抗原的反應性。

（2）顆粒抗原免疫性強，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果。以細胞性抗原為例，免疫時要求抗原量為1～2×107個細胞。

初次免疫 1×107/0.5ml ip

↓2～3周後

第二次免疫 1×107/0.5ml ip

↓3周後

加強免疫（融合前三天）1×107/0.5ml ip或iv

↓

取脾融合

細胞融合

1．細胞融合前准備

（1）骨髓瘤細胞系的選擇：骨髓瘤細胞應和免疫動物屬於同一品系，這樣雜交融合率高，也便於接種雜交瘤在同一品系小鼠腹腔內產生大量McAb。常用的骨髓瘤細胞系見表2-4。

表2-4用於融合試驗的主要骨髓瘤細胞系

名 稱
來 源
耐 受 葯 物
Ig鏈

H L

P3/X63-Ag8(X63)
BALB/C骨髓瘤MOPC-21
8-氮鳥嘌呤
r1 K

P3/X63-Ag8.653(X63-Ag8.653)
P3/X63-Ag8
8-氮鳥嘌呤
－ －

P3/NSI-1-Ag4-1(NS-1)
P3/X63-Ag8
8-氮鳥嘌呤
－ K（不分泌型）

P3/X63-Ag8.Ul(P3Ul)
（X63×BALB/C脾細胞）雜交瘤
8-氮鳥嘌呤
－ －

SP2/0-Ag14(SP2/0)
（X63×BALB/C脾細胞）雜交瘤
8-氮鳥嘌呤
－ －

F0
BALB/C骨髓瘤
8-氮鳥嘌呤
－ －

S194/5.XXO.BU.1
P3/X63-Ag8
5-溴脫氧尿嘧啶核苷
－ －

MPC11-45.6TG1.7
BALB/C骨髓瘤MPC-11
6-巰鳥嘌呤
r2b K

210.RCY3.Ag1.2.3
LOU大鼠骨髓瘤R210
8-氮鳥嘌呤
－ K

GM15006TG-A12
人骨髓瘤GM1500
6-巰鳥嘌呤
r1 K

U-266AR
人骨髓瘤U-266
8-氮鳥嘌呤
ε λ

骨髓瘤細胞的培養可用一般的培養液，如RPMI1640，DMEM培養基。小牛血清的濃度一般在10%～20%，細胞濃度以104～5×105/ml為宜，最大濃度不得超過106/ml。當細胞處於對數生長的中期時，可按1：3～1：10的比例傳代。每3～5天傳代一次。細胞在傳代過程中，部分細胞可能有返祖現象，應定期用8-氮鳥嘌呤進行處理，使生存的細胞對HAT呈均一的敏感性。

（2）飼養細胞：在組織培養中，單個或少數分散的細胞不易生長繁殖，若加入其它活細胞，則可促進這些細胞生長繁殖，所加入的這種細胞數被稱為飼養細胞。在制備McAb的過程中，許多環節 需要加飼養細胞，如在雜交瘤細胞篩選、克隆化和擴大培養過程中，加入飼養細胞是十分必要的。常用的飼養細胞有：小鼠腹腔巨噬細胞（較為常用）、小鼠脾臟細胞或胸腺細胞。也有人用小鼠成纖維細胞系3T3經放射線照射後作為飼養細胞。飼養細胞的量為一般為2×104或105細胞/孔。

2．細胞融合的步驟

（1）制備飼養細胞層：一般選用小鼠腹腔巨噬細胞。

與免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C小鼠，6～10周

↓

拉頸 處死，浸泡在75%酒精內，3～5min

↓

用無菌剪刀剪開皮膚，暴露腹膜

↓

用無菌注射器注入5～6ml預冷的培養液（嚴禁刺破腸管）

↓

反復沖洗，吸出沖洗液

↓

沖洗液放入10ml離心管，1200rpm/分離5～6min

↓

用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培養液混懸，調整細胞數至1×105/ml

↓

加入96孔板，100μl/孔

↓

放入37。c CO2孵箱培養

（2）制備免疫脾細胞

最後一次加強免疫3天後小鼠拉頸處死

↓

無菌取脾臟，培養液洗 一次

↓

脾臟研碎，過不銹鋼篩網

↓

離心，細胞用培養液洗2次

↓

計數

↓

取108脾淋巴細胞懸液備用

（3）制備骨髓瘤細胞

取對數生長骨髓瘤細胞離心

↓

用無血清培養液洗2次

↓

計數，取得×107細胞備用

（4）融合

①將骨髓瘤細胞與脾細胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml離心管中用無血清不完全培養液洗1次，離心，1200rpm,8min;棄上清，用吸管吸凈殘留液體，以免影響聚乙二醇（PEG）濃度。輕輕彈擊離心管底，使細胞沉澱略松動。

②90s內加入37℃預溫的1ml 45%PEG（分子量4000）溶液，邊加邊輕微搖動。37℃水浴作用90s。

③加37。C預溫的不完全培養液以終止PEG作用，每隔2min分別加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。

④離心，800rpm, 6min。

⑤充上清，用含20%小牛血清HAT選擇培養液重懸。

⑥將上述細胞，加到已有飼養細胞層的96孔板內，每孔加100μl。一般一個免疫脾臟可接種4塊96孔板。

⑦將培養板置37℃、5%CO2培養箱中培養。

選擇雜交瘤細胞及抗體檢測

1．HAT選擇雜交瘤細胞 脾細胞和骨髓瘤細胞經PEG處理後，形成多種細胞的混合體，只有脾細胞與骨髓細胞形成的雜交瘤細胞才有意義。在HAT選擇培養液中培養時，由於骨髓瘤細胞缺乏胸苷激酶或次黃嘌呤鳥嘌呤核糖轉移酶，故不能生長繁殖，而雜交瘤細胞具有上述兩種酶，在HAT選擇培養液可以生長繁殖。

在用HAT選擇培養1～2天內，將有大量瘤細胞死亡，3～4天後瘤細胞消失，雜交細胞形成小集落，HAT選擇培養液維持7～10天後應換用HT培養液，再維持2周，改用一般培養液。在上述選擇培養期間，雜交瘤細胞布滿孔底1/10面積時，即可開始檢測特異性抗體，篩選出所需要的雜交瘤細胞系。在選擇培養期間，一般每2～3天換一半培養液。

2．抗體的檢測 檢測抗體的方法應根據抗原的性質、抗體的類型不同，選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡便、特異、敏感的方法為原則。

常用的方法有：（1）放射免疫測定（RIA）可用於可溶性抗原、細胞McAb的檢測。（2）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）可用於可溶性抗原、細胞和病毒等McAb的檢測。（3）免疫熒光試驗適合於細胞表面抗原的McAb的檢測。（4）其它如間接血凝試驗、細胞毒性試驗、旋轉粘附雙層吸附試驗等。

雜交瘤的克隆化

雜交瘤克隆化一般是指將抗體陽性孔進行克隆化。因為經過HAT篩選後的雜交瘤克隆不能保證一個孔內只有一個克隆。在實際工作中，可能會有數個甚至更多的克隆，可能包括抗體分泌細胞、抗體非分泌細胞、所需要的抗體（特異性抗體）分泌細胞和其它無關抗體的分泌細胞。要想將這些細胞彼此分開就需要克隆化。克隆化的原則是，對於檢測抗體陽性的雜交克隆盡早進行克隆化，否則抗體分泌的細胞會被抗體非分泌的細胞所抑制，因為抗體非分泌細胞的生長速度比抗體分泌的細胞生長速度快，二者競爭的結果會使抗體分泌的細胞丟失。即使克隆化過的雜交瘤細胞也需要定期的再克隆，以防止雜交瘤細胞的突變或染色體丟失，從而喪失產生抗體的能力。

克隆化的方法很多，最常用的是有限稀釋法和軟瓊脂平板法。

1．有限稀釋法克隆

（1）克隆前1天制備飼養細胞層（同細胞融合）。

2）將要克隆的雜交瘤細胞從培養孔內輕輕吹乾，計數。

（3）調整細胞為3～10個細胞/ml。

（4）取頭天准備的飼養細胞層的細胞培養板，每孔加入稀釋細胞100μl。孵育於37℃、5%CO2孵箱中 。

（5）在第7天換液，以後每2～3天換液1次。

（6）8～9天可見 細胞克隆形成，及時檢測抗體活性。

（7）將陽性孔的細胞移至24孔板中擴大培養。

（8）每個克隆應盡快凍存。

2．軟瓊脂培養法克隆

（1）軟瓊脂的配製：含有20%NCS（小牛血清）的2倍濃縮的RPMI1640。

①1%瓊脂水溶液：高壓滅菌，42℃預熱。

②0.5%瓊脂：由1份1%瓊脂加1份含20%小牛血清的2倍濃縮的RPMI1640配製而成。置42℃保溫。

（2）用上述0.5%瓊脂液（含有飼養細胞）15ml傾注於直徑為9cm的平皿中，在室溫中待凝固後作為基底層備用。

（3）按100/ml，500/ml或5000/ml等濃度配製需克隆的細胞懸液。

（4）1ml 0.5%瓊脂液（42℃預熱）在室溫中分別與1ml不同濃度的細胞懸液相混合。

（5）混勻後立傾注於瓊脂基底層上，在室溫中10min，使其凝固，孵育於37℃、5%CO2孵箱中。

（6）4～5天 後即可見針尖大小白色克隆，7～10天後，直接移種至含飼養細胞的24孔中進行培養。

（7）檢測抗體，擴大培養，必要是地再克隆化。

雜交瘤細胞的凍存與復甦

1．雜交瘤細胞的凍存 及時凍存原始孔的雜交瘤細胞每次克隆化得到的亞克隆細胞是十分重要的。因為在沒有建立一個穩定分泌抗體的細胞系的時候，細胞的培養過程中隨時可能發生細胞的污染、分泌抗體能力的喪失等等。如果沒有原始細胞的凍存，則可因上述意外而前功盡棄。

雜交瘤細胞的凍存方法同其他細胞系的凍存方法一樣，原則上細胞應在每支安瓿含1×106以上，但對原始孔的雜交瘤細胞可以因培養環境不同而改變，在24孔培養板中培養，當長滿孔底時，一孔就可以裝一支安瓿凍存。

細胞凍存液：50%小牛血清；40%不完全培養液；10%DMSO（二甲基亞碸）。

凍存液最好預冷，操作動作輕柔、迅速。凍存時從室溫可立即降至0℃後放入-70℃超低溫冰箱，次日轉入液氮中。也可用細胞凍存裝置進行凍存。凍存細胞要定期復甦，檢查細胞的活性和分泌抗體的穩定性，在液氮中細胞可保存數年或更長時間。

2．細胞復甦方法 將玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37℃水浴中，在1min內使凍存的細胞解凍，將細胞用完全培養液洗滌兩次，然後移入頭天已制備好的飼養層細胞的培養瓶內，置37℃、5%CO2孵箱中培養，當細胞形成集落時，檢測抗體活性。

單克隆抗體的大量生產

大量生產單克隆抗體的方法主要有兩種：

（1）體外使用旋轉培養管大量培養雜交瘤細胞，從一清液中獲取單克隆抗體。但此方法產量低，一般培養液內抗體含量為10～60μg/ml,如果大量生產，費用較高。

（2）體內接種雜交瘤細胞，制備腹水或血清。

①實體瘤法：對數生長期的雜交瘤細胞按1～3×107/ml接種於小鼠背部皮下，每處注射0.2ml,共2～4點。待腫瘤達到一定大小後（一般10～20天）則可采血，從血清中獲得單克隆 抗體的含量可達到1～10mg/ml。但采血量有限。

②腹水的制備：常規是先腹腔注射0.5ml Pristane (降植烷)或液體石蠟於BALB/C鼠，1～2周後腹腔注射1×106個雜交瘤細胞，接種細胞7～10天後可產生腹水，密切觀察動物的健康狀況與腹水徵象，待腹水盡可能多，而小鼠頻於死亡之前，處死小鼠，用滴管將腹水吸入試管中，一般一隻小鼠可獲5～10ml腹水。也可用注射器抽提腹水，可反復收集數次。腹水中單克隆抗體含量可達到5～10mg/ml，這是目前最常用的方法，還可將腹水中細胞凍存起來，復甦後轉種小鼠腹腔則產生腹水塊、量多。

單克隆抗體的鑒定

對制備的McAb進行系統的鑒定是十分必要的，應做下述幾個方面的鑒定：

1．抗體特異性的鑒定 除用免疫原（抗原）進行抗體的檢測外，還應該用與其抗原成分相關的其它抗原進行交叉試驗，方法可用ELISA、IFA法。例如：①制備抗黑色素瘤細胞的McAb，除用黑色素瘤細胞反應外，還應該用其它臟器的腫瘤細胞和正常細胞進行交叉反應，以便挑選腫瘤特異性或腫瘤相關抗原的單克隆抗體。②制備抗重組的細胞因子的單克隆抗體，應首先考慮是否與表達菌株的蛋白有交叉反應，其次是與其它細胞因子間有無交叉。

2．McAb的Ig類與亞類的鑒定 一般在用酶標或熒光素標記的第二抗體進行篩選時已經基本上確定了抗體的Ig類型。如果用的是酶標或熒光素標記的兔抗鼠IgG或IgM，則檢測出來的抗體一般是IgG類或IgM類。至於亞類則需要用標准抗亞類血清系統作雙擴或夾心ELISA來確定。在作雙擴試驗時，如加入適量的PEG（3%），更有利於沉澱線的形成。

3．McAb中和活性的鑒定 用動物或細胞的保護實驗來確定McAb的生物學活性。例如，如果確定抗病毒McAb的中和活性，則可用抗體和病毒同時接種於易感的動物或敏感的細胞，來觀察動物或細胞是否得到抗體的保護。

4．McAb識別抗原表位的鑒定 用競爭結合試驗，測相加指數的方法，測定McAb所識別抗原位點，來確定McAb的識別的表位是否相同。

5．McAb親合力的鑒定 用ELISA或RIA競爭結合試驗來確定McAb與相應抗原結合的親合力。

參考：http://www.foodmate.net/topic/163/3/34067.html

⑶ 單克隆抗體的鑒定實驗

1．雜交瘤細胞染色體的檢查採用秋水仙素裂解法進行。2．單克隆抗體的類型、亞型的測定：購買兔抗小鼠Ig類型和亞型的標准抗血清，採用瓊脂擴散法或ELISA夾心法測定單抗的Ig類型和亞型。
ELISA夾心法測定單抗的Ig類型和亞型的試劑盒說明書 1、首先將試劑盒恢復室溫（大約30分），然後用純水把清洗液配成工作濃度（一份濃縮清洗液加19份純水）。
2、取出酶標板。每個標本需要6孔，陽性對照6孔。多餘的用自封袋保存，記得放入乾燥劑。
3、將細胞培養上清（或特異親和純化的抗體）50μl加入酶標微孔板，每個標本加6孔，陽性對照也是加6孔每孔50μl。然後每孔再加入50μl標本稀釋液。貼上封板膜37℃溫育30分鍾。
4、棄去板內液體，洗板5遍後在不掉纖維的吸水材料上拍干或機洗5遍。再在每個標本的6孔中分別加入6種酶標二抗各100μl，通用陽性對照的6孔也一樣。在加樣圖上或酶標板上做好標記。貼上封板膜37℃溫育30分鍾。
5、吸棄板內液體，洗板5遍後在不掉纖維的吸水材料上拍干或機洗5遍。每孔分別加入顯色劑A和顯色劑B各50μl，換一張新的封板膜貼板避光37℃顯色20分鍾。
6、本試劑盒特異性好一般肉眼即可觀察出結果，看顯色藍的那個孔所對應的酶標二抗就知道此標本的Ig類或亞類。更可將反應終止液（每孔50μl）終止反應後用酶標儀450nm測定波長，630nm參考波長雙波長測定結果，參看高值孔所對應的酶標二抗就知道此標本的Ig類或亞類。陽性對照0D小於0.5實驗無效，需要重做。 1、雖然本試劑盒過期後很久還有使用價值但還是請您在有效期內使用。
2、在檢測腹水類單抗時要稀釋到1/5萬，雖然可以分辨但並不建議您這樣做。此類樣品成分十分復雜，有干擾結果的可能。在此種情況下您可以選擇本公司的C030215抗體鑒定試劑。它會給您帶來滿意的結果。
3、手洗板子時一定要把孔加滿，停留10秒然後棄盡，最後要拍干凈。特別是在酶標二抗溫育後洗板時一定要把酶吸出而不是甩出，要吸凈。這個在手工洗板時對結果很重要。
4、一次沒用完的板子要帶乾燥劑放自封袋封好，隨盒存放。
5、拿放板子時不要劇烈抖動，以免孔間交叉污染出現錯誤結果。
6、出現異常結果請隨時咨詢我們。
3．單抗的特異性鑒定可以採用各種方法，如免疫熒光法、ELISA法、間接血凝和免疫印跡技術等，同時還需做免疫阻斷試驗等。
4．單抗的效價測定可採用凝集反應、ELISA或放射免疫測定。不同的測定方法效價不同。培養上清液的效價遠不如腹水的效價。採用凝集反應，腹水效價可達5×104。而採用ELISA檢查，腹水效價可達1.0×106。單抗的效價以培養上清和腹水的稀釋度表示。
5．必要時還可以測定單抗的親和力和識別抗原表位的能力測定。

⑷ 單克隆抗體的制備過程中，檢驗陽性是什麼意思

單抗的制備中，經篩選後的雜交瘤細胞產生的抗體是不一樣的，其中有些是我們所需要的單克隆抗體，所以要把篩選後的雜交瘤細胞在多孔板上培養，每個小孔中只有一個細胞，然後用抗原去試，呈陽性的就是能產生特定抗體的雜交瘤細胞。

⑸ 幽門螺旋桿菌的檢測方法是什麼

目前檢測幽門螺旋桿菌的方法有：一、呼氣試驗，即碳13或碳14呼氣試驗，需要早晨空腹去檢查，先吞服一顆尿素酶膠囊，隔15分鍾後再吹氣檢查，結果比較精確；二、胃鏡下檢查，通過胃鏡下取黏膜組織行快速尿素酶試驗；三、抽血檢查，抽血檢查幽門螺旋桿菌抗體，結果呈陽性提示近期或正在有感染；四、取大便化驗幽門螺旋桿菌抗體，結果准確性相對差一點。

⑹ 如何針對一名細菌感染患者進行病原生物學的診斷

摘要：病原微生物種類繁多，變異迅速，快速鑒定病原微生物的檢驗技術也在不斷發展前進著。目前，應用比較廣泛的病原微生物檢測方法主要有直接塗片鏡檢、分離培養、生化反應、血清學反應、核酸分子雜交、基因晶元、多聚酶鏈反應等，該文對這些檢測技術進展做一綜述。 對人和動物具有致病性的微生物稱為病原微生物，又稱病原體，有病毒、細菌、立克次體、支原體、衣原體、螺旋體、真菌、放線菌、朊粒等。這些病原微生物可引起感染、過敏、腫瘤、痴獃等疾病，也是危害食品安全的主要因素之一。近年來出現的SARS、高致病性禽流感、西尼羅病毒感染等疾病的傳染性極強，往往造成世界性大流行，因此對病原體的檢測必須做到快速、准確。常規病原學檢測方法操作繁瑣，檢測周期長，而且對操作人員技術水平要求比較高。隨著醫學微生物學研究技術的不斷發展，病原學診斷已不再局限於病原體水平，深入到分子水平、基因水平的檢測手段不斷出現並被應用於臨床和實驗室 J。核酸分子雜交技術、PCR技術、基因晶元技術等檢測方法，自動化程度高，快速省時、無污染、結果精確，可以准確靈敏地鑒定病原微生物。1 傳統的病原微生物的檢測方法傳統的病原微生物學實驗室檢查以染色、培養、生化鑒定等為主，將標本直接塗片染色鏡檢和接種在培養基上進行分離培養是對細菌或真菌感染性疾病進行病原學診斷的常用方法。1．1 直接塗片鏡檢病原微生物體形體積微小，大多無色半透明狀，將其染色後可藉助顯微鏡觀察其大小、形態、排列等。直接塗片染色鏡檢簡便快速，對那些具有特殊形態的病原微生物感染仍然適用，例如淋球菌感染、結核分枝桿菌、螺旋體感染等的早期初步診斷。直接塗片鏡檢不需要特殊的儀器和設備，在基層實驗室里仍然是十分重要的病原微生物檢測手段。1．2 分離培養與生化反應 分離培養主要用於臨床標本(如血液、痰、糞便等)或培養物中有多種細菌時對某一種細菌的分離。細菌的生長繁殖需要一定時間，檢測周期較長，不能同時處理批量樣本。為解決這一問題，各種自動化培養和鑒定系統不斷產生，傳統鑒定方法也在逐步改進，大大加快了檢驗速度。例如Microscan WalLCAway全自動微生物分析儀，可同時做細菌鑒定和葯敏試驗，檢驗500多個菌種。苛養菌如肺炎鏈球菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血桿菌等對營養要求比較高，常規培養陽性率低。雍剛 等將不要同比例的葡萄糖、玉米澱粉、生長因子、酵母粉、氨基酸等特殊增菌劑加入到巧克力培養基中製成了新型淋病奈瑟菌培養基，大大提高了淋病奈瑟菌的分離培養率。蘇盛通等在營養瓊脂中加人了中葯紅棗、赤小豆培養甲型鏈球菌、乙型鏈球菌、肺炎鏈球菌等細菌，生長指數明顯高於血平板。1．3 組織細胞培養 活組織細胞培養適於專營活組織細胞內生存的病原體，包括病毒、立克次體、衣原體等。不同病原體敏感的組織細胞是不一樣的，將活細胞從病原體敏感的動物組織中取出在體外進行原代培養或用病原體敏感細胞系進行傳代培養，再將病原體接種於相應的組織細胞中後，病原體可在其中繁殖增長，引起特異性的細胞病變效應。也可以將病原體直接接種於敏感動物體內，引起相應組織器官出現特異的病理學改變。往往可以根據這些特異的病變對病原體進行鑒定。2 血清學與免疫學檢測血清學檢測是通過已知的抗體或抗原來檢測病原體的抗原或抗體從而對病原體進行快速鑒定的技術，簡化了鑒定步驟，常用的方法包括血清凝集技術、乳膠凝集實驗、熒光抗體檢測技術、協同凝集試驗、酶聯免疫測試技術等。酶聯免疫技術的應用大大提高了血清學檢測的敏感性和特異性，不僅可檢測樣本中病原體抗原，也可檢測機體的抗體成分。幽門螺奸菌在我國人群感染率高達50％ ～80％ ，應用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測唾液中抗HP抗體來診斷HP感染，其結果滿意。乙型肝炎病毒(HBV)在我國人群中感染率極高，ELISA應用於乙型肝炎病人早期血清學診斷的效果最為明顯。臨床上致病菌往往和非致病菌混合在一起，如何從這些細菌中分離出目標菌是關鍵。免疫磁珠分離技術(IMBS)是近年來發展起來的在微生物檢測領域中一種新技術。其基本原理是將特定病原體的單抗或多抗或二抗偶聯到磁珠微球上，通過抗原抗體反應形成磁珠一目標病原體復合物或磁珠一一抗一目標病原體復合物，在外部磁場磁力的作用下，將目標病原體分離出來。目前已經開發出了針對各種病原體的免疫磁珠，如大腸埃希菌、李斯特菌、白色念珠菌、軍團菌等，廣泛應用到各級科研和實驗室 。經IMBS分離出的白色念珠菌可直接在顯微鏡下檢測，檢測時間縮短至4 h。IM—Bs還可以和其它檢測技術聯合來檢測病原菌，免疫磁珠分離得到的目標菌可繼續用於分離培養使大腸埃希菌0157最低檢測限由200 cfu·g 提高到2 cfu·g～；IMBS結合聚合酶鏈反應(IMBS—PCR)可對培養條件比較特殊的細菌如苛養菌、厭氧菌進行快速檢測，肉類中的產毒素型產氣莢膜梭菌經IMBS．PCR檢測，檢測時間縮短到10 h，最低檢測限可達10cfu·g～，有研究者利用IMBS結合實時熒光定量PCR(IMBS—RT—PCR)成功檢測出了水中的輪狀病毒和草莓的諾如病毒，檢測時間大大縮短；Leon—Velarde等利用IMB8結合酶聯檢測，大大提高了沙門菌的檢測效率。3 基因檢測隨著科技水平發展，分子生物學檢測技術日新月異，對病原微生物的鑒定已不再局限於對普通外部形態結構和生理生化特性等的一般檢驗上，而是深入到了分子水平、核酸水平。病原微生物的核酸序列即基因片段都是特異的，有別於其他種或屬，檢測其特有的基因片段序列可用來鑒別病原微生物。隨著科技的發展，基因檢測技術逐漸代替其它檢測技術，成為臨床檢驗科和基礎實驗室對病原體的主流檢測技術。3．1 核酸雜交技術具有一定互補序列的核苷酸單鏈在液相或固相中按鹼基互補配對原則締成異質雙鏈的過程叫核酸雜交，其雜交雙方是所使用探針和要檢測的核酸。在病原微生物檢測中核酸分子雜交主要包括膜上印跡雜交和核酸原位雜交兩種。膜上印跡雜交是指將核酸從微生物細胞中分離出來，純化後在體外結合到一定的固相支持物上，與存在於液相中標記的核酸探針進行雜交。核酸原位雜交是指標記的核酸探針直接與細胞或組織切片中的核酸進行雜交。探針還可以用熒游標記，在熒光顯微鏡或激光掃描共聚焦顯微鏡下即可鑒別病原體還可顯示在三維空間中的位置。核酸分子雜交檢測技術與其它方法相比顯著地優點是簡便、敏感、快速、特異。Wong 等用熒游標記2個不同的寡核苷酸探針從血液標本中檢測出假單胞菌屬和不動桿菌屬的細菌，最低檢測限為10 cfu·mL～，特異度為100％ ，檢測時間不到2 h。寡核苷酸探針是針對病原體特異基因序列設計的，可以將待檢測的病原體定位在不同的分類等級，如科、屬、種、亞種「 。（病原微生物檢測技術進展）3．2 基因晶元技術基因晶元(DNA chip)又稱為DNA微陣列(DNA microarray)或DNA晶元，是生物晶元的一種 j，是核酸分子雜交技術發展延伸而來的。通過微加工技術，將數以萬計甚至百萬計的基因探針即DNA片段有規律地排列成二維DNA探針陣列，固定到矽片、玻片等固態支持物上，與標記的樣品分子進行核酸雜交，用於基因檢測工作。其測序原理與核酸雜交一樣，但解決了傳統核酸雜交技術操作繁雜、檢測效率低、自動化程度不高的缺點。基因晶元在病原微生物感染診斷上的應用，大大縮短了確診所需要的時間，而且能檢測出病原體是否耐葯、對那些抗生素耐葯、對那些抗生素敏感。Naas 等設計的基因晶元可以檢測出銅綠假單胞菌、腸桿菌屬、鮑氏菌屬中各型B一內醯胺酶類耐葯基因。蔡挺等設計的基因晶元檢測出大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑氏不動桿菌、陰溝腸桿菌對l7種抗菌葯物的耐葯率。Batchelor 等開發的基因晶元可以檢測出編碼耐超廣譜8．內醯胺酶、磺胺類、四環素類、氨基糖甙類等47個耐葯基因的大腸埃希菌和沙門氏菌。基因晶元技術同樣還有些問題有待解決，如提高晶元的特異性和檢測信號的敏感性，降低晶元的製作成本等，而且多數晶元都需要昂貴的檢測儀器，這些問題使得基因晶元到目前主要局限於實驗室研究而未能廣泛應用於臨床病原微生物的檢測與鑒定。（病原微生物檢測技術進展）3．3 PCR技術聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一種在體外是用已知寡核苷酸引物引導未知片段中微量待測基因片段並進行擴增的技術。由於PCR可以對待測基因進行擴增，特別適用於病原體感染早期的診斷，但是如果引物特異性不強，可能會造成假陽性的出現。PCR技術在近20年裡發展迅速，從基因擴增到基因的克隆和改造以及遺傳分析，可靠性逐步提高。Jbara 用PCR和傳統法直接檢測75例樣本中的流感嗜血桿菌、腦膜炎奈瑟菌、肺炎鏈球菌，與傳統方法相比，PCR檢測的特異度和靈敏度分別為87．3％ 和100％ 。1988年Chamberian等提出了多重PCR的概念，同一PCR反應體系裡加上二對以上引物，可同時擴增出多個核酸片段，適合大量樣本的分析與鑒定。多重PCR具有：(1)高效性，在同一反應體系內可同時檢出多種病原微生物，或對同一病原微生物的不同型別進行分型；(2)系統性，多重PCR很適宜於成組病原體的檢測，如幾種肝炎病毒同時感染；淋球菌、梅毒螺旋體、艾滋病病毒等多重性病病原體的感染；需特殊培養的無芽胞厭氧菌感染；破傷風桿菌，炭疽桿菌，產氣莢膜桿菌，鼠疫耶爾森菌等戰傷感染細菌感染；(3)經濟簡便性，多種病原體在同一反應管內同時被檢出，節省試劑、節約費用、節省時間，為臨床提供更快更多更准確的診斷信息。Reyes等 用多重PCR從90例發熱但培養陰性的兒童細菌性腦膜炎腦脊液樣本中檢測出了腦膜炎奈瑟球菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌，特異度100％ ，敏感度89％。實時熒光定量PCR，在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程。具有高度靈敏、高度特異、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點。實時熒光定量PCR對性病病原體早期確診、窗口期篩查、療效檢測、基因變異分析和預後評估等具有重要價值，為流行病學調查提供幫助 J。王娉等 建立了多重實時熒光定量PCR反應體系，同一體系能同時快速檢測出耐甲氧西林和產腸毒素A的金黃色葡萄球菌。熒光基團標記的特異性引物可准確反映病原體感染和葯物療效，特別適用於不可人工培養和難以培養的病原體如病毒、衣原體等感染的診斷。基因晶元技術與多重PCR結合可以通過PCR對目的基因進行放大，通過基因晶元的熒光探針增加檢測的靈敏性和特異性，使得兩種檢測技術的優勢互補，已廣泛應用於病原微生物的檢測。將病原體特異性基因作為靶基因設計出引物與探針，進行多重PCR擴增，制備出寡核苷酸晶元，再對待測樣本靶基因進行多重PCR擴增，將擴增產物與病原菌多重PCR基因晶元檢測體系雜交，可根據雜交信號直觀地判讀樣品中所含病原體的種類、型別、毒力、侵襲力，從而對病原體進行檢測和鑒定。（病原微生物檢測技術進展）3．4 其它基因檢測技術分子生物學技術飛速發展，各種新的基因檢測手段不斷出現。Notomi等於2000年開發出一種新的環介導恆溫核酸擴增法(1oop—mediated isothermal amplifi—cation of DNA，簡稱LAMP)，針對靶基因序列上6或8個特異區域設計出4或6條引物，在具有鏈置換活性的DNA聚合酶的作用下形成環狀結構和鏈置換對目標DNA大量擴增。短短幾年LAMP已被廣泛應用於疾病診斷、食品檢驗、環境監測、生物安全等各方面心 ]。李蒙等 運用LAMP法60 min檢測了16例開放性傷口深部傷口感染分泌物中的破傷風芽孢梭菌，其中陽性為4例，最低檢測限為4 x 10 。有研究報道l2 用LAMP技術快速檢測了200例肺結核患者的痰標本，結核分枝桿菌的陽性檢出率遠遠高於培養法和染色法。多位點可變數目串聯重復序列分析(Multiple—locus Variable—nun—ber Tandem repeat Analysis，MLVA)是一種根據病原體基因組中可變數目串聯重復序列的特徵來對病原體基因分型的一種技術，廣泛應用於金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、炭疽芽胞桿菌等的基因分型與鑒定 ⋯。4 小結與展望對病原體進行快速准確的檢測和鑒定是傳染病防治工作的首要問題。隨著生物學研究由宏觀領域向微觀領域的發展，病原體檢測方法也從組織形態學水平深入到分子水平、基因水平。近年來發展起來的病原微生物高通量檢測技術樣本需要量少、快速省時、無污染、診斷結果精確、自動化程度高，相信隨著研究的不斷進展和深入，這些高通量診斷技術和方法必將在病原微生物的診斷分析方面起到越來越重要的作用，而多種檢測技術的聯合和綜合更是有著廣闊的應用前景。

⑺ 病原微生物中細菌常見檢測方法有哪些

1、快速測試片技術法

快速測試片是指以紙片、紙膜、膠片等作為培養基載體，將特定的培養基和顯色物質附著在上面，通過微生物在上面的生長、顯色來測定食品中微生物的方法。

細菌總數檢測紙片的研製始於 20 世紀 80 年代，其主要優點是簡便、實用、經濟、操作性強。近年來以濾紙和美國某公司的 Petrifilm 為載體的測試片已開始被廣泛應用。

2、生物電化學方法

生物電化學方法是指通過電極測定微生物產生或消耗的電荷，從而提供分析信號的方法。微生物在滋生代謝過程中，培養基的電化學性質如電流、電位、電阻和電導等會發生變化，所以可以通過檢測分析這些電化學參量的變化來實現對微生物的快速測定。

常見的有：阻抗分析法、電位分析法、電流分析法等。生物電化學方法具有測量快速、直觀、操作簡單、測量設備成本低和信號的可控性等特點。

3、微菌落技術

微菌落是指細菌生長繁殖早期在固相載體上所形成的只能藉助於顯微鏡觀察的微小菌落。微菌落技術具有快速、經濟、實用的特點，其研究始於 20 世紀50年代，定量測定技術從 20 世紀 70 年代開始，國外已有報道將該法應用於水、食品中細菌總數的快速檢測。

4、氣相色譜法

氣相色譜應用到微生物的檢測中，主要是依據不同微生物的化學組成或其產生的代謝產物各異，利用上述色譜檢測可直接分析各種體液中的細菌代謝產物、細胞中的脂肪酸、蛋白質、氨基酸、多肽、多糖等，以確定病原微生物的特異性化學標志成分，協助病原診斷和檢測。

5、高效液相色譜法

利用高效液相色譜檢測可分析各種體液中的細菌代謝產物、病原微生物等，以確定病原微生物的特異性化學標志成分，協助病原診斷和檢測。

⑻ 本人想做一種鑒定細菌的單克隆抗體，求助

1、免疫：
將培養好的細菌用PBS或生理鹽水充分洗滌幾次後，用麥氏比濁管進行比濁計數，計數後就可以進行免疫了。
2、檢測：
用你做的細菌的特異性抗原決定簇所在的抗原（膜抗原、鞭毛抗原等）進行包被酶標板。
3、特異性鑒定：
用與你做的細菌具有相似結夠的細菌做交叉反應。
其他的步驟跟常規做單抗的步驟一致。

⑼ 如何實現快速檢測及有效控制沙門氏菌

沙門氏菌(Salmonella)是一種革蘭氏陰性腸桿菌, 也是腸桿菌科中最主要的食源性致病菌。據有關資料統計由沙門氏菌引起的疾病病例在病原菌食源性疾病病例中所佔比例已超過三分之二，2007年發生的「 花生醬事件」以及 2008 年發生的「 西紅柿 事件」等[1]沙門氏菌中毒事件的發生也使得食品中沙門氏菌的檢測受到人們的普遍關注。本文主要是對食品中沙門氏菌的傳統檢測方法以及後續建立的以分子生物學、免疫學、生物感測器和電化學為基礎的快速檢測方法進行了系統的綜述，旨在為該致病菌的檢測方法的研究應用提供一定的參考。
1、 傳統的檢測方法（國標法）
目前, 我國對食品中沙門氏菌的檢測大多採用GB 4789.4-2010《食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》對食品樣品進行檢測，這種傳統的培養方法可分為前增菌、增菌、分離培養、生化試驗和血清學鑒定等步驟進行。雖然傳統培養法可靠性高，但是其操作繁瑣且耗時費力，並不能滿足食品快速檢測的要求。
2、分子生物學檢測方法
2.1聚合酶鏈反應技術
PCR技術是一項敏感性高、特異性強且快速准確的微生物檢測技術，也被許多學者用於對食品中沙門氏菌進行檢測和研究。汪琦等[2]就採用傳統培養方法 、BAX(r)方法和PCR 方法 3 種方法對沙門氏菌進行檢測。在常規PCR的基礎上宋東曉[3]建立了檢測食品中沙門氏菌的新的PCR方法——多重PCR。此外其他新的PCR技術也運用於食品中沙門氏菌的檢測，鍾偉軍[4]通過對熒光定量PCR反應體系和反應條件的摸索,建立了檢測沙門氏菌的核酸熒光定量PCR方法，此研究為食品中沙門氏菌快速檢測試劑盒的研製打下了良好的基礎。
2.2核酸探針技術
核酸探針技術是根據核苷酸鹼基互補的原理,在已變異的DNA樣品中加入用同位素等標記的DNA特異片段，在一定條件下兩片段進行雜交從而達到檢測DNA的目的。此技術不僅簡便、快速而且敏感性高、特異性強，已用於食品中沙門氏菌的檢測。Almeida等[5]通過建立一種新穎的肽核酸探針結合熒光原位雜交方法對血液、糞便、水以及嬰兒奶粉樣品中沙門氏菌進行了檢測，准確度高達 100%。
2.3基因晶元技術
基因晶元技術是利用已知核酸序列的探針與靶核苷酸序列雜交，然後通過信號檢測對其進行定性與定量分析，在沙門氏菌等各種致病菌的分析檢測中有很好的應用前景。饒寶等[6]通過建立檢測致病菌的基因晶元檢測方法，設計了通用引物和特異性探針: 沙門氏菌探針、大腸桿菌探針和金黃色葡萄球菌探針,實現了同時檢測並區分沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的目的。祝儒剛等[7]運用多重 PCR 結合基因晶元技術建立了檢測肉及肉製品中的大腸埃希氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌和單核細胞增生李斯特菌等5種食源性致病菌的快速檢驗方法。
2.4噬菌體裂解技術
噬菌體有特異性裂解細菌的作用。張碧波等學者利用此技術進行沙門氏菌
快速檢測，結果和其他學者相同，據此得出特異性噬菌體可以檢測出沙門氏菌，此法方便可行。姜琴等[8]利用噬菌體裂解對150份食品樣品進行快速檢測，結果說明腸桿菌科噬菌體組合對培養10h的沙門氏菌敏感性和特異性較高，這對實現沙門氏菌實時、快速而准確的檢測有重要意義。
2.5環介導等溫擴增技術（LAMP）
環介導等溫擴增技術是2000年Notomi等開發的一種新的恆溫核酸擴增方法,此方法的特點是特異性強、靈敏度高且簡單、快速,適合對大規模樣品的快速檢測[9]。李佳桐[10]通過實驗建立了沙門氏菌的LAMP檢測方法,並將此方法與常規PCR進行比較,結果顯示：LAMP方法對沙門氏菌的檢測恆溫65℃下只需要40min,只擴增沙門氏菌,不會擴增其他革蘭氏陰性菌,最低可檢出濃度10cfu/mL,比常規PCR的最低檢出濃度高1個數量級,通過添加熒光染料SYBR Green Ⅰ,能夠快速簡便的觀察檢測出綠色的陽性結果十分明顯的區別於橙色的陰性結果。
3、免疫學方法
3.1酶聯免疫吸附技術
酶聯免疫吸附法簡稱 ELISA， ,此技術敏感性高 ,不需特殊設備 ,結果觀察簡便，早在1977年就有報道將酶聯免疫吸附法用於食品中沙門氏菌的檢測。伍燕華等[11]設計捕獲抗體和檢測抗體，建立快速檢測沙門氏菌雙抗夾心ELISA方法對食品中的沙門氏菌進行檢測。張帥等[12]建立雙抗夾心ELISA體系，檢測模擬污染肉樣中沙門氏菌,其檢測限為800CFU/g，等均並與其他血清型沙門氏菌、單增李斯特菌等菌均無交叉反應,特異性良好。
3.2免疫熒游標記技術
免疫熒游標記技術是根據抗原抗體的特異性反應，將熒光素標記在已知抗原(或抗體)上,與特異抗體(或抗原)結合後產生熒光，可用來定位抗原或抗體、並通過定量分析，確定測定含量。葉明強[13]基於納米免疫磁珠富集,免疫量子點標記,建立了一種食品中沙門氏菌的含量進行快速檢測的方法，研究出了一種新型的免疫熒光食源性致病菌檢測技術。
3.3斑點免疫金滲濾法
免疫膠體金技術是以膠體金作為標記物結合免疫原理的一種應用於抗原抗體的新型技術，該技術運用最廣泛的就是斑點免疫金滲濾法（DIGFA）。孔繁德等及曹春梅等都利用此技術對沙門氏菌的快速檢測進行了研究，曹春梅等[14]是利用斑點免疫金滲濾法對沙門氏菌O9抗原進行了研究，結果表明此法簡單、快速，適合推廣運用；孔繁德等[15]是通過建立直接檢測沙門氏菌的斑點免疫金滲濾法檢測試紙盒對該菌進行了研究。
3.4免疫磁性分離技術
免疫磁珠分離技術是將特定病原體的單抗或多抗與磁珠微球偶聯，並通過抗原抗體反應形成磁珠，在外加磁場作用下磁珠會發生定向移動，從而達到分離目標病原體的作用。食品樣品中致病菌含量很少，常規的方法是很難從中分離出來的，藉助免疫磁性分離技術可以達到快速分離的目的。王海明等[16]應用磁免疫技術建立快速檢測食源性沙門氏菌的方法，結果表明此方法能對食品基質中的目標菌進行快速有效的富集,其檢測限<10cfu/25g,檢測周期約為40小時。胡霏[17]也通過實驗針對鼠傷寒沙門氏菌建立免疫磁分離技術結合熒光層析技術的快速檢測方法。
4、生物感測器技術
生物感測器是利用一些生物活性物質如酶 、多酶體系 、抗體等做為敏感器件，然後配以適當的信號傳導器所構成的分析檢測的工具。我國學者已採用此法對沙門氏菌的抗原、抗體的免疫吸附進行檢測，並已用於快速檢測食品中致病的沙門氏菌，而僅需 1h 完成，達到了快速的檢測目的。寧毅[18]在對碳納米管性質研究的基礎上,結合分子探針構建了碳納米管生物感測器，並將其用於沙門氏菌的檢測，結果顯示所構建的感測器靈敏度高、特異性強、穩定性好。
5、電阻抗技術
電阻抗法是近年發展起來的一項生物學技術，因為具有檢測速度快、靈敏度高、准確性好等優點，目前此法已用於食品中沙門氏菌檢測檢驗並已通過美國公職分析化學協會(AOAC)認可。陳廣全等[19]建立了電阻抗法快速檢測食品中沙門氏菌的方法，並將其與常規培養法進行比較，對食品中的沙門氏菌屬進行檢測,結果表明電阻抗法比傳統培養法更加快速、可靠。
6、總結
綜上所述，沙門氏菌檢驗技術正從傳統的培養方法向分子檢測方法改進，並向儀器化、標准化、自動化方向發展，並且食品安全、致病菌等問題對人類健康以及生活環境都造成了嚴重威脅，加強沙門氏菌檢測勢在必行。目前沙門氏菌快速檢測技術大多具有檢測迅速、靈敏度高、特異性強等特點，此外這些方法還具有各自的優點和局限性，在未來發展過程中需要我們不斷改進和創新，建立更成熟可靠、方便快捷的沙門氏菌快速檢測技術。

⑽ 單克隆抗體制備中專一抗體檢測陽性什麼意思

檢測陽性，就是能產生特定抗體的雜交瘤細胞。
雜交瘤陽性克隆的篩選與克隆化在HAT培養基中生長的雜交瘤細胞，只有少數是分泌預定特異性單克隆抗體的細胞，因此，必須進行篩選和克隆化。通常採用有限稀釋法進行雜交瘤細胞的克隆化培養。採用靈敏、快速、特異的免疫學方法，篩選出能產生所需單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞，並進行克隆擴增。經過全面鑒定其所分泌單克隆抗體的免疫球蛋白類型、亞類、特異性、親和力、識別抗原的表位及其分子量後，及時進行凍存。