傳統培養檢測方法

① 單細胞培養的方法有哪些各有什麼特點

1.轉瓶培養
這個比較老的工藝，在逐步淘汰，不過投資少，技術含量低，人員經少量培訓就可以操作。
2.懸浮培養
非貼壁依賴性細胞的一種培養方式。
細胞懸浮於培養基中生長或維持。某些貼壁依賴性細胞經過適應和選擇也可用此方法培養。增加懸浮培養規模相對比較簡單，只要增加體積就可以子。深度超過5mm，需要攪動培養基，超過10cm，還需要深層通入CO2和空氣，以保證足夠的氣體交換。
通過振盪或轉動裝置使細胞始終處於分散懸浮於培養液內的培養方法。
利用固體瓊脂培養基對植物的離體組織進行培養的方法在植物遺傳實驗中已經得到廣泛的應用。但這種方法在某些方面還存在一些缺點，比如在培養過程中，植物的愈傷組織在生長過程中的營養成分、植物組織產生的代謝物質呈現一個梯度分布，而且瓊脂本身也有一些不明的物質成分可能對培養物產生影響，從而導致植物組織生長發育過程中代謝的改變而利用液體培養基則可以克服這一缺點，當植物的組織在液體培養基中生長時，我們可以通過薄層震盪培養或向培養基中通氣用以改善培養基中氧氣的供應。植物細胞的懸浮培養是指將植物細胞或較小的細胞團懸浮在液體培養基中進行培養，在培養過程中能夠保持良好的分散狀態。這些小的細胞聚合體通常來自植物的愈傷組織。
一般的操作過程是把未分化的愈傷組織轉移到液體培養基中進行培養。在培養過程中不斷進行旋轉震盪，一般可用100～120 r/min 的速度進行。由於液體培養基的旋轉和震盪，使得愈傷組織上分裂的細胞不斷游離下來。在液體培養基中的培養物是混雜的，既有游離的單個細胞，也有較大的細胞團塊，還有接種物的死細胞殘渣。
在液體懸浮培養過程中應注意及時進行細胞繼代培養，因為當培養物生長到一定時期將進入分裂的靜止期。對於多數懸浮培養物來說，細胞在培養到第18～25d 時達到最大的密度，此時應進行第一次繼代培養。在繼代培養時，應將較大的細胞團塊和接種物殘渣除去。若從植物器官或組織開始建立細胞懸浮培養體系，就包括愈傷組織的誘導、繼代培養、單細胞分離和懸浮培養。目前這項技術已經廣泛應用於細胞的形態、生理、遺傳、凋亡等研究工作，特別是為基因工程在植物細胞水平上的操作提供了理想的材料和途徑。經過轉化的植物細胞再經過誘導分化形成植株，即可獲得攜帶有目標基因的個體。

② ccd在線檢測與傳統檢測方法相比有哪些優點和缺點

傳統檢測：人工目測，依靠人工肉眼識別進行判斷比較，最終判定產品的優劣，完成產品的質檢審核環節。

CCD在線檢測：以自動化機械代替人工，對產品進行系統的分析判斷，剔除殘次品，最終完成產品檢測的質檢環節。

CCD在線檢測相較傳統檢測方法的優點：

1. 智能高效：自動化檢測可進行快速識別檢測，相較人工檢測，速度會快得多，可有效提高檢測效率，縮短產品出貨周期，降低人工成本；

2. 標准統一：CCD檢測是系統對被檢物進行統一標准化的判斷識別，一致度高，確保每個產品都是標准統一規范的判定模式，產品的標准輸出可以得到有效保障；

3. 高速精準：智能檢測可進行飛拍識別，並可對肉眼無法判斷的微小精密物件進行識別檢測，在提高效率的同時，更提高了檢測的精密度；

4. 代替人工進行高危作業：在一些高危行業，例如高溫，易爆，寒冷等惡劣的工作環境，用自動化機械檢測，可有效代替人工作業，避免因突發情況對人體造成傷害；

5. 可保持長時間規范運作：相較人工，機器化的檢測可保持長時間規范化產出，不會因為疲勞、瞌睡、注意力等人為因素導致誤判、漏判的現象。

CCD在線檢測相較傳統檢測方法的缺點：

1. 靈活度低：沒有人工靈活，一些未出現過的缺陷不被系統識別，可能出現誤判的情況；

2. 可識別的產品較為單一：CCD檢測是根據演算法進行產品識別的，當檢測產品不統一，多樣復雜且形狀大小不一，或者更為復雜多變的情況下，難以像人工檢測一樣隨機應變；

3. 識別局限性：類似編織面料的孔徑大小檢測，有伸縮彈力，產品的擺放狀態難以實現標准化檢測，人為更容易判斷。

③ 致病菌感染的微生物學檢查基本程序是怎麼樣的

病原微生物種類繁多，變異迅速，快速鑒定病原微生物的檢驗技術也在不斷發展前進著。目前，應用比較廣泛的病原微生物檢測方法主要有直接塗片鏡檢、分離培養、生化反應、血清學反應、核酸分子雜交、基因晶元、多聚酶鏈反應等，該文對這些檢測技術進展做一綜述。 對人和動物具有致病性的微生物稱為病原微生物，又稱病原體，有病毒、細菌、立克次體、支原體、衣原體、螺旋體、真菌、放線菌、朊粒等。這些病原微生物可引起感染、過敏、腫瘤、痴獃等疾病，也是危害食品安全的主要因素之一。近年來出現的SARS、高致病性禽流感、西尼羅病毒感染等疾病的傳染性極強，往往造成世界性大流行，因此對病原體的檢測必須做到快速、准確。常規病原學檢測方法操作繁瑣，檢測周期長，而且對操作人員技術水平要求比較高。隨著醫學微生物學研究技術的不斷發展，病原學診斷已不再局限於病原體水平，深入到分子水平、基因水平的檢測手段不斷出現並被應用於臨床和實驗室 J。核酸分子雜交技術、PCR技術、基因晶元技術等檢測方法，自動化程度高，快速省時、無污染、結果精確，可以准確靈敏地鑒定病原微生物。1 傳統的病原微生物的檢測方法傳統的病原微生物學實驗室檢查以染色、培養、生化鑒定等為主，將標本直接塗片染色鏡檢和接種在培養基上進行分離培養是對細菌或真菌感染性疾病進行病原學診斷的常用方法。1．1 直接塗片鏡檢病原微生物體形體積微小，大多無色半透明狀，將其染色後可藉助顯微鏡觀察其大小、形態、排列等。直接塗片染色鏡檢簡便快速，對那些具有特殊形態的病原微生物感染仍然適用，例如淋球菌感染、結核分枝桿菌、螺旋體感染等的早期初步診斷。直接塗片鏡檢不需要特殊的儀器和設備，在基層實驗室里仍然是十分重要的病原微生物檢測手段。1．2 分離培養與生化反應 分離培養主要用於臨床標本(如血液、痰、糞便等)或培養物中有多種細菌時對某一種細菌的分離。細菌的生長繁殖需要一定時間，檢測周期較長，不能同時處理批量樣本。為解決這一問題，各種自動化培養和鑒定系統不斷產生，傳統鑒定方法也在逐步改進，大大加快了檢驗速度。例如Microscan WalLCAway全自動微生物分析儀，可同時做細菌鑒定和葯敏試驗，檢驗500多個菌種。苛養菌如肺炎鏈球菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血桿菌等對營養要求比較高，常規培養陽性率低。雍剛 等將不要同比例的葡萄糖、玉米澱粉、生長因子、酵母粉、氨基酸等特殊增菌劑加入到巧克力培養基中製成了新型淋病奈瑟菌培養基，大大提高了淋病奈瑟菌的分離培養率。蘇盛通等在營養瓊脂中加人了中葯紅棗、赤小豆培養甲型鏈球菌、乙型鏈球菌、肺炎鏈球菌等細菌，生長指數明顯高於血平板。1．3 組織細胞培養 活組織細胞培養適於專營活組織細胞內生存的病原體，包括病毒、立克次體、衣原體等。不同病原體敏感的組織細胞是不一樣的，將活細胞從病原體敏感的動物組織中取出在體外進行原代培養或用病原體敏感細胞系進行傳代培養，再將病原體接種於相應的組織細胞中後，病原體可在其中繁殖增長，引起特異性的細胞病變效應。也可以將病原體直接接種於敏感動物體內，引起相應組織器官出現特異的病理學改變。往往可以根據這些特異的病變對病原體進行鑒定。2 血清學與免疫學檢測血清學檢測是通過已知的抗體或抗原來檢測病原體的抗原或抗體從而對病原體進行快速鑒定的技術，簡化了鑒定步驟，常用的方法包括血清凝集技術、乳膠凝集實驗、熒光抗體檢測技術、協同凝集試驗、酶聯免疫測試技術等。酶聯免疫技術的應用大大提高了血清學檢測的敏感性和特異性，不僅可檢測樣本中病原體抗原，也可檢測機體的抗體成分。幽門螺奸菌在我國人群感染率高達50％ ～80％ ，應用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測唾液中抗HP抗體來診斷HP感染，其結果滿意。乙型肝炎病毒(HBV)在我國人群中感染率極高，ELISA應用於乙型肝炎病人早期血清學診斷的效果最為明顯。臨床上致病菌往往和非致病菌混合在一起，如何從這些細菌中分離出目標菌是關鍵。免疫磁珠分離技術(IMBS)是近年來發展起來的在微生物檢測領域中一種新技術。其基本原理是將特定病原體的單抗或多抗或二抗偶聯到磁珠微球上，通過抗原抗體反應形成磁珠一目標病原體復合物或磁珠一一抗一目標病原體復合物，在外部磁場磁力的作用下，將目標病原體分離出來。目前已經開發出了針對各種病原體的免疫磁珠，如大腸埃希菌、李斯特菌、白色念珠菌、軍團菌等，廣泛應用到各級科研和實驗室 。經IMBS分離出的白色念珠菌可直接在顯微鏡下檢測，檢測時間縮短至4 h。IM—Bs還可以和其它檢測技術聯合來檢測病原菌，免疫磁珠分離得到的目標菌可繼續用於分離培養使大腸埃希菌0157最低檢測限由200 cfu·g 提高到2 cfu·g～；IMBS結合聚合酶鏈反應(IMBS—PCR)可對培養條件比較特殊的細菌如苛養菌、厭氧菌進行快速檢測，肉類中的產毒素型產氣莢膜梭菌經IMBS．PC

④ 腸炎沙門氏菌的檢測方法

自19世紀後期，沙門氏菌首次被鑒定為人類的一種病原以來，檢測方法學都是建立在採取感染病人的糞便或血液作為臨床病料的基礎上。此後的60年間，用於從食品中分離沙門氏菌的方法實質上與那些用於臨床病料的方法是相同的。但至少有三個因素限制了用於臨床病料的方法應用在食品分析上。第一，通常，沙門氏菌的含量水平在污染食品中比有感染病人的病料中要低很多；第二，食品本身的性質會干擾病原的檢測，例如，某些食品中固有菌群可能處在一個很高的水平，從而影響特定細菌的選擇性分離和鑒定；第三，與臨床病料不同的是，經過加工的食品，由於加熱、乾燥、高含鹽量、酸和冷凍等因素的作用，其中的沙門氏菌受到了尚不致命的損傷或稱「致傷」。這就形成了一個具有不同生長特性的細菌群。這種現象對那些希望從食物樣品中分離出沙門氏菌的食品分析家來說有很大影響，因為在選擇培養基上直接培養「致傷」的沙門氏菌通常是以細菌死亡和試驗失敗而告終。為克服這些困難，人們建立了一種簡單的微生物增殖步驟，專門針對以食品為傳播載體的病原。雖然這些方法本身證明是可靠的，但卻很費力、耗時，需要4～7天才能完成。因此，在需要及時、快速評價食品中微生物的安全性時，通常不被採用。隨著DNA和抗體技術的發展，近10～15年間發展了無數改進的方法，其中許多可以在48h內檢出沙門氏菌，這些方法通稱為快速檢測。
1、傳統的培養方法
用於沙門氏菌分析的傳統方法是食物樣品分步增菌，以增加病原的可檢出率，這種培養方法總體可分4個不同階段或步驟。第一步(預增菌)，將樣品加到一種高營養、無選擇性的培養基中，溫度37℃，使那些「致傷」的細菌復甦及使所有微生物生長。雖然緩沖腖水被建議常規使用(由於其可保持溶液pH值穩定)，但對培養基的選擇仍存有爭論。第二，是選擇性增菌步驟，它使沙門氏菌生長而使肉湯中同時存在的微生物數量減少，與預增菌培養基相似，對選擇性培養基的選擇，也存在許多不同的觀點。目前應用的主要有如下3種類型：連四硫基鹽肉湯(Tetrathionatebroth)、硒酸鹽胱氨酸肉湯(Selenitecystinebroth)和RV(Rappaport-Vassiliadis)培養基。由於沒有任何一種培養基可以全面地保持所有食品基質或各種沙門氏菌血清型，所以，較適當的做法就是使用兩種培養基平行地進行試驗。第三步是分離步驟，即選擇性培養物在含一種或多種抑制非沙門氏菌生長制劑的瓊脂平板上劃線培養，然後對平板上肉眼可見的特徵性菌落進行確認，並對該菌落分離物進行一系列生化和血清學檢測，以作出鑒定。傳統沙門氏菌檢測法全過程需時至少4～7天，才能得出明確的診斷結果。
2、以抗體為基礎的檢測方法
利用抗原-抗體反應的顯著特異性，來進行細菌的鑒別和血清學定型，已有半個多世紀的歷史。細菌菌體或鞭毛抗原的特異性抗體的存在，使得人們可以建立一些快速方法來檢測以食品為載體的病原。已經建立的沙門氏菌免疫學檢測方法有許多種，大致可分為以酶標抗體(ELISA)，熒光抗體染色(免疫熒光法)，同位素標記抗體(放射免疫試驗)為基礎的方法及其它多種以抗體為基礎，利用乳膠凝集、免疫感測器、免疫擴散及免疫色譜技術的方法。但常規中最廣泛採用的是以雙位點ELISA技術即夾心ELISA為基礎的方法。此法改進後用有放射活性的同位素替代標記抗體，概括地說，是指以固定在固體基質上的「捕捉」抗體來捕捉目標抗原，經洗滌除去未結合的成分，加入第二種酶標抗體，此者結合在捕捉到的抗原的不同位點上，第二次洗滌後加入酶作用基質，並令其與顏色成分反應，然後用分光光度法即很容易檢測到目標抗原。採用微量滴定板作為固態基質使反應形式標准化，並促成其自動化。
黎兆滾等人首次在國內口岸系統應用微量板ELISA法(Salmonelletest1)對進出口動物產品(魚粉、肉骨粉等)進行沙門氏菌檢測。該法採用預先包被了沙門氏菌(A-E群)單克隆抗體的微量板，加入經增菌處理的樣品，反應後再加入一定的指示劑，作用畢後用酶標儀測定OD值來判定結果。食物樣品經適當的增菌處理，也可用此法進行沙門氏菌檢測。ELISA法檢出沙門氏菌的極限范圍在105～106個細胞/ml，因此，要得出可靠的結果，食物樣品首先必需進行預增菌、選擇性增菌，通常還要在含有D-甘露糖的肉湯(M肉湯)中進行後增菌，以促進鞭毛發育。總的來說，標準的ELISA法樣品的制備，約需要經過40～48h的孵育才能完成。黎兆滾等人的微量板ELISA法(Salmonellatest1)樣品制備過程分三步，共耗時24h：①選用營養肉湯進行預增菌(6h)，使「致傷」、冷凍的沙門氏菌復甦。②使用選擇性培養基RV進行增菌(14h)，使沙門氏菌大量繁殖，同時抑制其它雜菌生長。③使用營養肉湯(蛋白腖水)進行後增菌(4h)，使沙門氏菌的數量大大增加。比上述標準的ELISA法樣品制備過程縮短了一半的時間。ELISA方法本身，則僅需要大約2h而已(其中30min是操作時間，90min是孵育時間)。相比之下，黎兆滾等人的方法可在27h內完成，比上述方法縮短了一半的時間，頗值得推廣應用。最新式的沙門氏菌免疫學檢測法，利用經特異性抗體敏化的免疫色譜卡片為基礎。幾滴樣品加到卡片上，結果可以直接用肉眼讀出。免疫色譜卡片極易操作，且由於無需要特殊設備，很適合小型實驗室使用。盡管卡片檢測法與ELISA法一樣需要對樣品進行增菌處理，但它(卡片法)本身通常需時不超過10min，如果採用黎兆滾等人的樣品制備法，則可使操作時間更為縮短。
3、以核酸為基礎的方法
細胞核酸DNA和RNA是唯一一類可以攜帶信息的大分子。由於所有的細胞都含有這種分子，可以利用它作為檢測的標靶。標靶通常是一個特異性核酸序列，它可通過以補體核酸分子作為探針來檢出。與免疫學方法相似，探針也需要加附適當的標記，如放射性同位素、酶或發光的標識物。Fitts等人在食品沙門氏菌檢測中引入了第一代DAN—RNA雜交技術，此法應用的探針含有用放射性同位素標記的傷寒沙門氏菌DNA片段，其敏感性高，經大約48h的增菌步驟後，檢測極限可達108個細菌/ml，但由於要使用放射性同位素，只能在專門的實驗室應用，此方法的優點都被抵消了。為此，以核酸雜交為基礎的第二代技術—比色計目前已發展起來。這種方法依賴於沙門氏菌核糖體RNA(rRNA)—核糖體發育過程中儲存的核酸成分的檢測。核糖體是細胞蛋白質合成器的一部分，每個細菌細胞中存在5000～20000個復制體，而相比之下染色體DNA復制體僅2～10個。這種天然富含rRNA標靶序列的情況使得用無輻射計檢測成為可能，同時又保持了與放射性同位素方法相當或更高的敏感性。其另一優點是由於rRNA為單鏈(而DNA為雙鏈)，雜交前無需經過變性步驟。要得到陽性結果，此法需要105個靶細胞/ml，因此對沙門氏菌檢測來說，需要進行預增菌和選擇性增菌，總共約50h。rRNA探針法比沙門氏菌ELISA法更耗時，但二者成本相近。食品細菌檢測法的最新進展是在化學擴增體系方面的發展，即聚合酶鏈反應(PCR)，用該體系可對制備好的樣品進行細菌DNA擴增，以便更易於用諸如凝膠電泳法或比色型ELISA法檢測。用於檢測沙門氏菌和其它以食物為載體的病原的PCR方法業已建立，其中一些方法顯示了極好的敏感性。但該法較難自動化，且必需經選擇性增菌以稀釋可能幹擾檢測反應的某些成分。一個完整的以PCR為基礎的方法，需要2天才能完成，很大程度上抵銷了其高敏感性的優點，但這種方法對那些含沙門氏菌較少或沙門氏菌「致傷」嚴重難以復甦而仍保有沙門氏菌rRNA的樣品尤其有效。

⑤ 進行菌種質量檢測的常用方法有哪些

1、直接觀察。對引進菌種觀察包裝是否合乎要求，棉塞有無松動，試管、玻璃瓶和塑料袋有無破損，棉塞和管、瓶或袋中有無病蟲侵染，菌絲色澤是否正常，有無發生變化。然後在瓶塞邊作深吸氣，聞其是否具備特有的香味。原種和栽培種可取出小塊菌絲體觀察其顏色和均勻度，並用手指捏料塊檢驗含水量是否符合標准。

2、顯微鏡檢驗。若菌絲透明，呈分枝狀、有橫隔、鎖狀聯合明顯，再加上具有不同品種固有的特徵，則可認為是合格菌種。

3、觀察菌絲長速。將供測的菌種接入新配製的試管斜面培養基上，置於最適宜的溫、濕度條件下進行培養，如果菌絲生長迅速、整齊濃密、健壯有力，則表明是優良菌種，否則即是劣質菌種。

優質菌種的標准

食用菌的種類雖然繁多，但從總體上看，每一個優良菌種均有＂純、正、壯、潤、香＂的共性。其標準是：

1、菌種的純度要高，不能有雜菌感染，也不能有其他類似的菌種。

2、菌絲色澤要純正，多數種類的菌絲應純白、有光澤，原種、栽培種菌絲應連結成塊，無老化變色現象。

3、菌絲要粗壯，分枝多而密，接種到培養基吃料塊，生長旺盛。

4、培養體要濕潤，與試管（瓶）壁緊貼而不幹縮，含水適宜。

5、具有每品種特有的清香味，不可有霉、腐氣味。

⑥ 單細胞的培養方法有哪些

單細胞培養常見模型： ①在培養碟中原位單細胞微吸吮捕獲、沉積分選培養模型傳統的熒光活化細胞分選方法（FACS）採用流式細胞術用來分選細胞，是分子基礎分選中普遍使用的方法。這種方法只能檢測具有熒光活性的細胞，不但細胞存活率低、純度低，而且極易破壞細胞組織。微吸吮單細胞分選培養模型是與倒置顯微鏡配合使用的，用於細胞篩選、提取、沉積的。 ◇ 可直接從培養皿中進行細胞分選 ◇ 分離粘結活細胞的細胞亞群，分離熒光或者冷游標記 ◇ 無標記的和熒光的細胞都可通過軟體進行自動識別 ◇ 可確保細胞分離後活力，並且可培養 ◇ 分選熒光分子探針標記的特定細胞 ◇ 單細胞收集進行進一步培養、克隆，RNA 或者蛋白質制備 ◇ 免疫制備，進行目標細胞分類 ◇ 可對各種粘結細胞進行分類 ◇ 細胞篩選前的細胞培養 ◇ 一般的分選過程只需幾分鍾就可完成 ◇ 使用安裝在顯微鏡上的熒光濾片可實現多通道監測 ◇ 分選速度為1Cell/秒每一個循環可篩選1~1000個細胞 ②單細胞培養分析跟蹤板模型 ③使用把顯微鏡升級改造為納米激光鑷捕獲操縱單細胞模型這種模型很簡單，在已有顯微鏡上加上納米激光器或晶元就可以了 ④使用活態單細胞激光拉曼光譜無損測定鑒別模型活態單細胞激光拉曼光譜無損測定鑒別模式可在無任何標記情況下對活細胞進行三維掃描測定其分子分布，更具優越性。活態單細胞激光拉曼光譜無損測定鑒別模式為醫師，葯師和生物學家提供了利用拉曼光譜的便利的方式，不僅可以識別各種基團，還可以對化合物進行高精確度分析，且對活細胞不需要使用生化標記物，熒游標記物或者抗體，對活細胞絕對安全。

⑦ 病原微生物中細菌常見檢測方法有哪些

1、快速測試片技術法

快速測試片是指以紙片、紙膜、膠片等作為培養基載體，將特定的培養基和顯色物質附著在上面，通過微生物在上面的生長、顯色來測定食品中微生物的方法。

細菌總數檢測紙片的研製始於 20 世紀 80 年代，其主要優點是簡便、實用、經濟、操作性強。近年來以濾紙和美國某公司的 Petrifilm 為載體的測試片已開始被廣泛應用。

2、生物電化學方法

生物電化學方法是指通過電極測定微生物產生或消耗的電荷，從而提供分析信號的方法。微生物在滋生代謝過程中，培養基的電化學性質如電流、電位、電阻和電導等會發生變化，所以可以通過檢測分析這些電化學參量的變化來實現對微生物的快速測定。

常見的有：阻抗分析法、電位分析法、電流分析法等。生物電化學方法具有測量快速、直觀、操作簡單、測量設備成本低和信號的可控性等特點。

3、微菌落技術

微菌落是指細菌生長繁殖早期在固相載體上所形成的只能藉助於顯微鏡觀察的微小菌落。微菌落技術具有快速、經濟、實用的特點，其研究始於 20 世紀50年代，定量測定技術從 20 世紀 70 年代開始，國外已有報道將該法應用於水、食品中細菌總數的快速檢測。

4、氣相色譜法

氣相色譜應用到微生物的檢測中，主要是依據不同微生物的化學組成或其產生的代謝產物各異，利用上述色譜檢測可直接分析各種體液中的細菌代謝產物、細胞中的脂肪酸、蛋白質、氨基酸、多肽、多糖等，以確定病原微生物的特異性化學標志成分，協助病原診斷和檢測。

5、高效液相色譜法

利用高效液相色譜檢測可分析各種體液中的細菌代謝產物、病原微生物等，以確定病原微生物的特異性化學標志成分，協助病原診斷和檢測。

⑧ 大腸桿菌的檢測方法

多管發酵法。

多管發酵法是一種檢測水體中大腸桿菌的傳統方法，這種方法是在44.5℃的含有熒光底物的培養基上連續培養24h，而後能產生分解熒光底物——葡萄糖醛酸酶，從而釋放出熒光產物，進而使培養基在紫外光照射下產生特徵熒光。此方法可被用來對原樣品中的菌落數作統計學估計。

在單料或雙料乳糖膽鹽發酵管內發酵，分離培養試驗，利用伊紅美藍培養皿分離，接著是在乳糖發酵管中進行二次發酵，最後通過芽孢染色、革蘭氏染色、顯微鏡觀察等來完成。多管發酵法對試驗條件要求不高，成本低，但是檢測時間較長，容易受其他條件干擾，進而影響到測定結果的精確度。

(8)傳統培養檢測方法擴展閱讀：

注意事項：

1、檢樣時注意無菌操作。

2、稀釋時採用的稀釋液可以用磷酸鹽緩沖液或生理鹽水，接種時可採用九管法，設置三個梯度，分別為0.1g/mL、0.01g/mL、0.001g/mL，每一個稀釋度的試管應充分混勻。

3、每次實驗需要有陰性對照。

4、使用小倒管培養基配製時，為排凈氣泡，滅菌時不要把試管的蓋子蓋的太緊，滅菌後注意觀察一下倒管中的氣體是否排完全、

5、高壓滅菌後等高壓滅菌鍋的壓力表達到0，取出培養基放到冰箱冷卻，效果會比較好。

⑨ 如何將分子生物學的原理應用於食品科學

基因晶元(gene chip) 技術是20 世紀90 年代興起的前沿生物技術,它可以將生物學中許多不連續的分析過程,移植到固相的介質晶元上,並使其連續化和微型化。這對傳統生物技術,如檢測、DNA 雜交、分型和測序技術將是重大的創新和飛躍。由於它橫跨生命信息、生物物理等眾多的研究領域,涉及生命科學、化學、計算機學、生物信息學等諸多自然學科,故已成為當今多學科交叉、綜
合的研究熱點。基因晶元技術雖然僅有幾年的發展歷史,但在生物學的諸多領域已顯示出巨大的潛力和誘人的前景。許多人認為基因晶元技術可以與單克隆抗體、PCR 技術、重組DNA 技術相媲美。針對DNA 分析的晶元又稱DNA 晶元或基因
晶元, 根據核酸分析過程中的3 個主要步驟,DNA 晶元分為3 類:用於核酸樣品制備的DNA晶元、用於核酸片段擴增反應的DNA 晶元和用於基因檢測的DNA 晶元,後者又稱微陣列,即DNA晶元。本文對基因晶元在食品致病菌檢測中的應用作一介紹。
1 基因晶元技術檢測食品致病菌的技術原理
基因晶元的基本原理是將各種基因寡核苷酸點樣於晶元表面,微生物樣品DNA 經PCR 擴增後制備熒游標記探針,然後再與晶元上寡核苷酸點雜交,最後通過掃描儀定量和分析熒光分布模式來確定檢測樣品是否存在某些特定微生物 。
2 基因晶元技術在食品致病菌檢測中的應用
2. 1 致病菌在食品中的危害
食品在生產、運輸、銷售過程中容易受致病性微生物污染,因此食品衛生檢驗中的一個十分重要的內容是及時准確地檢測出食品中的致病性微生物。這些致病性微生物的存在會給消費者的健康帶來極大的危害。
2. 2 常規方法檢測食品中致病菌的不足
目前,國內外對食品微生物中病菌的檢測包括常見的致病菌,如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀菌、沙門氏菌等,常規檢測方法主要有傳統生化培養檢測法、探針雜交、PCR 法。傳統方法是採用細菌培養、生化鑒定與血清分型,由於操作簡單、經濟而被廣泛採用,但檢測時限長(一般要1～2 周) ,效率低、靈敏度不高。探針雜交和PCR技術准確、靈敏、快速( PCR 2～4 h ,探針雜交需要的時間稍長一些) ,彌補了傳統方法的不足,國內外關於這2 種技術在醫學微生物檢測方面的研究報道很多。但PCR 法由於假陽性影響及檢測成本昂貴而在應用中受到限制;探針雜交操作繁雜、檢測時限長,因此這兩種技術並沒有真正在實際檢測中得到大量應用。可見常規檢測方法檢測食品中的致病菌已經不能滿足快速檢測的要求,難以適應飛速發展的現代食品生產和流通領域,因此為了確保食品的安全性,開發快速檢測致病菌的方法,准確地檢測食品中的致病菌具有十分重要的意義。
2. 3 基因晶元技術檢測食品中的常見致病菌
1996 年,世界上第一塊商業化DNA 晶元的問世,標志著基因晶元技術進入廣泛研究和應用的階段[2 ] ,該技術具有傳統的檢測方法不可比擬的優越性3 ] : ①基因晶元可以對食品中的致病菌
實行高通量和並行檢測,一次實驗即可得出全部
檢測結果; ②操作簡便快速,整個檢測在幾小時內
即可得出檢測結果; ③特異性強,敏感性高。隨著
基因晶元檢測食品中致病菌技術的不斷發展和完
善,將廣泛應用於出入境、食品安全指標、突發事
件等致病菌的檢測,食品安全必將得到進一步保
障,並且將對整個食品領域產生深遠的影響。
東北農業大學動物醫學院的立廣興制備了地
高辛標記的空腸彎麴菌探針,北京醫院臨床檢驗
中心的楊華衛等研製了2 種以生物素標記對結
核分支桿菌特異性的DNA 探針[4 ] ; 李君文等[5 ]
應用基因晶元檢測水中常見致病菌:可對水中致
病菌實行高通量、並行檢測,一次實驗即可得出全
部結果;靳連群等[6 ]利用基因晶元技術檢測腸道
中的致病菌。結果顯示制備的基因晶元能夠檢測
出沙門氏菌、志賀菌、葡萄球菌等。對於未知菌落
利用基因晶元能夠在3 h 完成對未知菌屬的鑒
定;南開大學王磊教授[7 ] 承擔的「致病腸道細菌
—志賀氏菌檢測基因晶元研製項目,近日取得重
大進展,該項目針對不同種志賀氏菌特異基因及
其探針已申請專利12 項。利用基因晶元檢測食
品中志賀菌的時間已由傳統檢測方法的6 d 縮短
到了幾小時。
Borucki 等[8 ]構建的混合基因組微陣列可准
確鑒別各種近緣單核增多李斯特菌分離物;
Volokhov 等[9 ]通過單管復合體擴增和基因晶元
技術檢測和鑒別6 種李斯特菌;Call 等[10 ]通過分
析E. coli O157 : H7 的Shiga 樣毒素Ⅰ,Shiga 樣
毒素Ⅱ及溶血素A ,發現基因晶元可准確檢測各
種E. coli O157 :H7 分離物。J ack[11 ]等通過設計
通用引物擴增細菌核糖體16S rRNA ,並將擴增
產物與含有探針的低密度晶元進行雜交,從而直
接檢測鑒定微生物。Wilson 等[12 ]採用病原體診
斷區基因擴增和20 寡核苷酸藻紅素標記探針,開
發出一套多病原體識別微陣列,可以准確識別18
種致病性病毒、原核生物和真核生物。
2. 4 基因晶元技術檢測食品致病菌的程序
2. 4. 1 PCR 擴增引物及基因晶元探針設計 細
菌間16S rRNA 保守性強,在生物進化過程中比
其他基因演化得慢,被冠之以細菌分類的「化石」。
但細菌的16S rRNA 保守性又是相對的,在16S
rRNA 基因中既有序列一致的恆定區,也有序列
互不相同的可變區,恆定區和可變區交錯排列。
因此可以在16S rRNA 恆定區設計PCR 引物,用
一對引物就可以將所有致病菌的相應基因片段全
部擴增出來,可在可變區設計檢測探針並製作基
因晶元。
2. 4. 2 制備晶元 對晶元的介質表面進行氨基
化、硅烷化或二硫鍵修飾處理是基因晶元技術的
重要組成部分[13 ] 。利用基因晶元點樣儀,將引物
及探針DNA 分子點塗在經過修飾的玻片等載體
上,即製成晶元。DNA 晶元的製作有幾種不同的
方式: ①晶元外合成制備晶元,如化學噴射法和接
觸式點塗法[14 ] ; ②原位合成制備晶元,如高壓電
噴頭合成法[15 ]和光引導原位合成法[16 ] 。所用寡
核苷酸均先已合成完畢,再固定於載體上。所用寡核苷酸均是在載體上被合成與固定,使成晶元。
晶元制備好後,便可用於檢測食品中未知致病菌。
2. 4. 3 待測食品致病菌樣品處理 待測致病菌
樣品在培養後進行裂解, 提取致病菌的模板
DNA ,採用聚合酶鏈式反應(PCR) 擴增,對擴增出
來的產物進行熒游標記。再用2. 0 %瓊脂糖凝膠
電泳檢測,得到的熒游標記產物可用於雜交試驗。
2. 4. 4 雜交 將擴增後並已標記的待測致病菌
DNA 標品滴加於基因晶元上,與晶元上的特異性
DNA 進行雜交。被檢測的致病菌如果存在,其
DNA 便與晶元DNA 雜交成功,經洗滌晾乾後,進
行結果分析。
2. 4. 5 結果檢測與分析 採用晶元掃描儀,如熒
光掃描儀、共聚焦顯微鏡等進行檢測,根據熒光的
有無及強弱來確定被測致病菌是否存在。
3 基因晶元技術存在的問題及展望
基因晶元技術作為一種新技術,具有快速、准
確、靈敏等優點,又能同時平行檢測大量樣本,但
是目前還存在一些關鍵的問題亟待解決: ①目前
的基因晶元一般都採用熒游標記技術,使得基因
晶元檢測不僅需要昂貴的晶元製作系統,而且需
要昂貴的激光共聚焦掃描儀,高昂的價格嚴重限
制了這種晶元技術的普及應用; ②操作復雜、費
時,對操作人員的專業素質要求比較高,這也是限
制其普及應用的障礙之一; ③在樣品目標物放大
反應的過程中,容易造成樣品污染,也會影響到檢
測信噪比,研究人員試圖通過生物感測器吸附樣
品加以避免,並結合半導體技術、納米技術和生物
發光技術提高其靈敏度; ④生物晶元微細制備技
術以及如何提高生物晶元微陣列的密度也極大地
限制了該技術的市場需求,相信隨著這些技術進
一步完善,基因晶元技術完全可能成為21 世紀最
具活力的技術之一。
基因晶元技術在食品致病菌檢測中是一個全
新領域,國外已開始食品致病菌檢測晶元的研究,
但仍處於早期研發階段。而在國內,該領域仍處
於初步摸索階段。基因晶元技術檢測食品中致病
菌在不久的將來必將會標准化、商品化,人們可望
在一張晶元上檢測到幾乎所有致病菌,實現真正意義上致病菌檢測的技術革命。

⑩ 如何實現快速檢測及有效控制沙門氏菌

沙門氏菌(Salmonella)是一種革蘭氏陰性腸桿菌, 也是腸桿菌科中最主要的食源性致病菌。據有關資料統計由沙門氏菌引起的疾病病例在病原菌食源性疾病病例中所佔比例已超過三分之二，2007年發生的「 花生醬事件」以及 2008 年發生的「 西紅柿 事件」等[1]沙門氏菌中毒事件的發生也使得食品中沙門氏菌的檢測受到人們的普遍關注。本文主要是對食品中沙門氏菌的傳統檢測方法以及後續建立的以分子生物學、免疫學、生物感測器和電化學為基礎的快速檢測方法進行了系統的綜述，旨在為該致病菌的檢測方法的研究應用提供一定的參考。
1、 傳統的檢測方法（國標法）
目前, 我國對食品中沙門氏菌的檢測大多採用GB 4789.4-2010《食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》對食品樣品進行檢測，這種傳統的培養方法可分為前增菌、增菌、分離培養、生化試驗和血清學鑒定等步驟進行。雖然傳統培養法可靠性高，但是其操作繁瑣且耗時費力，並不能滿足食品快速檢測的要求。
2、分子生物學檢測方法
2.1聚合酶鏈反應技術
PCR技術是一項敏感性高、特異性強且快速准確的微生物檢測技術，也被許多學者用於對食品中沙門氏菌進行檢測和研究。汪琦等[2]就採用傳統培養方法 、BAX(r)方法和PCR 方法 3 種方法對沙門氏菌進行檢測。在常規PCR的基礎上宋東曉[3]建立了檢測食品中沙門氏菌的新的PCR方法——多重PCR。此外其他新的PCR技術也運用於食品中沙門氏菌的檢測，鍾偉軍[4]通過對熒光定量PCR反應體系和反應條件的摸索,建立了檢測沙門氏菌的核酸熒光定量PCR方法，此研究為食品中沙門氏菌快速檢測試劑盒的研製打下了良好的基礎。
2.2核酸探針技術
核酸探針技術是根據核苷酸鹼基互補的原理,在已變異的DNA樣品中加入用同位素等標記的DNA特異片段，在一定條件下兩片段進行雜交從而達到檢測DNA的目的。此技術不僅簡便、快速而且敏感性高、特異性強，已用於食品中沙門氏菌的檢測。Almeida等[5]通過建立一種新穎的肽核酸探針結合熒光原位雜交方法對血液、糞便、水以及嬰兒奶粉樣品中沙門氏菌進行了檢測，准確度高達 100%。
2.3基因晶元技術
基因晶元技術是利用已知核酸序列的探針與靶核苷酸序列雜交，然後通過信號檢測對其進行定性與定量分析，在沙門氏菌等各種致病菌的分析檢測中有很好的應用前景。饒寶等[6]通過建立檢測致病菌的基因晶元檢測方法，設計了通用引物和特異性探針: 沙門氏菌探針、大腸桿菌探針和金黃色葡萄球菌探針,實現了同時檢測並區分沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的目的。祝儒剛等[7]運用多重 PCR 結合基因晶元技術建立了檢測肉及肉製品中的大腸埃希氏菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌和單核細胞增生李斯特菌等5種食源性致病菌的快速檢驗方法。
2.4噬菌體裂解技術
噬菌體有特異性裂解細菌的作用。張碧波等學者利用此技術進行沙門氏菌
快速檢測，結果和其他學者相同，據此得出特異性噬菌體可以檢測出沙門氏菌，此法方便可行。姜琴等[8]利用噬菌體裂解對150份食品樣品進行快速檢測，結果說明腸桿菌科噬菌體組合對培養10h的沙門氏菌敏感性和特異性較高，這對實現沙門氏菌實時、快速而准確的檢測有重要意義。
2.5環介導等溫擴增技術（LAMP）
環介導等溫擴增技術是2000年Notomi等開發的一種新的恆溫核酸擴增方法,此方法的特點是特異性強、靈敏度高且簡單、快速,適合對大規模樣品的快速檢測[9]。李佳桐[10]通過實驗建立了沙門氏菌的LAMP檢測方法,並將此方法與常規PCR進行比較,結果顯示：LAMP方法對沙門氏菌的檢測恆溫65℃下只需要40min,只擴增沙門氏菌,不會擴增其他革蘭氏陰性菌,最低可檢出濃度10cfu/mL,比常規PCR的最低檢出濃度高1個數量級,通過添加熒光染料SYBR Green Ⅰ,能夠快速簡便的觀察檢測出綠色的陽性結果十分明顯的區別於橙色的陰性結果。
3、免疫學方法
3.1酶聯免疫吸附技術
酶聯免疫吸附法簡稱 ELISA， ,此技術敏感性高 ,不需特殊設備 ,結果觀察簡便，早在1977年就有報道將酶聯免疫吸附法用於食品中沙門氏菌的檢測。伍燕華等[11]設計捕獲抗體和檢測抗體，建立快速檢測沙門氏菌雙抗夾心ELISA方法對食品中的沙門氏菌進行檢測。張帥等[12]建立雙抗夾心ELISA體系，檢測模擬污染肉樣中沙門氏菌,其檢測限為800CFU/g，等均並與其他血清型沙門氏菌、單增李斯特菌等菌均無交叉反應,特異性良好。
3.2免疫熒游標記技術
免疫熒游標記技術是根據抗原抗體的特異性反應，將熒光素標記在已知抗原(或抗體)上,與特異抗體(或抗原)結合後產生熒光，可用來定位抗原或抗體、並通過定量分析，確定測定含量。葉明強[13]基於納米免疫磁珠富集,免疫量子點標記,建立了一種食品中沙門氏菌的含量進行快速檢測的方法，研究出了一種新型的免疫熒光食源性致病菌檢測技術。
3.3斑點免疫金滲濾法
免疫膠體金技術是以膠體金作為標記物結合免疫原理的一種應用於抗原抗體的新型技術，該技術運用最廣泛的就是斑點免疫金滲濾法（DIGFA）。孔繁德等及曹春梅等都利用此技術對沙門氏菌的快速檢測進行了研究，曹春梅等[14]是利用斑點免疫金滲濾法對沙門氏菌O9抗原進行了研究，結果表明此法簡單、快速，適合推廣運用；孔繁德等[15]是通過建立直接檢測沙門氏菌的斑點免疫金滲濾法檢測試紙盒對該菌進行了研究。
3.4免疫磁性分離技術
免疫磁珠分離技術是將特定病原體的單抗或多抗與磁珠微球偶聯，並通過抗原抗體反應形成磁珠，在外加磁場作用下磁珠會發生定向移動，從而達到分離目標病原體的作用。食品樣品中致病菌含量很少，常規的方法是很難從中分離出來的，藉助免疫磁性分離技術可以達到快速分離的目的。王海明等[16]應用磁免疫技術建立快速檢測食源性沙門氏菌的方法，結果表明此方法能對食品基質中的目標菌進行快速有效的富集,其檢測限<10cfu/25g,檢測周期約為40小時。胡霏[17]也通過實驗針對鼠傷寒沙門氏菌建立免疫磁分離技術結合熒光層析技術的快速檢測方法。
4、生物感測器技術
生物感測器是利用一些生物活性物質如酶 、多酶體系 、抗體等做為敏感器件，然後配以適當的信號傳導器所構成的分析檢測的工具。我國學者已採用此法對沙門氏菌的抗原、抗體的免疫吸附進行檢測，並已用於快速檢測食品中致病的沙門氏菌，而僅需 1h 完成，達到了快速的檢測目的。寧毅[18]在對碳納米管性質研究的基礎上,結合分子探針構建了碳納米管生物感測器，並將其用於沙門氏菌的檢測，結果顯示所構建的感測器靈敏度高、特異性強、穩定性好。
5、電阻抗技術
電阻抗法是近年發展起來的一項生物學技術，因為具有檢測速度快、靈敏度高、准確性好等優點，目前此法已用於食品中沙門氏菌檢測檢驗並已通過美國公職分析化學協會(AOAC)認可。陳廣全等[19]建立了電阻抗法快速檢測食品中沙門氏菌的方法，並將其與常規培養法進行比較，對食品中的沙門氏菌屬進行檢測,結果表明電阻抗法比傳統培養法更加快速、可靠。
6、總結
綜上所述，沙門氏菌檢驗技術正從傳統的培養方法向分子檢測方法改進，並向儀器化、標准化、自動化方向發展，並且食品安全、致病菌等問題對人類健康以及生活環境都造成了嚴重威脅，加強沙門氏菌檢測勢在必行。目前沙門氏菌快速檢測技術大多具有檢測迅速、靈敏度高、特異性強等特點，此外這些方法還具有各自的優點和局限性，在未來發展過程中需要我們不斷改進和創新，建立更成熟可靠、方便快捷的沙門氏菌快速檢測技術。