gst檢測方法

① gst 抗氧化

（1）根據對照原則，向A瓶接種正常細胞，B、C、D、E瓶接種等量的鼻咽癌細胞．
（2）從實驗結果表格中數據可知，C、D、E瓶中分別加入GST溶液的濃度為5、10、15μmol/L，
（3）通過表格數據可知，實驗中通過檢測並統計細胞凋亡基因（Bcl-2基因和Bax基因）的表達來判斷對細胞凋亡的影響．
（4）據表2可知，實驗結果為檢測並統計鼻咽癌細胞凋亡率．
從表一中數據可知，Bcl-2蛋白表達降低和Bax蛋白表達升高時，鼻咽癌細胞凋亡增加，故鼻咽和癌細胞凋亡Bcl-2蛋白/Bax蛋白的比值呈負相關．
從表二中數據可知，GST可誘導鼻咽癌細胞凋亡，且隨著GST濃度增大，誘導凋亡效果增強．
癌細胞膜上的糖蛋白等物質減少，粘著性降低，易游離而從癌組織轉移出去．
故答案為：
（1）等量的鼻咽癌細胞
（2）5、10、15
（3）細胞凋亡基因（Bcl-2基因和Bax基因）的表達率
（4）鼻咽癌細胞凋亡率
分析與討論
①降低
②（GST）濃度
③糖蛋白

② gst pull down 技術詳解

GST pull down技術原理：
先將體外表達的GST融合蛋白結合到谷胱甘肽Beads上，再將靶蛋白-GST-Beads和細胞裂解液孵育，這樣互作蛋白便一起吸附在Beads上。洗滌掉未結合的蛋白後，再用洗脫液將互作蛋白復合物從Beads洗脫下來，即GST
pull down產物。這種互作復合物既可以用WesternBlot檢測已知蛋白，也可以用質譜鑒定出未知蛋白。

GST pull down實驗流程：

③ 免疫共沉澱和GST pull down技術各有何優勢

都是用來研究蛋白質相互作用的技術
免疫共沉澱的話蛋白質是處於天然狀態，蛋白質的相互作用可以在天然狀態下進行，可以避免認為影響，還可以分離得到天然狀態下相互作用的蛋白復合體。
但是問題是兩種蛋白質的結合可能不是直接結合，而可能有第三者在中間起橋梁作用；而且必須在實驗前預測目的蛋白是什麼，以選擇最後檢測的抗體，如果抗體選錯了就沒有結果。

GST pull-down是將GST融合蛋白作為探針固化到凝膠柱上，與溶液中的目的蛋白結合。可以用來確定融合（或探針）蛋白與未知（或靶）蛋白間的新的相互作用，證實探針蛋白與已知蛋白質間可疑的相互作用。
但問題是這個方法可能會出現假陽性。也就是也許是因為電荷作用的影響造成的吸附，而不是生理性的相互作用。

④ GST pull down 實驗細節問題求教

GST pull-down實驗是一個行之有效的驗證酵母雙雜交系統的體外試驗技術,近年來越來越受到廣大學者的青睞。其基本原理是將靶蛋白-GST融合蛋白親和固化在谷胱甘肽親和樹脂上,作為與目的蛋白親和的支撐物,充當一種「誘餌蛋白」,目的蛋白溶液過柱,可從中捕獲與之相互作用的「捕獲蛋白」(目的蛋白),洗脫結合物後通過SDS-PAGE電泳分析,從而證實兩種蛋白間的相互作用或篩選相應的目的蛋白,「誘餌蛋白」和「捕獲蛋白」均可通過細胞裂解物、純化的蛋白、表達系統以及體外轉錄翻譯系統等方法獲得。此方法簡單易行,操作方便。 GST：谷胱甘肽巰基轉移酶(glutathione S-transferase) 分子克隆第三版有詳細介紹，結合其中的示意圖很容易理解 GST融合蛋白沉降技術利用了GST對谷朧甘膚偶聯球珠的親和性，從非相互作用蛋白的溶液中純化相互作用蛋白。 GST融合的探針蛋白從細菌中表達和純化，並平行制備細胞裂解液(可被35S標記或非標記)，再將GST融合蛋白探針和細胞裂解液在谷朧甘膚瓊脂糖球珠存在下混合並孵育，以使蛋白結合。GST融合探針蛋白和任何結合分子被離心收集，獲得的混合物經洗滌後，用過量游離的谷朧甘膚洗脫或直接在SDS-PAGE上樣緩沖液中煮沸。蛋白質經SDS-PAGE分離後進行下一步的western印跡、放射自顯影及蛋白質染色分析。GST沉降技術對探測蛋白在溶液中的相互作用特別有用，而這種相互作用在膜的分析中可能是檢測不到的。 GST沉降實驗通常有兩種應用:確定融合(或探針)蛋白與未知(或靶)蛋白間新的相互作用(Kaelin et al. 1991, Grlinick and Chao 1996),以及證實探針蛋白與已知蛋白質間可疑的相互作用(例子請見Posern et al. 199$, Grgureaich et al. 1999, Hunteret al. 1999, Sun et al. 1999)。這兩種實驗的設計和實施都有所不同。  實驗目的：體外檢測蛋白質與蛋白質之間相互作用。用於驗證兩個已知蛋白的相互作用，或者篩選與已知蛋白相互作用的未知蛋白。 實驗原理：利用重組技術將探針蛋白與GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通過GST與固相化在載體上的GTH（Glutathione）親和結合。因此，當與融合蛋白有相互作用的蛋白通過層析柱時或與此固相復合物混合時就可被吸附而分離. 試劑：NaCl， KCl，Na2HPO4，KH2PO4，Triton-100，IPTG(Merck分裝)，PMSF（Amersco），Cocktaier（Merck 539134），Immobilized Glutathione（PIERCE 15160） 實驗操作程序： 材料及試劑 探針蛋白與GST融合的原核蛋白，裂解的細胞蛋白，或者組織蛋白提取物
細胞蛋白裂解液，洗脫液： PBS及PBS+1%Triton-100 PBS (1L) NaCl： 8g KCl： 0.2g Na2HPO4： 1.44g KH2PO4： 0.24g 加入800ml蒸餾水，用HCl調節溶液的pH值至7.4，最後加蒸餾水定容至1L即可，高溫高壓滅菌！4℃保存備用！ PMSF(苯甲基磺醯氟) MW:174.19 工作濃度0.1-1mM，這里使用1mM，儲存濃度100mM，將0.174g PMSF溶於10ml無水乙醇混勻即可！保持於-20℃或者4℃ （以下流程僅供研究已知原核蛋白A和真核過表達蛋白B相互作用） 1：原核融合蛋白A的獲得 1.1：將編碼蛋白A與GST的重組質粒化轉BL21(DE3)菌株 1.2：挑取單個克隆到含有5mlLB(+100ug/mlAmp)的10ml試管里，37℃培養過夜 1.3：將培養菌液轉移到含有500ml LB(+100ug/mlAmp)的1L錐形瓶中，37℃，225rpm培養至OD600≈1.0-1.5左右，加入適當濃度的IPTG，在適當溫度下培養適當時間（誘導條件需要根據不同的蛋白做調整）.6000g，10分鍾，4℃離心收集細菌，去盡上清，將菌體至於-20℃放置O/N 1.4：室溫凍融菌體，馬上置於冰上，每500ml培養液加入10-20ml細菌裂解液（PBS+1%Triton-100+PMSF），吹打混勻 1.5：冰上超聲破碎，開2秒，停9秒，總40-60分鍾。至裂解液充分清涼 1.6：11000rpm，15分鍾，4℃離心分離上清， -80℃保存備用 2：真核融合蛋白B的獲得
2.1：將編碼B蛋白的鹼基序列克隆到編碼標簽蛋白（如HA,或者myc）的真核表達載體上，進行細胞轉染 xq 3：48小時後，取適量融合蛋白GST-A冰上凍融 4：取50-70ulGST-Beads（Immobilized Glutathione）到EP管中，用800ul PBS+1%Triton-100潤洗一次，將凍融融合蛋白GST-A與之混勻，4℃層析櫃旋轉結合1小時。 5：PBS+1%Triton-100洗3次，PBS洗3次。留取20ul（ PBS+Beads）作Offer。 6：同時，裂解真核融合蛋白B，去盡培養基，用PBS(RT)洗一次，加入300ul裂解液（以6well為例，PBS+1%Triton-100+ Cocktaier），4℃放置30分鍾。 7：吹打收集至1.5mlEP管，超聲破碎。13000rpm，15分鍾，4℃離心取上清。 8：BCA蛋白定量（optional）留取20ul做Offer，其餘樣品加入到已純化蛋白的EP管中，用PBS補足液體到600ul左右，以便蛋白之間能充分結合！4℃旋轉結合O/N9：PBS+1%Triton-100洗3次，PBS洗3次。 10：40ul 5×loading buffer溶解beads上的蛋白，煮沸3分鍾，高速離心，Run –SDS PAGE做Western Blot檢測。用HA或者myc Blot。 注意GST-pull down的對照問題。（以A-GST和B-6*His為例） 1. 跑SDS-PAGE時點一個 input的蛋白（即B-6*His） 用於做陽性對照 看一下western操作過程中，試劑，操作步驟有沒有問題。 2. 谷胱甘肽瓊脂珠上只固定GST蛋白，input B-6*His，用於做陰性對照 看一下是否GST會與input的蛋白相互作用 Protocol for Immunoprecipitation or GST-pull down 1. Wash the cell monolayer once with cold PBS. 2. Treat the cells with 2mM 3,3』-/PBS at 4ºC for 25 min to crosslink the associated proteins. (optional) 3. Scratch off the cells, and spin down at 4ºC at 1000rpm for 5 min. 4. Decant the supernatant. 5. Resuspend the cell pellet in appropriate amount of IP-Buffer A, sonicate at 40%
output for 10 sec, and incubate the lysate at 4ºC for 45min. 6. Spin at highest speed at 4ºC for 5 min. 7. Recover the supernatant and detect protein concentration with Bradford Reagent (Bio-Rad). 8. Take 500ug proteins, mixed with 4 volume of IP-Buffer B. 9. Preclear the lysate by adding 1ug normal IgG and 5ul protein-G beads (Sigma), incubate on a rotator at 4ºC for 1hr. For GST-pull down assay, add 1ug GST protein and 5ul glutathione-sepharose 4B beads instead. 10. Spin down the beads at 4ºC at 10000rpm for 3min. 11. Recover the supernatant, add 1ug specific antibody or normal IgG, and incubate on a rotator at 4ºC for 2hr. For GST-pull down assay, add 1ug GST-fused specific protein or equal molar of GST protein instead. 12. Add 5ul of 5ul protein-G or glutathione-sepharose 4B beads, and incubate for another 2hr or overnight. 13. Spin down the beads at 4ºC at 2000rpm for 3min. Caution: There will be some white pellets just above the beads on the tube wall, which are protein precipitates e to denature. Remove away these precipitates, otherwise they will give false binding band in both control and test groups, affecting the explanation of the results. Check this phenomena at every washing step. 14. Wash the beads with 1ml of IP Washing buffer on a rotator at 4ºC for 5min. 15. Spin down the beads at 4ºC at 2000rpm for 3min. 16. Repeat step 14 and 15 for three more times. 17. Resuspend the pellet in 25ul 1xSDS loading buffer and incubate at RT for 30min. 18. Spin at 3000rpm at RT for 5min. 19. Recover the supernatant and put at –20ºC or subjected to SDS-PAGE running. 20. For the input control, 25ug protein will be included in gel running. Caution: to avoid the interference of IgG heavy chain with specific proteins with MW around 50KD, 1x SDS loading buffer without beta-mercaptoethanol or DTT can be used instead. At this condition, the interchain cysteine-cysteine bond will be maintained, giving IgG band at 100KD or so. IP-Buffer A: 50mM Tris-Cl PH 7.5 150mM NaCl 1mM EDTA PH8.0 0.5% Triton X-100 plus Protease Inhibitors (Roche) IP-Buffer B: IP-Buffer A minus Triton X-100. IP Washing Buffer: 50mM Tris-Cl PH 7.5 150mM NaCl

⑤ GST pull-down assay和免疫共沉澱的區別是什麼

GST
pull-down一般指用一個帶GST標簽的重組蛋白，與目的蛋白進行孵育，最後用結合GST的Beads拉下相互作用復合物。
免疫共沉澱一般是用某一蛋白的抗體，在細胞裂解液中與相應的蛋白結果，用Protein
A/G將抗原抗體復合物拉下，最後在拉下的復合物中檢測目的蛋白的實驗。
二者都是用於檢測蛋白相互作用的實驗。
區別是pull-down一般是驗證
體外
相互作用；免疫共沉澱一般用於檢測細胞水平的
體內
相互作用。

⑥ 免疫共沉澱和GST pull down技術各有何優勢

免疫共沉澱的話蛋白質是處於天然狀態，可以分離得到天然狀態下相互作用的蛋白復合體。

GST pull-down是將GST融合蛋白作為探針固化到凝膠柱上，與溶液中的目的蛋白結合。可以用來確定融合（或探針）蛋白與未知（或靶）蛋白間的新的相互作用。

⑦ DNA與蛋白質相互作用的研究方法有哪些

DNA與蛋白質相互作用的研究方法有哪些
研究DNA-蛋白質相互作用的實驗方法主要包括：a、凝膠阻滯實驗； b、DNase 1 足跡實驗；c、甲基化干擾實驗； d、體內足跡實驗； f、拉下實驗。研究蛋白質/ 核酸相互作用近期採用的新技術有：核酸適體技術、生物信息學方法、蛋白質晶元技術以及納米技術等。
（1） 利用有色熒光蛋白標記技術進行蛋白定位研究
此法也可稱為活細胞定位.把兩種具有相互作用的蛋白分別克隆到帶有兩種不同顏色熒光
蛋白（綠色熒光蛋白或紅色熒光蛋白）的載體中,共轉染到功能細胞中（一般選用 COS7 細胞）表達帶有熒光的融合蛋白.這樣,相互作用的兩種蛋白就被標上不同的熒光,可以在細胞內用熒光顯微鏡直接觀測.在進行精確細胞定位或共定位時,必須用共聚焦熒光顯微鏡觀測.因為共聚焦熒光顯微鏡（相當於醫院給病人診斷的 CT）觀測的是細胞內一個切面上的顏色.如果在一個切面上在同一區域看到兩種顏色,就提示這兩種蛋白在該區域內有相互作用.普通熒光顯微鏡看到的是一個立體圖象,無法確定蛋白質共定位現象.在進行定位或共定位同時,也可以對細胞核進行染色.這樣,在細胞中就有三種顏色.細胞核的顯色幫助你確定共定位發生的位置.上面介紹的活細胞定位,其優點是表達的熒光蛋白熒光強,沒有背景,觀測方便.但缺點
是相互作用的蛋白由於標上熒光蛋白,實際上是兩個融合蛋白.融合蛋白的定位結果或共定位結果是否與天然蛋白分布一致,有待於進一步確定.而利用免疫熒游標記技術可以避免這一缺點.
（2） 利用雙色或多色染色的免疫熒光技術進行蛋白定位研究
免疫熒光的原理是,首先把細胞進行固定,然後用待檢測靶蛋白的抗體（一抗）與細胞內
靶蛋白進行免疫反應,再用熒光素（如 FITC 和 TRITC 等）標記的二抗與一抗進行反應.這樣就在細胞內形成免疫復合物（靶蛋白----一抗---二抗）,結果靶蛋白被標上顏色,然後可用共聚焦熒光顯微鏡觀測定位與共定位結果.
免疫熒光技術最大優點就是可用來檢測細胞內源性蛋白的定位及相互作用.當然也可以對
靶細胞進行轉染表達目的蛋白,然後標記目的蛋白進行觀測.免疫熒光技術的缺點是熒光相對較弱並且背景較高,結果受到干擾,所以這項技術不好掌握.為了結果的可靠性,要求嚴格設計陽性對照與陰性對照.
（3） 細胞內蛋白動態定位
有時細胞在正常狀態下,有相互作用的蛋白在胞內可能暫時分開,沒有共定位現象發生.
但是在某一個特定情況下,如細胞受到外界刺激時,細胞本身會產生應急反應,這時暫時分離的蛋白有可能發生相互作用,並產生共定位現象.所以在進行共定位研究時,可根據具體情況具體分析,必要時觀測細胞內蛋白動態定位結果.

⑧ GST的中文解釋是血液檢查中的

GST是一種酶。
谷胱甘肽S-轉移酶（glutathione S-transferase，GST）：GST有三種同工酶（α、μ、π），其中GST-π可作為消化道惡性腫瘤的標志物。

⑨ 穀草轉氨酶(GOT)和谷丙轉氨酶(GST)在臨床上有什麼臨床的檢測意義

根據你的問題簡潔回答一下:

第一.谷丙轉氨酶（簡稱GPT、ALT）升高在臨床是很常見的現象。肝臟是人體最大的解毒器官，該臟器是不是正常，對人體來說是非常重要的。GPT升高肝臟功能出現問題的一個重要指標。在常見的因素里，各類肝炎都可以引起GPT升高，這是由於肝臟受到破壞所造成的。一些葯物如抗腫瘤葯、抗結核葯，都會引起肝臟功能損害。大量喝酒、食用某些食物也會引起肝功能短時間損害。
GPT主要存在於肝細胞漿內，其胞內濃度高於血清中1000-3000倍。只要有1%的肝細胞壞死，就可以使血清酶增高一倍。因此，GPT被世界衛生組織推薦為肝功能損害最敏感的檢測指標。但它並不具器官專一性，許多疾病都可以引起它的增高。明顯升高見於急性病毒性肝炎，中度升高見於慢性肝炎、肝硬化活動期、肝癌、肝膿腫，心梗、心肌炎、心衰等也可輕度升高。因此對GPT升高的評價應密切結合臨床。部分GPT升高與脂肪肝、飲用酒精有關。臨床常用的保肝葯物較多。但有些葯物治療效果可以但容易反復，致使一些肝臟疾病長期不能治癒，大量的肝細胞遭受破壞。如何保護肝細胞，是保護肝臟功能的關鍵所在。

第二.穀草轉氨酶在心肌細胞中含量最高，但肝臟損害時其血清濃度也可升高，臨床一般常作為心肌梗塞和心肌炎的輔助檢查。穀草轉氨酶的正常值為0～40μ/L，當谷丙轉氨酶(ALT)明顯升高，穀草(AST)／谷丙(ALT)比值>1時，就提示有肝實質的損害。

⑩ gst pulldown 能證明兩蛋白間是直接相互作用的嗎

一、酵母雙雜交系統：酵母雙雜交系統是當前廣泛用於蛋白質相互作用組學研究的一種重要方法。其原理是當靶蛋白和誘餌蛋白特異結合後，誘餌蛋白結合於報道基因的啟動子，啟動報道基因在酵母細胞內的表達，如果檢測到報道基因的表達產物，則說明兩者之間有相互作用，反之則兩者之間沒有相互作用。將這種技術微量化、陣列化後則可用於大規模蛋白質之間相互作用的研究。在實際工作中，人們根據需要發展了單雜交系統、三雜交系統和反向雜交系統等。Angermayr等設計了一個SOS蛋白介導的雙雜交系統。可以研究膜蛋白的功能，豐富了酵母雙雜交系統的功能。此外，酵母雙雜交系統的作用也已擴展至對蛋白質的鑒定。
二、噬菌體展示技術：在編碼噬菌體外殼蛋白基因上連接一單克隆抗體的DNA序列，當噬菌體生長時，表面就表達出相應的單抗，再將噬菌體過柱，柱上若含目的蛋白，就會與相應抗體特異性結合，這被稱為噬菌體展示技術。此技術也主要用於研究蛋白質之間的相互作用，不僅有高通量及簡便的特點，還具有直接得到基因、高選擇性的篩選復雜混合物、在篩選過程中通過適當改變條件可以直接評價相互結合的特異性等優點。目前，用優化的噬菌體展示技術，已經展示了人和鼠的兩種特殊細胞系的cdna文庫，並分離出了人上皮生長因子信號傳導途徑中的信號分子。
三、等離子共振技術：表面等離子共振技術(Surface Plasmon Resonance，SPR)已成為蛋白質相互作用研究中的新手段。它的原理是利用一種納米級的薄膜吸附上「誘餌蛋白」，當待測蛋白與誘餌蛋白結合後，薄膜的共振性質會發生改變，通過檢測便可知這兩種蛋白的結合情況。SPR技術的優點是不需標記物或染料，反應過程可實時監控。測定快速且安全，還可用於檢測蛋白一核酸及其它生物大分子之間的相互作用。
四、熒光能量轉移技術：熒光共振能量轉移(FRET )廣泛用於研究分子間的距離及其相互作用; 與熒光顯微鏡結合，可定量獲取有關生物活體內蛋白質、脂類、DNA 和RNA 的時空信息。隨著綠色熒光蛋白(GFP)的發展，FRET 熒光顯微鏡有可能實時測量活體細胞內分子的動態性質。提出了一種定量測量FRET效率以及供體與受體間距離的簡單方法，僅需使用一組濾光片和測量一個比值，利用供體和受體的發射譜消除光譜間的串擾。該方法簡單快速，可實時定量測量FRET 的效率和供體與受體間的距離，尤其適用於基於GFP 的供體受體對。
五、抗體與蛋白質陣列技術：蛋白晶元技術的出現給蛋白質組學研究帶來新的思路。蛋白質組學研究中一個主要的內容就是研究在不同生理狀態下蛋白水平的量變，微型化，集成化，高通量化的抗體晶元就是一個非常好的研究工具，他也是晶元中發展最快的晶元，而且在技術上已經日益成熟。這些抗體晶元有的已經在向臨床應用上發展，比如腫瘤標志物抗體晶元等，還有很多已經應用再眼就的各個領域里。
六、免疫共沉澱技術：免疫共沉澱主要是用來研究蛋白質與蛋白質相互作用的一種技術，其基本原理是，在細胞裂解液中加入抗興趣蛋白的抗體，孵育後再加入與抗體特異結合的結合於Pansobin珠上的金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)，若細胞中有正與興趣蛋白結合的目的蛋白，就可以形成這樣一種復合物：「目的蛋白—興趣蛋白—抗興趣蛋白抗體—SPAPansobin」，因為SPAPansobin比較大，這樣復合物在離心時就被分離出來。經變性聚丙烯醯胺凝膠電泳，復合物四組分又被分開。然後經Western blotting法，用抗體檢測目的蛋白是什麼，是否為預測蛋白。這種方法得到的目的蛋白是在細胞內天然與興趣蛋白結合的，符合體內實際情況，得到的蛋白可信度高。但這種方法有兩個缺陷：一是兩種蛋白質的結合可能不是直接結合，而可能有第三者在中間起橋梁作用;二是必須在實驗前預測目的蛋白是什麼，以選擇最後檢測的抗體，所以，若預測不正確，實驗就得不到結果，方法本身具有冒險性。
七、pull-down技術：蛋白質相互作用的類型有牢固型相互作用和暫時型相互作用兩種。牢固型相互作用以多亞基蛋白復合體常見，最好通過免疫共沉澱(Co-IP) 、Pull-down技術或Far-western法研究。Pull-down技術用固相化的、已標記的餌蛋白或標簽蛋白(生物素-、PolyHis-或GST-)，從細胞裂解液中釣出與之相互作用的蛋白。通過Pull-down技術可以確定已知的蛋白與釣出蛋白或已純化的相關蛋白間的相互作用關系，從體外傳路或翻譯體系中檢測出蛋白相互作用關系。