山椒素的紫外分光光度檢測方法

A. 紫外分光光度法的原理是什麼

分光光度法是光譜法的重要組成部分，是通過測定被測物質在特定波長處或一定波長范圍內的吸光度或發光強度，對該物質進行定性和定量分析的方法。

常用的技術包括紫外-可見分光光度法、紅外分光光度法、熒光分光光度法和原子吸收分光光度法等。紫外-可見分光光度法是在190～800nm波長范圍內測定物質的吸光度，用於鑒別、雜質檢查和定量測定的方法。

(1)山椒素的紫外分光光度檢測方法擴展閱讀

物質對光的選擇性吸收波長，以及相應的吸收系數是該物質的物理常數。在一定條件下，物質的吸收系數是恆定的，且與入射光的強度、吸收池厚度及樣品濃度無關。

當已知某純物質在一定條件下的吸收系數後，可用同樣條件將該供試品配成溶液，測定其吸光度，即可由上式計算出供試品中該物質的含量。在可見光區，除某些物質對光有吸收外，很多物質本身並沒有吸收，但可在一定條件下加入顯色試劑或經過處理使其顯色後再測定。

參考資料來源：網路-紫外-可見分光光度法

B. 紫外分光光度計怎麼做檢測限能具體怎麼做的方案嗎

你是要測啥目標物啊。是測DNA嗎，可以做等比稀釋，然後用濃度和吸光度作圖，線性部分就是可檢測濃度，S型曲線的兩端就是檢測范圍的下限和上限

C. 紫外分光光度法測定葯物含量的方法主要有哪兩種

標准物質做吸收度的標准曲線，再測樣品的吸收度，換算成濃度。有的測透過率。前者是主要的

D. 紫外分光光度法測木質素具體步驟

是想定性還是測含量？
定性的話比較簡單，進行光譜掃描，進行圖譜分析，定量的話就需要用標准物質在特徵波長下做標准曲線了

E. 如何用紫外分光光度計，測量水中二甲苯的濃度（步驟）

分光光度計要測量的樣品必須是均一的溶液，不能有沉澱，如果有沉澱的話就要搖勻。之於為什麼這樣做和可以做哪些測量、如何測量，下面詳述:
分光光度計就是利用分光光度法對物質進行定量定性分析的儀器。
而分光光度法則是通過測定被測物質在特定波長處或一定波長范圍內光的吸收度，對該物質進行定性和定量分析。 常用的波長范圍為：(1)200～400nm的紫外光區,(2)400～760nm的可見光區,(3)2.5～25μm（按波數計為4000cm<-1>～400cm<-1>）的紅外光區。所用儀器為紫外分光光度計、可見光分光光度計（或比色計）、紅外分光光度計或原子吸收分光光度計。為保證測量的精密度和准確度，所有儀器應按照國家計量檢定規程或本附錄規定，定期進行校正檢定。 單色光輻射穿過被測物質溶液時，被該物質吸收的量與該物質的濃度和液層的厚度（光路長度）成正比，其關系如下式： 1 A=log — =ECL T 式中 A 為吸收度； T 為透光率； E 為吸收系數，採用的表示方法是(E1％ 1cm),即吸收度換算成溶液濃度為1％(g/ml)，液層厚度為1cm的數值； C 為100ml溶液中所含被測物質的重量，g(按乾燥品或無水物計算）； L 為液層厚度 ，cm。 物質對光的選擇性吸收波長，以及相應的吸收系數是該物質的物理常數。當已知某純物質在一定條件下的吸收系數後,可用同樣條件將該供試品配成溶液，測定其吸收度,即可由上式計算出供試品中該物質的含量。在可見光區，除某些物質對光有吸收外，很多物質本身並沒有吸收,但可在一定條件下加入顯色試劑或經過處理使其顯色後再測定,故又稱比色分析。由於顯色時影響呈色深淺的因素較多，且常使用單色光純度較差的儀器，故測定時應用標准品或對照品同時操作。
分光光度計已經成為現代分子生物實驗室常規儀器。常用於核酸，蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。
分光光度計的簡單原理
分光光度計計採用一個可以產生多個波長的光源，通過系列分光裝置，從而產生特定波長的光源，光源透過測試的樣品後，部分光源被吸收，計算樣品的吸光值，從而轉化成樣品的濃度。樣品的吸光值與樣品的濃度成正比。
核酸的定量
核酸的定量是分光光度計使用頻率最高的功能。可以定量溶於緩沖液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA。核酸的最高吸收峰的吸收波長260 nm。每種核酸的分子構成不一，因此其換算系數不同。定量不同類型的核酸，事先要選擇對應的系數。如：1OD 的吸光值分別相當於50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。測試後的吸光值經過上述系數的換算，從而得出相應的樣品濃度。測試前，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液的體積，爾後測試空白液和樣品液。然而，實驗並非一帆風順。讀數不穩定可能是實驗者最頭痛的問題。靈敏度越高的儀器，表現出的吸光值漂移越大。
事實上，分光光度計的設計原理和工作原理，允許吸光值在一定范圍內變化，即儀器有一定的准確度和精確度。如Eppendorf Biophotometer的准確度≤1.0%（1A）。這樣多次測試的結果在均值1.0%左右之間變動，都是正常的。另外，還需考慮核酸本身物化性質和溶解核酸的緩沖液的pH值，離子濃度等：在測試時，離子濃度太高，也會導致讀數漂移，因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液，如TE，可大大穩定讀數。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由於樣品中不可避免存在一些細小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了最大程度減少顆粒對測試結果的影響，要求核酸吸光值至少大於0.1A，吸光值最好在0.1-1.5A。在此范圍內，顆粒的干擾相對較小，結果穩定。從而意味著樣品的濃度不能過低，或者過高（超過光度計的測試范圍）。最後是操作因素，如混合要充分，否則吸光值太低，甚至出現負值；混合液不能存在氣泡，空白液無懸浮物，否則讀數漂移劇烈；必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品，否則濃度差異太大；換算系數和樣品濃度單位選擇一致；不能採用窗口磨損的比色杯；樣品的體積必須達到比色杯要求的最小體積等多個操作事項。
除了核酸濃度，分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度，如A260/A280的比值，用於評估樣品的純度，因為蛋白的吸收峰是280nm。純凈的樣品，比值大於1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低於1.8 或者2.0，表示存在蛋白質或者酚類物質的影響。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等，較純凈的核酸A260/A230的比值大於2.0。A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品，A320一般是0。
蛋白質的直接定量（UV法）
這種方法是在280nm波長，直接測試蛋白。選擇Warburg 公式，光度計可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應的換算方法，將吸光值轉換為樣品濃度。蛋白質測定過程非常簡單，先測試空白液，然後直接測試蛋白質。由於緩沖液中存在一些雜質，一般要消除320nm 的「背景」信息，設定此功能「開」。與測試核酸類似，要求A280的吸光值至少大於0.1A，最佳的線性范圍在1.0-1.5 之間。實驗中選擇Warburg 公式顯示樣品濃度時，發現讀數「漂移」。這是一個正常的現象。事實上，只要觀察A280的吸光值的變化范圍不超過1%，表明結果非常穩定。漂移的原因是因為Warburg 公式吸光值換算成濃度，乘以一定的系數，只要吸光值有少許改變，濃度就會被放大，從而顯得結果很不穩定。蛋白質直接定量方法，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質。紫外直接定量法相對於比色法來說，速度快，操作簡單；但是容易受到平行物質的干擾，如DNA的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。
比色法蛋白質定量
蛋白質通常是多種蛋白質的化合物，比色法測定的基礎是蛋白質構成成分：氨基酸（如酪氨酸，絲氨酸）與外加的顯色基團或者染料反應，產生有色物質。有色物質的濃度與蛋白質反應的氨基酸數目直接相關，從而反應蛋白質濃度。
比色方法一般有BCA，Bradford，Lowry 等幾種方法。
Lowry 法：以最早期的Biuret 反應為基礎，並有所改進。蛋白質與Cu2 反應，產生藍色的反應物。但是與Biuret 相比，Lowry 法敏感性更高。缺點是需要順序加入幾種不同的反應試劑；反應需要的時間較長；容易受到非蛋白物質的影響；含EDTA，Triton x-100，ammonia sulfate 等物質的蛋白不適合此種方法。
BCA（Bicinchoninine acid assay）法：這是一種較新的、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在鹼性溶液里與Cu2 反應產生Cu ，後者與BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波長。此化合物與蛋白濃度的線性關系極強，反應後形成的化合物非常穩定。相對於Lowry法，操作簡單，敏感度高。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質之間以及去污劑的干擾。
Bradford 法：這種方法的原理是蛋白質與考馬斯亮蘭結合反應，產生的有色化合物吸收峰595nm。其最大的特點是，敏感度好，是Lowry 和BCA 兩種測試方法的2 倍；操作更簡單，速度更快；只需要一種反應試劑；化合物可以穩定1小時，方便結果；而且與一系列干擾Lowry，BCA 反應的還原劑（如DTT，巰基乙醇）相容。但是對於去污劑依然是敏感的。最主要的缺點是不同的標准品會導致同一樣品的結果差異較大，無可比性。
某些初次接觸比色法測定的研究者可能為各種比色法測出的結果並不一致，感到迷惑，究竟該相信哪種方法？由於各種方法反應的基團以及顯色基團不一，所以同時使用幾種方法對同一樣品得出的樣品濃度無可比性。例如：Keller等測試人奶中的蛋白，結果Lowry，BCA 測出的濃度明顯高於Bradford，差異顯著。即使是測定同一樣品，同一種比色法選擇的標准樣品不一致，測試後的濃度也不一致。如用Lowry測試細胞勻漿中的蛋白質，以BSA作標准品，濃度1.34mg/ml，以a球蛋白作標准品，濃度2.64mg/ml。因此，在選擇比色法之前，最好是參照要測試的樣本的化學構成，尋找化學構成類似的標准蛋白作標准品。另外，比色法定量蛋白質，經常出現的問題是樣品的吸光值太低，導致測出的樣品濃度與實際的濃度差距較大。關鍵問題是，反應後1011分光光度計的重要配件—— 比色杯的顏色是有一定的半衰期，所以每種比色法都列出了反應測試時間，所有的樣品（包括標准樣品），都必須在此時間內測試。時間過長，得到的吸光值變小，換算的濃度值降低。除此，反應溫度、溶液PH值等都是影響實驗的重要原因。此外，非常重要的是，最好是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材質的比色杯，因為反應後的顏色會讓石英或者玻璃著色，導致樣品吸光值不準確。
細菌細胞密度（OD 600）
實驗室確定細菌生長密度和生長期，多根據經驗和目測推斷細菌的生長密度。在遇到要求較高的實驗，需要採用分光光度計准確測定細菌細胞密度。OD600是追蹤液體培養物中微生物生長的標准方法。以未加菌液的培養液作為空白液，之後定量培養後的含菌培養液。為了保證正確操作，必須針對每種微生物和每台儀器用顯微鏡進行細胞計數，做出校正曲線。實驗中偶爾會出現菌液的OD值出現負值，原因是採用了顯色的培養基，即細菌培養一段時間後，與培養基反應，發生變色反應。另外，需要注意的是，測試的樣品不能離心，保持細菌懸浮狀態。
分光光度計的重要配件—— 比色杯
比色杯按照材質大致分為石英杯、玻璃杯以及塑料杯。根據不同的測量體積，有比色杯和毛細比色杯等。一般測試核酸和紫外定量蛋白，均採用石英杯或者玻璃杯，但是不適合比色法測定。因為反應中的染料（如考馬斯亮蘭）能讓石英和玻璃著色，所以必須採用一次性的塑料杯。而塑料杯一般不適合用於在紫外范圍內測試樣品。
由於另外測試的樣品量不同，所以一般分光光度計廠家提供不同容積的比色杯以滿足用戶不同的需求。目前市場已經存在一種既可用於核酸、紫外蛋白質定量，亦可用於蛋白比色法測定的塑料杯，樣品用量僅需50μl，比色杯單個無菌包裝，可以回收樣品。如Eppendorf UVette塑料比色杯，是目前比色杯市場上一個革新。隨著生命科學以及相關學科發展，對此類科學的實驗研究提出更高的要求，分光光度計將是分子生物學實驗室不可缺少的儀器，也成為微生物、食品、制葯等相關實驗室的必備設備之一。
隨著科技的發展，現在比色杯已經不是使用分光光度計時的必備物品。目前國外Nanodrop公司（現已被Thermo Fisher公司收購）生產的ND1000分光光度計與舊式分光光度計相比，已經可以做到無需稀釋樣品，無需使用比色杯，每次測量僅需1-2μl樣品即可完成測量。

F. 怎麼用可見紫外分光光度計測定樣品

第一步，知道你所需要測量物質的特徵吸收波長是多少？這個可以在國家標准、行業標准或其他相關標准或方法。例如測量總氮的話，就需要220和275nm這2個波長，所以必須買紫外的光度計，並且最好帶雙波長測定功能，例如測總磷是697nm，只需買台可見光度計就可以了。
第二步，知道所測量的物質的實驗方法，需要哪些儀器和設備，還有玻璃器皿等，同時還有比較完成測量所需要的所有化學試劑等。這個可以在標准或實驗方法中找到，基本在互聯網上都可以找到電子版的測量方法。
第三步，配置好所需測量物質的標准濃度溶液，一般是5-8個標准溶液，濃度建議從高到低，建議每個不同濃度貼上標簽，以防順序搞錯。注意，部分實驗需要往標准溶液中加顯色劑之後才可以用光度計進行測量。
第四步，設置好光度計的測量波長，這就需要熟悉光度計的基本操作，一般測量物質的濃度都是用的標准曲線法，就是對應光度計中的定量測量功能。具體操作時第一步，把儀器的波長調整到我們所需要的波長，例如測量總磷直接把波長走到697nm，之後放入裝好蒸餾水的比色皿到樣品室做空白，就是熟稱的調零。第三部把標准溶液放入樣品室，依次測量他們的吸光度，儀器一般會自動記錄之後就會給出標准曲線方程，實驗完畢。如果儀器不能直接記錄吸光度，可以先記在筆記本上，之後用excel軟體進行計算標准曲線。判斷做出的標准曲線是否能用，看哪個R值即那個相關系數，一般最少做出0.999就可以用了，差一點的儀器也可以做出0.99.
第五步，把未知樣品放入樣品室就可以直接測量出樣品濃度。

G. 簡述用紫外分光光度法定性鑒定方法有哪些

1、比對最大吸收峰的方法；
2、摩爾吸光系數的比對法；
3、比對吸收光譜曲線法。

H. 急求紫外分光光度法的詳細操作步驟

一、原理

可見光、紫外線照射某些物質，主要是由於物質分子中價電子能級躍遷對輻射的吸收，而產生化合物的可見紫外吸收光譜。基於物質對光的選擇性吸收的特性而建立分光光度法或稱吸收光譜法的分析方法。它是以朗伯──比耳定律為基礎。

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朗伯—比耳定律 A = lg—- = ECL

T

式中 A為吸收度；

T為透光率；

E為吸收系數，採用的表示方法是（E１％１ｃｍ），其物理意義為當溶液濃度為1%（g/ml），液層厚度為1cm時的吸收度數值；

C為100ml溶液中所含被測物質的重量（按乾燥品或無水物計算），g；

L為液層厚度，cm。

二、使用范圍

凡具有芳香環或共軛雙鍵結構的有機化合物，根據在特定吸收波長處所測得的吸收度，可用於葯品的鑒別、純度檢查及含量測定。

三、儀器

可見-紫外分光光度計。其應用波長范圍為200～400nm的紫外光區、400～850nm的可見光區。主要由輻射源（光源）、色散系統、檢測系統、吸收池、數據處理機、自動記錄器及顯示器等部件組成。

本儀器是根據相對測量的原理工作的，即先選定某一溶劑（或空氣、試樣）作為標准（空白或稱參比）溶液，並認為它的透光率為100％（或吸收度為0），而被測的試樣透光率（或吸收度）是相對於標准溶液而言，實際上就是由出射狹縫射出的單色光，分別通過被測試樣和標准溶液，這兩個光能量之比值，就是在一定波長下對於被測試樣的透光率（或吸收度）。

本儀器可精密測定具有芳香環或共軛雙鍵結構的有機化合物、有色物質或在適當條件下能與某些試劑作用生成有色物的物質。

使用前應校正測定波長並按儀器說明書進行操作。

四、儀器的校正

1.波長的准確度試驗

以儀器顯示的波長數值與單色光的實際波長值之間誤差表示，應在±1.0nm范圍內。

可用儀器中氘燈的486.02nm與656.10nm譜線進行校正。

2.吸收度的准確度試驗

3.雜散光的試驗

4.波長重現性試驗

5.解析度試驗

五、測定方法

1.對照品比較法

（1）按各品種項下的方法，分別配製供試品溶液和對照品溶液，對照品溶液中所含被測成分的量應為供試品溶液中被測成分標示量的100±10%，所用溶劑也應完全一致，在規定的波長測定供試品溶液和對照品溶液的吸收度後，按下式計算含量，即得。

（2）計算式

A樣×G對/稀釋倍數×100×1

含量（%）= ————————————-- ×100%

A對×G樣/稀釋倍數×100×1

2.吸收系數法

（1）按各品種項下的方法配製供試品溶液，在規定的波長處測定其吸收度，再以該品種在規定條件下的吸收系數計算含量。用本法測定時，應注意儀器的校正和檢定。

（2）計算式

A樣

含量（%）= ——————————————- ×100%

G樣/稀釋倍數×(E１％１ｃｍ)對×100×1

3.計算分光光度法

採用計算分光光度法應慎重。本法有多種，使用時均應按各品種項下規定的方法進行。當吸收度處在吸收曲線的陡然上升或下降的部位測定時，波長的微小變化可能對測定結果造成顯著影響，故對照品和供試品測試條件應盡可能一致。若測定時不用對照品，如維生素A測定法，則應在測定時對儀器作仔細的校正和檢定。

六、注意事項

1.空白溶液與供試品溶液必須澄清，不得有渾濁。如有渾濁，應預先過濾，並棄去初濾液。

2.測定時，除另有規定外，應以配製供試品溶液的同瓶溶劑為空白對照，採用1cm的石英吸收池。

3.在規定的吸收峰波長±2nm以內測試幾個點的吸收度，以核對供試品的吸收峰波長位置是否正確，除另有規定外，吸收峰波長應在該品種項下規定的波長±2nm以內；否則應考慮該試樣的真偽、純度以及儀器波長的准確度，並以吸收度最大的波長作為測定波長。

4.一般供試品溶液的吸收度讀數，以在0.3～0.7之間的誤差較小。

5.吸收池應選擇配對，否則要引入測定誤差。在規定波長下兩個吸收池的透光率相差小於0.5％的吸收池作配對，在必要的情況時，須在最終測量扣除吸收池間的誤差修正值。

6.由於吸收池和溶劑本身可能有空白吸收，因此測定供試品的吸收度後應減去空白讀數，再計算含量。

7.儀器的接地必須良好，一切裸露的零件對地電位不得超過24伏（測電筆的氖管不得發亮）。

8.在使用過程中，如需開啟試樣室蓋時或暫時停止測試時，必須及時推入光門鈕桿（使光電管前光門關閉），保護光電管，以防止光電管受強光或長時間照射而損壞。

9.在測定時或改測其它檢品時，應用待測溶液沖洗吸收池3～4次，用干凈綢布或擦鏡紙擦凈吸收池的透光面至不留斑痕（切忌把透光面磨損）。

10.取吸收池時，應拿毛玻璃兩面，切忌用手拿捏透光面，以免粘上油污。使用完後及時用測定溶劑沖凈，再用純化水沖凈，用干凈綢布或擦鏡紙擦乾，晾乾後，放入吸收池盒中，防塵保存。

11.若吸收池內外壁沾污，兩池差較大的處理。

（1）可用綢布纏在扁竹條外或用脫脂棉纏在細玻璃棒上蘸上乙醇，輕輕摩擦，再用純化水沖凈。

（2）如上述方法處理不好，必要時可用重鉻酸鉀-硫酸洗液泡洗1～2分鍾，用自來水沖凈，再用純化水沖凈。

（3）不得用毛刷刷洗或硬物拭擦，以防止表面光潔度受損影響正常使用。

12.請務必注意經常保持硅膠的乾燥，目的是保護光學元件和光電放大器系統不致受潮損壞而影響儀器的正常工作，如發現有的硅膠由藍色變為粉紅色，應立即更換。該儀器乾燥劑筒有兩個：一個是裝在放大器暗盒上，另一個裝在單色光器暗盒上。

13.在更換硅膠乾燥劑時，應關閉切斷電源。

14.在停止工作期間，主機試樣室內應放入袋裝或筒裝硅膠乾燥劑。用防塵罩罩住整個儀器，並在防塵罩內放數袋防潮硅膠。

15.儀器在操作中，狹縫的寬度應從小逐漸開大。若狹縫過大，由於進入光電管的光能量強度過大，將會使放大器輸出信號達到飽和，以至數字顯示出溢出（即數字閃爍或示1不變）。這不是儀器有故障。

16.將波長旋轉放在625nm，鋏縫關閉在0.02nm附近，選擇按鍵恢復在停止工作部位（即三個鍵均彈出）。

17.搬動儀器時應搬在主體端，不要搬在試樣室和光電管盒端以及光源燈室部位，以防止儀器狹縫或光路部件受力而發生變形。並在搬動或運輸時，應將可動部分固定，如各旋鈕可用膠布貼住，狹縫位置開大些，然後固定，不要關小狹縫，以免運輸時振動使狹縫刀口受損壞。

18.儀器的光柵、反射鏡絕對不能擦拭，否則將損壞儀器光學表面，增加雜散光。

19.儀器經過搬動請及時檢查並糾正波長精度，為保證測定的准確性請經常校準波長精度。如有異常，應立即報告質量保證部，但不得擅自調整，並及時做好記錄。

七、結果計算

A

E１％１ｃｍ（供試品） = ——

CL

E１％１ｃｍ（供試品）

含量（%）= ——————————- ×100%

E１％１ｃｍ（標准值或對照品）

八、允許差

儀器分析方法的誤差限度，除另有規定外，其相對偏差應在±(2.0～3.0)%。

( 來自網路博客)

I. 用紫外分光光度計如何確定檢測波長

1、紫外分光光度計都自帶波長自檢功能，其原理是儀器內部利用已設定的氘燈或者鎢燈的特徵波峰與同樣設定波長下波峰做比對，並根據內部設定值做修正。

2、紫外分光光度計，就是根據物質的吸收光譜研究物質的成分、結構和物質間相互作用的有效手段。紫外分光光度計可以在紫外可見光區任意選擇不同波長的光。物質的吸收光譜就是物質中的分子和原子吸收了入射光中的某些特定波長的光能量，相應地發生了分子振動能級躍遷和電子能級躍遷的結果。由於各種物質具有各自不同的分子 、原子和不同的分子空間結構，其吸收光能量的情況也就不會相同，因此，每種物質就有其特有的、固定的吸收光譜曲線，可根據吸收光譜上的某些特徵波長處的吸光度的高低判別或測定該物質的含量。

J. 紫外分光光度法

在實際測量中，採用在另一等同的吸收池中放入溶劑與被分析溶液的透射強度進行比較，即：A = lg( I溶劑/ I溶液) ≈ lg ( I 0/ I )吸光度具有加和性：A總λ= A1λ+ A2λ+ …Anλ比爾定律應用的局限性：只適用於稀溶液、化學偏離、儀器偏離
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4.2 紫外一可見分光光度計
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1. 光源功能：提供能量激發被測物質分子，使之產生電子光譜譜帶（提供寬頻輻射）。連續光源：廣泛應用在吸收和熒光光譜中(氣體放電光源) 氘燈、氫燈紫外可見氬燈真空紫外氙燈真空紫外、紫外、可見(熱輻射光源) 鎢絲燈、鹵鎢燈可見光區
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2. 單色器功能：從光源輻射的復合光中分出單色光。3. 吸收池功能：盛放分析試樣（一般是液體）
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4. 檢測器功能：檢測光信號，測量單色光透過溶液後光強度變化的一種裝置。5. 信號顯示系統
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6. 紫外一可見分光光度計的類型(1) 單波長單光束分光光度計缺點：測量結果受電源波動的影響較大，誤差較大。
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(2) 單波長雙光束分光光度計優點：除了能自動掃描吸收光譜外，還可自動消除電源電壓波動的影響，減小放大器增益的漂移。
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(3) 雙波長分光光度計優點：在有背景干擾或共存組分的吸收干擾的情況下，可以對某組分進行定量測定。還可以獲得微分光譜和進行系數倍率法測定。
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(4) 多道分光光度計具有快速掃描的特點
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4.3 化合物電子光譜的產生4.3.1 有機化合物的紫外一可見吸收光譜（一） 躍遷類型在紫外可見光區范圍內，有機化合物的吸收帶主要由σ→σ*、n→σ*、π→π*和n→π*躍遷產生，其相對能量大小次序為：σ→σ*>n→σ*>π→π*>n→π*。
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σ∗π∗nπσσ σ∗σ π∗π σ∗n σ∗π π∗n π∗有機化合物分子中電子躍遷的能量
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σ→σ*躍遷：分子中的成鍵σ電子躍遷到σ*反鍵軌道上去，這是一切飽和有機化合物都可能產生的電子躍遷類型。n→σ*躍遷：分子中未成鍵的n電子激發到σ*軌道上去，所有含有雜原子的飽和烴衍生物都可發生這種躍遷。含有σ→σ*、n→σ*躍遷的化合物，如：飽和烷烴、鹵代烷烴、醇、醚等是紫外可見吸收光譜測定時的良好溶劑。
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•π→π*躍遷：可以發生在任何具有不飽和鍵的有機化合物分子中，其最大摩爾吸光系數εmax很大。•n→π*躍遷：發生在含有雜原子的不飽和化合物中，其最大摩爾吸光系數εmax比較小。•電荷遷移躍遷：當外來輻射照射某些化合物時，電子從體系具有給予體特性的部分轉移到該體系具有電子接受體特性的部分所發生的躍遷。其譜帶較寬，吸收強度大，εmax> 104。
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NR1R2NR1R2+-hυ電子接受體電子給予體CC+hυ電子接受體電子給予體OROR-
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（二）常用術語1. 生色團：分子中可以吸收光子而產生電子躍遷的原子基團。（含有π鍵的不飽和基團）2. 助色團：有些基團本身沒有生色作用，但卻能增強生色團的生色能力，即它們與生色團相連時，會使其吸收帶是最大吸收波長發生紅移，並且增加其強度。通常是帶有非鍵電子對的基團。3. 紅移和紫移：吸收帶的最大吸收波長發生移動，向長波方向移動稱為紅移，向短波方向移動稱為紫移。
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（三）有機化合物的紫外、可見光譜1. 飽和烴及其取代衍生物σ→σ*、n→σ*2. 不飽和烴及共軛烯烴σ→σ*、π→π*3. 羰基化合物n→σ*、π→π*和n→π*4. 苯及其衍生物 E1帶、 E2帶、 B帶5. 稠環和雜環
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4.3.2 無機化合物的紫外一可見吸收光譜（一）電荷遷移躍遷某些分子同時具有電子給體特性的部分和電子受體特性的部分。當電子從給體外展軌道向受體躍遷時就會產生較強的吸收，這樣產生的光譜稱為電荷遷移光譜。如在金屬絡合物中配位體具有電子給體的性質，金屬離子為電子受體。電子從配位體軌道躍遷到中心原子的外層軌道，就可以產生電荷遷移光譜。
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（二）配位場躍遷1. f-f躍遷鑭系和銅系元素的離子對紫外和可見光的吸收是基於內層f電子躍遷而產生的，其吸收光譜是由一些狹窄的特徵吸收峰組成，且這些吸收峰不易受金屬離子所處的配位環境的影響。2. d-d躍遷過渡金屬離子的d軌道在受到配位體場的作用時產生分裂。d電子在能級不同的d軌道間躍遷，吸收紫外或可見光產生吸收光譜。這種光譜的吸收帶比較寬，吸收峰強烈地受配位環境的影響。
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4.3.3 影響吸收譜帶的因素1. 分子結構的變化：（1）飽和化合物中引入生色團和助色團（2）配位體場的改變：八面體、四面體、正方平面等等
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（3）共軛效應和超共軛效應由於共軛後的電子的運動范圍增大，躍遷所需的能量變小，所以由共軛作用產生的吸收峰波長值較大，同時吸收強度增大。共軛的不飽和健越多，紅移現象就越顯著。1,3—丁二烯在己烷中的λmax= 217nm，εmax = 21,000；1,3,5—己三烯在異辛烷中的λmax= 268nm，εmax = 43,000；1,3,5,7,9—癸五烯在異辛烷中的λmax= 334nm，εmax = 121,000。
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（4）空間位阻CH3CH3CH3H3C（a）（b）λmax(b) > λmax(a) 通常情況下，反式異構空間位阻小於順式異構，其共軛體系共平面性比順式結構好，躍遷能量較低，λmax較大。
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2. 溶劑效應溶劑的極性由非極性改變到極性時，精細結構消失，吸收帶變向平滑。
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改變溶劑的極性還會使最大吸收波長發生變化：當溶劑極性增大時，由n→π*躍遷產生的吸收帶發生紫移，而由π→π*躍遷產生的吸收帶發生紅移。
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3. 溫度溫度增高，分子碰撞頻率增加，譜帶變寬，譜帶精細結構消失(熱變色效應)。
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4.4 分析方法及其應用4.4.1 定性分析吸收光譜比較簡單，特徵性不強，並且大多數簡單官能團在近紫外光區只有微弱吸收或無吸收，所以應用有一定局限性。但可用於鑒定共軛生色團，以此推斷未知物的結構骨架，在配合其它結構分析方法時，是有用的輔助方法。
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（一）定性方法1. 比較吸收光譜曲線：形狀、峰數、λmax位置與相應的εmax。2. 用經驗規則計算λmax，然後與實測值比較。
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（二）經驗規則Woodward規則：計算共軛二烯、多烯烴、共軛烯酮類化合物π→π*躍遷最大波長。
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Oαβδδ+1γδ+2母體環己酮215nm 同環二烯39nm 增加兩個共軛雙鍵60nm 一個β烷基 12nm一個環外雙鍵5nm 三個γ+烷基54nm共計385nm
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AcOABCR母體同環二烯253nm增加兩個共軛雙鍵60nm三個環外雙鍵15nm五個取代烷基25nm共計353nm
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4.4.2 定量分析（一）單組分定量方法1．校正曲線法2．標准對比法AS= k CSb AX= k CXb CX = CS AX/ AS
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（二）多組分定量方法A1A+ B= ε1Abc1A+ ε1Bb c2BA2A+ B= ε2Ab c1A+ ε2Bbc2B
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【例】以分光光度法測定合金鋼中的錳和鉻。稱取1.000g鋼樣，溶解後稀釋至50.00mL，將其中的Cr氧化成Cr2O72-，Mn氧化成MnO4-，然後在440nm和545nm用1.0cm吸收池測得吸光度值分別為0.204和0.860。已知ε440Mn= 95.0 L.mol-1cm-1，ε440Cr= 369.0 L.mol-1cm-1，ε545Mn= 2.35×103L.mol-1cm-1， ε545Cr= 11.0 L.mol-1cm-1。求此合金鋼中Mn，Cr的質量分數。(MMn=54.94 g.mol-1MCr=52.00 g.mol-1)
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【解】 根據吸光度的加合性列出聯立方程：A440 = A440Mn+ A440Cr=ε440Mnb cMn+ ε440Crb cCrA545= A545Mn+ A545Cr=ε545Mnb cMn+ ε545Crb cCr即0.204 = 95.0 × 1 × cMn+ 369.0 × 1 × cCr0.860 = 2.35×103 × 1 ×cMn+ 11.0 × 1 ×cCr解得cMn= 3.64×10-4 mol.L-1cCr= 4.59×10-4mol.L-10.10%100%1.00054.941050103.64(Mn)－3－4=×××××=ϖ0.24%100%1.000252.001050104.59(Cr)－3－4=××××××=ϖ
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（三）雙波長法1. 等吸收波長法A1 = A1A+ A1BA2= A2A+ A2BΔA = A2 - A1= (A2A- A1A) + (A2B-A1B) 由於A2B= A1BΔA = A2A- A1A= (ε2A- ε1A) bc
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2. 系數倍率法該式表明，信號S只與被測組分的吸光度值有關。λλλλλλλλλλ−==−==−−+=−=λλ用差分放大器可獲得混和試樣在波長λ2和λ1處的差示信號S
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3. 測定渾濁試樣在雙波長法測定中，若將λ2設在試樣的吸收峰上， λ1設在試樣無特徵吸收的波長上，此時， λ1和λ2的背景吸收應相等。用雙波長法測得兩處吸光度的差值即可消除背景吸收，進行定量分析。
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（四）導數分光光度法對吸收光譜曲線進行一階或高階求導，即可得到各種導數光譜曲線。優點：1. 能夠分辨兩個或兩個以上完全重疊或以很小波長差重疊的吸收峰2. 能夠分辨吸光度隨波長急劇上升時所掩蓋的弱吸收峰3. 能夠確認寬闊吸收帶的最大吸收波長，解析度隨導數階數的增加而增加，信噪比隨著導數階數的增加而減小。
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定量分析：（可提高檢測的靈敏度）Aλ= ελbc，對波長λ 進行n次求導，只有Aλ和ελ是波長λ的函數，於是有：可見n次求導後，吸光度值仍與吸收物的濃度成正比。bcdddAdnnnnλλλλε=
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4.4.3 紫外一可見吸收光譜的應用1. 相對分子質量的測定M = εmb/A m：樣品重量在紫外、可見吸收光譜法中，只要化合物具有相同生色骨架，其吸收峰的λmax和εmax 幾乎相同。因此，只要求出與待測物有相同生色骨架的已知化合物的ε值，就能求出欲測化合物的相對分子質量。
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2. 測定平衡常數例 用分光光度法測定以下反應的平衡常數ZnL22-的λmax為480nm，該處的εmax＝3.00×103 L.mol-1.cm-1， Zn2＋和L2－在480nm處無吸收。用1.00cm的吸收池測得含2.30×10－4mol L－1 Zn2＋和5.00×10-4mol L－1 L2－溶液的吸光度為0.540。試計算平衡常數。−−+⇔+22222ZnLLZn
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解[][ ][][ ][][][ ][ ]().11040.11000.51080.1K1040.11080.121000.521000.51080.11030.21080.100.11000.3540.022×=××××=⋅×=××−×=+=⋅×=×−×=−=⋅×=××=ε=−−−−+−−−−−−−−−−−−+−−−−+＝則平衡常數為
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3. 結構分析例如，乙醯丙酮存在酮式和烯醇式兩種異構體在極性溶劑水中，以酮式異構體為主，形成分子間氫鍵，λmax為277nm；在非極性溶劑己烷中，以烯醇式異構體為主，形成分子內氫鍵，λmax為269nm。
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4. 氫鍵強度的測定[例] 丙酮 n→π* 的吸收帶水（極性）265.4 nm 即452.96 kJ.mol-1己烷 (非極性) 279.0 nm 即429.40 kJ.mol-氫鍵強度452.96 - 429.40 = 23.56kJ.mol-1
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思考題1.簡述紫外可見吸收光譜的產生。2.朗伯－比爾定律及其數學表達。3.光源的主要作用是什麼？4.各種類型紫外可見分光光度計的特點。5.有機化合物的吸收帶主要由哪幾類躍遷產生？6.影響吸收譜帶的因素有哪些？7.用Woodward規則計算計算共軛二烯、多烯烴、共軛烯酮類化合物π→π*躍遷最大波長。8.多組分定量方法以及雙波長法，導數法的特點9.紫外可見吸收光譜法的應用