⑴ 關於miRNA檢測肺癌的一些小問題~非常感謝！
而惡性腫瘤形成過程可影響miRNA 肺癌診斷和治療中的最新研究進展做一綜述。 形成過程中的一些組合成分
⑵ 表達miRNA一般採用什麼方法如通過質粒轉錄得到pri-miRNA還是pre-miRNA
質粒或者mimics轉染都可以 要穩定表達的話就用質粒構建病毒載體 連進質粒的序列pri或者pre多可以 一般是連pre再像兩邊延長一點 大概200bp吧
⑶ microRNA的檢測內容都有什麼
乳腺癌：乳腺癌是女性排名第一的常見惡性腫瘤，全世界每年約有120萬女性發病，約有50萬女性死於乳腺癌。乳腺癌的高發年齡多在25~64歲為多見。
宮頸癌：宮頸癌是最常見的女性生殖道惡性腫瘤。在全球范圍內，每年約有20多萬女性死於宮頸癌。中國每年新發現的病例為13.15萬，多發群體為40~60歲女性。
卵巢癌：卵巢癌是女性生殖器官常見的腫瘤之一，死亡率為各類婦科腫瘤的首位。約70%以上的卵巢惡性腫瘤確診時已經屬於晚期，五年生存率僅25%~30%。卵巢癌發病年齡范圍也是婦科腫瘤中最寬泛的，可以發生在女性一生中任何時期。
⑷ 檢測mirna與dna序列直接作用用什麼方法
microRNAs（miRNA）是一種大小約21-23個鹼基的單鏈小分子RNA，是由具有發夾結構的約70-90個鹼基大小的單鏈RNA前體經過Dicer酶加工後生成，不同於siRNA（雙鏈），但是和siRNA密切相關。據推測，這些非編碼小分子RNA（miRNA）參與調控基因表達，但其機制區別於siRNA接到的mRNA降解。第一個被確認的miRNA是在線蟲中發現的lin－4和let－7，隨後多個研究小組在包括人類、果蠅、植物等多種生物物種中鑒別出數百個miRNA。
miRNA有高等生物基因組編碼,通過和靶基因mRNA鹼基配對引導沉默復合體（RISC）降解mRNA或阻礙其翻譯。其在物種進化總相當保守，在植物、動物和真菌中發現的miRNAs只在特定的組織和發育階段表達，miRNA組織特異性和時序性，決定組織和細胞的功能特異性，表明miRNA在細胞生長和發育過程的調節過程中其多種作用。
microRNAs的作用機制
miRNA是一類多細胞動物或植物基因組的前體mRNA內含子，miRNA獨立轉錄單位或miRNA基因簇編碼的19-25個核苷酸大小的內源性單鏈RNA，他們在轉錄後水平沉默特定基因從而對生物體基因表達起到精細調節的作用[1]。絕大多數miRNA基因在RNA聚合酶Ⅱ的作用下形成較長的莖環結構，稱為初級miRNA（primary miRNA ,pri- miRNA）。pri- miRNA在Drosha-DGCR8復合體的作用下形成長度約60-70個核苷酸的發夾狀RNA，成為前體miRNA（precursor miRNA,pre-miRNA)。隨後，pre- miRNA在Exprotin－5復合物[2]的作用下被轉運出胞核，在胞漿中由Dicer剪切成為miRNA復合體， miRNA復合物（RNA－inced silencing comlex，RISC）[1]與該miRNA的3』翻譯區（3』UTR）結合到位於胞漿的P－body（processing bady）中[3]：如果miRNA與靶mRNA匹配完全，則該復合體降解mRNA；若兩者序列部分匹配，尤其是miRNA的5』端2-8個被稱為種子序列（seed sequence）的核苷酸與靶mRNA匹配完好，則通過抑制靶mRNA的翻譯來沉默特定基因。此外，某些miRNA，如miRNA－16能夠特異結合於某些基因3』UTA的富含AU元件（AU rich element,ARE）,指導Ago等組成RISC區的蛋白與TTP結合，從而改變相應mRNA的半衰期，加速靶mRNA的降解。
此外，miRNA也可能抑制5』UTR含有內部核糖體進入位點（intrnal ribosome entry sites,IRESs）的靶標分子[4]。
miRNA的表達調控機制
①順時調控元件 大多數miRNA基因的核心啟動子區域含有TA盒，並且含有影響miRNA表達的細胞特異轉錄調節元件。miRNAs作為轉錄因子重要的靶分子在細胞功能調控中發揮核心作用。
②表觀遺傳學 最近一些研究提示，表觀遺傳學變化會影響miRNA 基因，從而調節miRNA表達。分析基於miRNAse（release 8.0）資料庫的332個人miRNA基因序列時，發現其中155個miRNA的基因序列上游或下游2000bp處含有CG島在miR-127[6],miR-24a[6],let-7a-3[7]和miR－370[8]基因中，均含有CpG島，並且在相應地腫瘤組織中呈現高度甲基化，這些miRNA在腫瘤中的甲基化沉默將導致他們的靶基因－原癌基因（BCL6，CDK6和MAP3K8等）的表達，從而促進腫瘤發育。轉錄因子PRDM5可能參與了調解miRNAs基因的表觀遺傳學變化。在HEK293細胞中，PRDM5可以募集蛋白甲基化轉移酶G9a和一類組蛋白去乙醯基酶等組蛋白修飾到has－mir－135b基因的啟動子區域，行使抑制功能[9],miRNA在癌症細胞中的表達一般低於正常組織細胞，這表明多數miRNAs可能作為腫瘤抑制因子而發揮作用。原癌基因的低度甲基化和腫瘤抑制基因的高度甲基化被認為是癌症表觀遺傳學的主要決定因素。miRNAs基因在腫瘤中的異常甲基化使表觀遺傳學調控癌症機理更加復雜。
③單核苷酸多態性 存在於pri－mRNAs，pri－mRNA或成熟miRNAs基因序列中的單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）能夠潛在地影響miRNA調節的細胞功能網路。miRNA基因或靶結合位點及其臨近靶位點區域的多態變化時，於miRNA的生物合成及靶位點選擇和抑制效應據重要的意義。
④RNA編輯 （RNA editing）是基因在初級轉錄物上增刪或取代某些核苷酸而改變遺傳信息的過程，從而可調節基因的表達。RNA編輯在miRNA調控基因默過程中其重要作用，不僅影響miRNA表達，而且影響特異miRNA的靶向分子的調控。此外，At編輯也有可能存在於靶分子的種子互補區域。
⑸ 檢測腫瘤細胞中某一種miRNA比如miR-183，需要用到哪些試劑盒怎麼做呢
不用哪些。。。買個銳博的miRNA檢測試劑盒就行了 100次的才兩三百 非廣告 只是我只用過他們家的 別的公司應該也有 當然提RNA 反轉錄啥的也是需要各種試劑啦
⑹ 如何用qrt-pcr檢測mirna的表達水平
miRNA通過與轉錄本的相互作用，關閉或抑制基因的表達。
最近的研究表明它們影響了約三成的基因。
miRNA在多個組織中差異表達，這就讓表達圖譜分析成為研究的重點。
同時，miRNA的過表達和抑制也是近年來常用的研究方法。
⑺ 求助檢測miRNA的半衰期和穩定性的方法
葯物制劑的穩定性問題可以歸納為以下三方面。
（一）化學方面葯物與葯物之間或葯物與溶劑。附加劑，形劑、容器、外界物質（空氣、光線、水分等）雜質（夾雜在葯物或附加劑等之中的金屬離子、中間體、副產物等）產生化學反應反而導致葯劑的分解。
（二）物理學方面例如乳劑的乳析、分裂、混懸劑中顆粒的結塊或粗化，某些散劑的共熔，芳香水劑中揮發性油揮發逸散、片劑在貯藏中崩解性能的改變，浸出制劑的發等使葯劑的原有質量變差甚至不合，醫葯使用要求。一般而言，物理方面的不穩定性部問題僅是葯物的物理性質改變，但葯物的化學結構不變。
（三）生物學方面由於微生物的滋長，引起葯劑發霉、腐敗或分解。由於上述原因，往往引起下列一種或向種後果：①產生有毒物質。一旦發現這種情況，葯劑就應停止使用；②使葯劑療效減低或副作用增加。這種情況比較多見；③病人使用不變，如混懸劑中的葯物沉澱成硬餅狀，使用時不僅不便而且可能造成每次劑量不準確；④有時雖然葯物分解的理極少，葯劑的葯療效，含量、毒性等可能改變不顯著，但因為產生較深的顏色或少量的微細沉澱（例如注射液），因而不能供葯用。本章主要討論葯物水溶液的由於化學變化不穩定性及其克服的方法。，對化學動力在葯物制劑穩定性試驗中的應用，也作了初步介紹。有些無機葯物水溶液的穩定性也很差（如漂白粉、碘化、過氧化氫等），但反應比較簡單，常用的制劑也不多，所以本章中不予敘述。
⑻ 如何預測和鑒定miRNA的靶基因
免疫沉澱
當然，確定miRNA與mRNA之間的互作，我們還有更直接的方法，那就是從實驗上尋找物理相互作用。我們可以利用RNA誘導沉默復合物（RISC）中的Argonaut（AGO）蛋白的抗體進行免疫共沉澱（co-IP）。生物通 www.ebiotrade.com
目前更先進的方法是通過紫外線照射以交聯復合物，然後開展深度測序以鑒定發現的RNA，這種方法被稱為紫外交聯免疫沉澱結合高通量測序（HITS-CLIP），或CLIP-seq。利用這種方法來尋找miRNA的靶基因，能夠明顯降低miRNA結合位點的假陽性預測率，並且縮小miRNA結合位點的空間范圍，可在全基因組范圍內鑒定AGO蛋白與不同RNA上的結合。現在有多家公司提供CLIP-seq服務，如銳博生物。
Clontech公司（Takara旗下）也推出了一種新工具，能協助鑒定細胞中的miRNA靶點。這一工具名為MirTrap系統。它利用RISC蛋白的顯性失活突變體，允許miRNA與其目標結合，但限制進一步的加工。此亞基整合到內源的Argonaute/RISC復合物中，並「鎖定」miRNA-目標mRNA。顯性失活亞基上的DYKDDDDK（FLAG表位）標簽有助於整個Ago/RISC復合物的捕獲和分離。這樣就能實現miRNA及其目標的免疫沉澱，從而通過新一代測序或定量PCR來鑒定或定量。生物通
整個過程大致如下：
1. 創建miRNA模擬物。生物通 www.ebiotrade.com
2. 將這些miRNA模擬物和pMirTrap載體共轉染到哺乳動物細胞，並孵育24小時。同時利用miR-132、pMirTrap載體和pMirTrap對照載體開展對照轉染。
3. 利用附帶的MirTrap分離試劑盒裂解轉染後的細胞培養物。生物通 www.ebiotrade.com
4. 利用分離試劑盒中的磁珠對RISC復合物（其中包括靶標mRNA）進行免疫沉澱。
5. 利用附帶的NucleoSpin RNA XS試劑盒分離與磁珠結合的靶標mRNA。
6. 通過qPCR或新一代測序分析分離出的RNA，鑒定出特定miRNA的靶標mRNA。
Sigma-Aldrich的MISSION Target ID cDNA文庫讓研究人員能夠在實驗室內開展全轉錄組范圍的miRNA和ncRNA靶基因鑒定。它是個全轉錄組范圍的cDNA文庫。在文庫轉染和選擇之後，細胞被已知miRNA轉染。對於那些包含與miRNA相互作用的cDNA的細胞，它們將生存到第二輪。那些選擇出的cDNA可通過測序來鑒定。這樣，研究人員只需投入很少，就能實現大范圍的篩選。
靶基因的驗證
預測終歸是預測，miRNA的靶基因還必須經過驗證。這個過程與一開始尋找靶基因的過程相似，也就是抑制或過表達miRNA，然後檢查mRNA或蛋白水平的反應。生物通 www.ebiotrade.com
目前最常用的方法是熒光素酶報告基因法。首先，構建熒光素酶表達載體，將希望鑒定的miRNA靶基因的3』UTR插入熒光素酶基因的3』UTR中，然後將構建好的重組載體轉染到細胞中，並改變miRNA的表達水平，最後檢測熒光素酶的表達情況，以分析3』UTR中是否含有miRNA的靶位點。
目前有多家公司提供熒光素酶報告載體或構建服務。Promega就提供pmirGLO雙熒光素酶表達載體。它採用螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶這兩種報告基因，其中螢火蟲熒光素酶（luc2）作為主要報告基因，其表達減少意味著內源性的或外源引入的miRNA 與克隆的miRNA 的靶序列發生了結合；海腎熒光素酶/新黴素基因（hRluc-neo）作為對照報告基因，既能實現歸一化處理，又能篩選穩定轉染的細胞系。這樣就以一個載體實現了以往兩個載體的功能。
就目前而言，預測和鑒定miRNA靶基因的方法雖然不少，但仍然沒有一種常規方法。隨著計算機演算法的不斷改進和生物學技術的快速發展，這種現狀有望改變。讓我們拭目以待吧。（生物通 余亮）
⑼ 如何從提取的RNA中篩選出miRNA
是否是已知的miRNA？
如果是已知的miRNA，我建議你到Sanger網站檢索一下序列，然後合成相應探針進行NorthernBlot確證，或者利用RT-PCR克隆相應片段進行測序，等等，具體用什麼檢測方法要取決於你的課題需要。（引用，僅供參考）
⑽ 如何篩選目的基因的miRNA
提取總DNA進行PCR只有mRNA可以PCR，其他的自然被淘汰了