國標檢測總大腸桿菌的方法

1. 大腸桿菌檢測方法國標是用什麼方法檢測的

大腸桿菌檢測方法分為三種：

1、細菌分離鑒定法

分離培養與鑒定：糞便標本直接接種腸道桿菌選擇性培養基。血液先經肉湯增菌，然後轉種血瓊脂平板。其他標本同時接種血瓊脂平板和腸道桿菌選擇性培養基。

37℃孵育18～24小時後，觀察菌落塗片染色鏡檢。腸致病性大腸桿菌須先作血清學定型試驗。必要的時候檢定腸黴毒素。

2、衛生細菌學檢查法

大腸桿菌會不斷隨糞便排出體外，污染周圍環境水源、食品等。取樣檢查時，樣品中大腸桿菌越多，則表示樣品被糞便污染的越嚴重，表明樣品中存在腸道致病菌的可能性也就越大。

大腸菌數指數：指每立升中大腸菌群數，採用乳糖發酵法檢測。中國衛生標準是每1000ml飲水中不得超過3個大腸菌群，瓶裝汽水和果汁中每100ml大腸菌群不能超過5個。

3、全自動微生物定量分析儀（TEMPO）檢測法

全自動微生物定量分析（TEMPO）儀大腸桿菌群計數檢測有TEMPOTC和TEMPOCC兩種方法。

TEMPOTC的開發是為獲得NF ISO4832標准相當性能水平。

TEMPOCC法是TEMPO儀器上根據BAM方法專門用於24h計數食品中大腸桿菌群方法。

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大腸桿菌在生物技術中的應用

這些菌株由於失去了細胞壁等重要組分，所以在自然條件下已無法生長。甚至普通的清潔劑都可以輕易地殺滅這類菌株。即便由於操作不慎導致活菌從實驗室流出，也不易導致生化危機。

生物工程用的菌株基因組都被優化過，使之帶有不同基因型（例如β半乳糖苷酶缺陷型），可以更好的用於分子克隆實驗。

真核基因在大腸桿菌中表達，必須有合適的表達載體(Vector),常用載體：pBV220,pET系統。

目的基因在大腸桿菌中表達的情況：

大腸桿菌更適合原核基因的表達，外源基因表達產量與單位體積產量是正相相關的，外源基因拷貝數和表達 產物產量之間存在動態平衡，單個細胞的產量又與外源基因拷貝數，基因表達效率，表達產物的穩定性和細胞代謝負荷等因素有關。

2. 乳品中大腸桿菌檢測國標GB/T4789.38-2008的具體步驟及達標的標准

第一法大腸桿菌MPN 計數

操作步驟
6.1、 樣品的稀釋
6.1.1、 固體和半固體樣品：以無菌操作取259 樣品，置盛有225 mL 磷酸鹽緩沖液的無菌均質杯內，8000r / min ～1000r/ min 均質1 min～2 min ，製成l:10 樣品勻液，或置盛有225 mL 磷酸鹽緩沖液的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1 min～2 min 製成1:10 的樣品勻液。
6.1.2、 液體樣品：以無菌吸管吸取樣品25 mL 置盛有225 mL 磷酸鹽緩沖液的無菌錐形瓶（瓶內預置適當數量的玻璃珠）中，充分振搖，製成1:10 的樣品勻液。
6.1.3、 樣品勻液的pH 值應在6.5～7.5 之間，必要時分別用1mol/L 氫氧化鈉（NaOH）或1mol/L 鹽酸（HCI）調節。
6.1.4、 用1mL 無菌吸管或微量移液器吸取1:10 樣品勻液1mL ，沿管壁徐徐注人盛有9 mL 磷酸鹽緩沖液的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支1mL無菌吸管或吸頭反復吹打，使其棍合均勻，製成1:100 的樣品勻液。
6.1.5、 根據對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次製成10 倍遞增系列樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15 min 。
6.2、 初發酵試驗
每個樣品，選擇3 個適宜的連續稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液）。每個稀釋度接種3 管月桂基磺酸鹽胰蛋白陳（LST ）肉湯，每管接種1 mL（如接種量超過1 mL ，則用雙料LST 肉湯）。36℃±1℃ 培養24h±2h ，觀察小倒管內是否有氣泡產生，如未產氣則繼續培養至48h±2h 。記錄在24h～48h 內產氣的LST 肉湯管數。如所有LST 肉湯管均未產氣，即可報告大腸桿菌MPN 結果；如有產氣者，則進行復發酵試驗。
6.3、 復發酵試驗
用接種環分別從所有培養48h±2h 內發酵產氣的LST 肉湯管中取培養物1 環，移種於已提前預溫至45 ℃ 的EC 肉湯管中，放人帶蓋的44.5℃ ±2 ℃ 水浴箱內。水浴的水面應高於肉湯培養基液面，培養24h±2h ，檢查小倒管內是否有氣泡產生，如未產氣則繼續培養至48h ±2h 。記錄在24h 和48h 內產氣的EC 肉湯管數。如所有EC 肉湯管均未產氣，即可報告大腸桿菌MPN 結果；如有產氣者，則進行EMB 平板分離培養。
6.4、 伊紅美藍平板分離培養
輕輕振搖各產氣管，用接種環取培養物劃線分別接種於EMB 平板，36 ℃ ±1 ℃ 培養18h～24h 。檢驗平板上有無具黑色中心有光澤或無光澤的典型菌落。
6.5、 營養瓊脂斜面或平板培養
從每個平板上挑5 個典型菌落，如無典型菌落則挑取可疑菌落。用接種針接觸菌落中心部位，移種到營養瓊脂斜面或平板上，36 ℃ ±1 ℃ ，培養18h～24h 。取培養物進行革蘭氏染色和生化試驗。
6.6 、生化試驗
6.6.1、 靛基質試驗：將培養物接種蛋白陳水，36 ℃±1℃ 培養24h±2h 後，加Kovacs 靛基質試劑0.2 mL～0.3 mL ，上層出現紅色為靛基質陽性反應。
6.6.2 、MR -VP 試驗：將培養物接種MR -VP 培養基，36 ℃ ±1 ℃ 培養48h±2h 。移取培養物1mL至13 mm×100mm 試管中，加5 % α-蔡酚乙醇溶液0.6mL、40 ％氫氧化鉀溶液0.2mL 和少許肌酸結晶，振搖試管後靜置2h ，如出現伊紅色，為VP 試驗陽性。
將MR 一VP 培養液的剩餘部分再培養48h 後滴加5 滴甲基紅指示劑。培養物變紅色，為甲基紅試驗陽性，若變黃色則為陰性反應。
6.6.3、 檸檬酸鹽利用試驗：將培養物接種Koser 氏檸檬酸鹽肉湯，36℃±1 ℃ 培養96h±2h,記錄有無細菌生長。
6.7、 大腸桿菌MPN 計數的報告
大腸桿菌為革蘭氏陰性無芽胞桿菌，發酵乳糖、產酸、產氣，IMViC 生化試驗為＋＋- -或-＋- -。只要有1 個菌落鑒定為大腸桿菌，其所代表的LST 肉湯管即為大腸桿菌陽性。依據LST 肉湯陽性管數查MPN 表，報告每克（或毫升）樣品中大腸桿菌MPN 值。

第二法大腸桿菌VRB - - MUG 平板計數法

8、樣品稀釋
按6.1 進行。
9、 檢驗
選取2 個～3 個適宜的連續稀釋度的樣品勻液，每個稀釋度分別取1 mL 注人兩個無菌平皿。另取1 mL 稀釋液注人一個無菌平皿中，作空白對照。將45 ℃±0.5 ℃ 的VRB 瓊脂10 mL～15 mL 傾注於每個平皿中。小心旋轉平皿，將培養基與樣品勻液充分混勻。待瓊脂凝固後，再加3 mL～4mL VRB-MUG 瓊脂覆蓋平板表層。凝固後翻轉平板，36 ℃±1 ℃ 培養18h～24h 。選擇菌落數為10～ 100 的平板，暗室中360 nm～366 nm 波長紫外燈照射下，計數平板上發淺藍色熒光的菌落。
檢驗時用已知MUG 陽性菌株（如大腸桿菌ATCC 25922 ）和產氣腸桿菌（如ATCC 13048 ）做陽性和陰性對照。

10、 大腸桿菌平板計數的報告
兩個平板上發熒光菌落數的平均數乘以稀釋倍數，報告每克（或毫升）樣品中大腸桿菌數，以CFU/g ( CFU /mL ）表示。

第三法大腸桿菌PetrifilmTM 測試片計數法

12、 樣品稀釋按6.1 進行。
13、 檢驗
13.1、 接種和培養
選取2 個～3 個適宜的連續稀釋度的樣品勻液，每個稀釋度接種兩張測試片。將測試片置於平坦實驗檯面，。揭開上層膜，用吸管吸取樣品勻液1ml勻液垂直滴加在測試片的中央，將上層膜緩慢蓋下，避免氣泡產生和上層膜直接落下，將壓板（平面底朝下）放置在上層膜中央處，輕輕地壓下，使樣品勻液均勻覆蓋於圓形的培養膜表面，切勿扭轉壓板。拿起壓板，靜置至少1 min 以使培養基凝固。將測試片的透明面朝上置於培養箱內，堆疊片數不超過20 片，36℃±1 ℃ 培養。肉、家禽和水產品，培養時間為24h±2h；其他食品，培養時間為48h±2h 。
13.2、 判讀
可肉眼觀察計數，或用菌落計數器、放大鏡、PetrifilmTM 自動判讀儀計數。藍色有氣泡的菌落確認為大腸桿菌，不論藍色的深淺，部分藍色的帶氣泡菌落也判定為大腸桿菌。圓形培養膜邊緣及邊緣以外的菌落不計數。當測試片出現大量氣泡、不明顯的小菌落，培養區呈藍色時，需要進一步稀釋樣品勻液，重新檢驗。 14 大腸桿菌測試片計數的報告
選擇菌落數在15～150 之間的稀釋度，兩張測試片菌落平均數乘以稀釋倍數，即為每克（或毫升）樣品中大腸桿菌數，以CFU/g ( CFU/mL ）表示。
如果所有稀釋度測試片上的菌落數都小於15 ，計數最低稀釋度測試片上的平均菌落數乘以稀釋倍數報告；如果所有稀釋度的測試片上均無菌落生長，以「小於1 乘以最低稀釋倍數」報告；如果所有稀釋度的菌落數都大於150 ，計數最高稀釋度測試片上的平均菌落數乘以稀釋倍數報告。計數菌落數大於150 個的測試片時，可計數一個或兩個具有代表性的方格內的菌落數，換算成單個方格內的菌落數後乘以20 ，即為測試片上估算的菌落數（圓形生長面積為20 cm " ）。

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3. 大腸桿菌檢測國家標准

法律分析：大腸菌數指數：指每立升中大腸菌群數，採用乳糖發酵法檢測。 中國衛生標準是每1000ml飲水中不得超過3個大腸菌群，瓶裝汽水和果汁中每100ml大腸菌群不能超過5個。

法律依據：《中華人民共和國食品安全法》 第四條 食品生產經營者對其生產經營食品的安全負責。食品生產經營者應當依照法律、法規和食品安全標准從事生產經營活動，保證食品安全，誠信自律，對社會和公眾負責，接受社會監督，承擔社會責任。

4. 大腸桿菌與大腸菌群檢測方法

進入無菌室步驟
1． 進入無菌室前應打開紫光燈進行滅菌，時間為0。5—1小時。
2． 關燈後0•5小時後放可進入。
3． 進入更衣間更換衣服，佩帶口罩、帽子、鞋套
實驗步驟
1， 進入無菌室後，先把酒精燈點燃，然後在用酒精棉進行手部消毒。（酒精棉是用75%的酒精加入脫脂棉中製成）
2， 准備雙料管3根，單料管6根，培養皿7個。
3， 直接從原液中吸取10ml放入雙料管，（3根每根各10ml）
4， 再吸取原液1ml放入單料管中（3根每根各1ml）
5， 再吸取原液1ml放入培養皿中（2個培養皿各1ml）
6， 再吸取原液1ml放入鹽水管中製成－1梯度的樣液
7， 更換一根吸管，從－1梯度的樣液吸取1ml樣液放入單料管中（3根每根各1ml）
8， 再吸取－1梯度樣液1ml放入培養皿中（2個培養皿各1ml）
9， 再把每個培養皿中到入營養瓊脂平鋪底部搖允（注另作3個培養皿：空氣空白，把培養皿打開十分鍾倒入營養瓊脂平鋪底部搖勻。瓊脂空白，把培養皿中倒入營養瓊脂平鋪底部搖勻。鹽水空白，吸1ml生理鹽水放入培養皿中，倒入營養瓊脂平鋪底部搖勻。）
10， 把全部作好的放入培養箱中，溫度36C＋－1×C，大腸24H＋－2H，菌落48H＋－2H，（待培養皿中的瓊脂凝固後反轉過來放入培養箱中）
11， 梯度：－1梯度為1ml原液加入9ml生理鹽水配成
－2梯度為1ml－1梯度樣液加入9ml生理鹽水配成
－3梯度－4梯度配製方法和－1、－2梯度的配製方法一樣
12， 如果大腸初發酵產生氣泡，用接種筆沾一個產氣的液在伊紅美蘭平板上畫之字形然後放入培養箱中36C，24H＋－2H 。（接種筆在每次使用前必須在酒精燈上消毒。所畫之形不能劃破伊紅美蘭瓊脂表面）
13， 取出後在用接種筆在伊紅美蘭平板之字形上挑菌，放入乳糖復發酵管中 ，然後再培養36C＋－1C，24H＋＋－2H。
14， 再在伊紅美蘭平板之字形上挑菌，放到載玻片上作鏡檢。（方法見標准）
15， 只有鏡檢成紫紅色和乳糖復發酵管產氣同時成立的情況下，才能斷定這根管是不合格。
16， 清洗消毒這根試管前必須進行消毒黴菌，121C，0。5小時同時不能放氣。

5. 大腸桿菌國標檢測方法

sn/t0169-2010?