內毒素檢測有哪些方法

① 細菌內毒素中什麼是定量法

目前,國內外廣泛應用且檢測技術比較成熟的細菌內毒素定量檢查法主要有以下四種。
1. 1凝膠法是目前最常用的細菌內毒素檢查法。即在10mm×75mm的小試管內,加入待檢樣品和鱟試劑各0. 1ml混合, 37℃、60 min保溫反應後, 180°倒轉,根據凝膠形成的情況(凝膠是否堅實)作為判定指標的一種半定量法。此法操作簡單,經濟而且不需要專用儀器。凝膠法既可限量檢測內毒素,也可在0. 03 EU•ml-1以上進行半定量測定。
1. 2顯色基質法(合成基質法、顯色合成基質法, Chromoge-nic Technique)系根據細菌內毒素與LAL(或TAL)試劑中的C系反應所激活的凝固酶,使用人工合成的鱟三肽(即與PNA相連的顯色基質如BOC-LEU-GLY-ARG-PNA等)作為顯色基質,水解鱟三肽中的精氨酸肽鏈,通過測量反應液中釋放出遊離的對硝基苯胺(PNA)的吸光值而進行定量的一種檢測方法。該法需要專用儀器。目前主要用於微量血漿、血清、全血、骨髓液及尿、乳汁等的臨床檢驗以及家禽、實驗動物、人工臟器的安全性評估等方面。根據測定原理的不同分為終點顯色法和動態顯色法。
1.2.1終點顯色法(EndopointColorimetric Assay)系根據在一定時間內游離出的PNA的量與細菌內毒素濃度成正比例關系進行測定的一種分析方法。PNA(黃色)的吸光度值可使用單波長405 nm或雙波長(測定波長405 nm、參照波長492 nm)測量,或利用游離的PNA與紅色偶氮試劑發生反應所形成的紅色偶氮藍復合物在545nm單波長或雙波長(測定波長545 nm、參照波長630 nm)進行檢測。一般可在0. 006~15 EU/ml范圍內進行定量。
1.2.2動態顯色法(Kinetic Colorimetric Assay)系根據游離的PNA的吸光度變化率(mAbs/min)與細菌內毒素濃度成正比例關系(比色反應速度法Pate Assay)或到達事先設定的反應吸光度變化值所需要的時間Ta的對數值與細菌內毒素濃度的對數值成反比例關系(比色反應時間法OD-Time As-say)進行測定的一種分析方法。一般可在0. 006~50 EU/ml范圍內進行定量。
1. 3酶聯免疫測定法(ELISA法)基於抗原抗體的酶聯免疫測定法,目前在國外應用十分普遍。主要由外加熱原質刺激巨嗜細胞後產生的內熱原物質(如TNF, TL-1等),而進行的定量測定方法。體外人全血熱原檢測方法是近年來國內外正在興起的一種研究熱原檢測的新方法,具有檢測范圍廣,靈敏度高,不同個體血液的結果差異小等優點[2, 3]。國內一些學者,已採用酶聯免疫測定法對體外人全血熱原檢測方法的可行性進行研究和優化,取得了可喜的進展[4]。1. 4濁度法(Turbidim etrc Technique)系微量的內毒素與TAL(LAL)試劑中的C因子發生反應,由內毒素引發激活的凝固酶,切斷凝固蛋白特定位置的精氨酸肽鍵,形成凝固蛋白從而產生凝膠過程中的濁度變化,採用適當的光學儀器測量的一種分析方法。此法操作比較簡單、經濟、靈敏度高,檢測范圍廣。通常在0. 006~300 EU/ml的范圍內進行定量,但需要專用儀器。根據測定原理的不同又可分為終點濁度法和動態濁度法。
1.4.1終點濁度法(EndopintTurbidimetric Technique)即根據到達規定點上反應液的最終濁度值(吸光度或透過光亮值)與細菌內毒素濃度成正比例或反比例的關系而進行測量的一種檢測方法。由於未形成標准化,目前國內外都很少使用,也未見有專門儀器使用。
1.4.2動態濁度法(Kinetic Turbidimetric Technique)即根據測定到達事先設定反應液的濁度變化(吸光度變化)值所需要的時間(Ta比濁反應法)或濁度變化(透過光量比)值所需要的時間(Tg:比濁時間分析法)的對數值與細菌內毒素濃度的對數值成反比例關系或濁度的(吸光度值)每分鍾變化(吸光度變化mAbs/min)與細菌內毒素濃度成正比例關系(比濁反應速度法)而進行測量的一種分析方法。通常,濁度法一般是指動態濁度法,而且在日、美、歐等國有專用儀器,並通過美國FDA認可,其中作為動態比濁儀一般要求為:恆溫槽(37±1℃)、光源、檢測器及內置數據分析等。其中檢測波長從80~660 nm,主要根據儀器的不同而各異,檢測時間為60~90 min之間。由於國內對細菌內毒素定量檢查法的研究起步較晚,專門用於定量的高靈敏度TAL(最低檢測限是0. 006EU/ml)還未研製開發出來,還受細菌內毒素檢查用水(內毒素的含量小於0. 005 EU/ml)、內毒素標准品質量不高等因素的制約,對儀器定量法研究較多且檢測技術較為成熟的就是動態濁度法。本法收載於2000年版《中國葯典》二部附錄中,在2005年版《中國葯典》二部附錄中,將濁度法和顯色基質法修訂為光度測定法,作為測定內毒素含量的方法。

② 內毒素的檢測

由於內毒素是細菌死亡裂解或自溶引起的，因此環境中大量存在內毒素。當內毒素通過機體消化道等方式時並無危害，少量通過注射等方式進入血液後被肝臟枯否細胞滅活，不造成機體損害。內毒素大量進入血液就會引起發熱反應—「熱原反應」。內毒素大量進入、集聚於血液中，超過機體各自衛系統的清除能力，則可導致不同程度的內毒素血症。對於易於引入內毒素的葯品醫療器械等必須通過內毒素檢測。內毒素的檢測常用家兔熱原法和鱟試驗法。中國葯典收錄的細菌內毒素檢查法包括2種方法：凝膠法和光度法，使用鱟試劑來定性或定量檢測內毒素。

③ 內毒素測定內毒素測定方法

內毒素測定方法主要包括凝膠法和多種定量檢測方法。

首先，凝膠法是基於鱟試劑與內毒素之間的凝集反應。通常，鱟試劑的規格為0.1ml/支或0.5ml/支，使用時需用除熱原水溶解。操作時，通過觀察是否有凝膠形成來判斷反應終點。這種方法簡便易行，經濟實惠，無需專用設備，適用於定性或半定量檢測。

其次，動態濁度法和終點濁度法是通過測量內毒素對光或光線的散射程度，隨時間變化的濁度變化來定量檢測內毒素。這種方法提供了連續的測量過程，精度較高。

動態顯色法與終點顯色法則利用內毒素與特定試劑反應後產生的顏色變化，通過對比標准曲線來確定內毒素的含量，是一種更為精確的定量檢測手段。

總的來說，以上這些方法各有特點，凝膠法適合初步篩查，而動態濁度法和顯色法則適用於需要精確定量的數據分析。

細菌內毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁上的一種脂多糖（LipopolySaccharide,LPS）和蛋白的復合物，當細菌死亡或自溶後便會釋放出內毒素。內毒素大量進入血液就會引起發熱反應—「熱原反應」。內毒素與多種感染疾病密切相關，病情惡化往往伴隨著內毒素含量的增加，病情緩解也常伴隨著內毒素含量的減少。因此，快速檢測（1小時）血液、臟器內毒素含量可以為臨床相關疾病的診斷預後提供參考。