不流失菌的實驗檢測方法

⑴ 布魯氏菌病檢測的新方法，新技術有哪些

（1）血清凝集試驗 試管法乃直接檢測脂多糖抗原的抗體，效價≥1:160為陽性，但注射需亂菌苗後也可呈陽性，故應檢查雙份血清，若效價有4倍或以上增長，乃提示近期布氏桿菌感染。
（2）酶聯免疫吸附試驗（ELISA） 該法的陽性率高於凝集試驗，且檢測IgM及IgG的敏感性相似。因慢性患者的抗體屬IgG型，故本法可同時用於急、慢性病人的診斷。近來有採用親和素酶聯試驗，較ELISA更敏感。
（3）2-巰基乙醇（2-ME）試驗 本法可檢測IgG，用於鑒別自然感染與菌菌免疫。自然感染達1個月後，體內凝集即以IgG型為主（初為IgM型），該IgG對2-ME有耐受性；而菌菌免疫後3個月內的凝集素均以IgM為主，可為2-ME所破壞。
（4）補結試驗 補結抗體亦屬IgG，病程第3周的效介可超過1:16。本試驗的陽性率高於凝集試驗，特異性亦高，但出現時間晚於凝集試驗。
（5）人球蛋白試驗 病人尚可產生一種不完全抗體，後者雖可與抗原結合，但肉眼不可見。當將抗人球蛋白免疫血清加入抗原-不完全抗體復合物中，即出現直接可見的反應。不完全抗體出現早而消失晚，故可用於急、慢性期病人的診斷。鑒於本法操作復雜，只適用凝集試驗陰性的可疑病人，效價>1:80為陽性。
（6）皮內試驗 布魯菌素皮試乃為一種延遲超敏反應，24～48小時觀察結果。僅有局部紅暈而無腫塊者為陰性，局部紅腫和硬快的直徑達2～6cm者為陽性。皮試在病程6個月內的陽性率很低，慢性期患者幾近100%呈陽性或強陽性反應。
（7）其他免疫試驗 有反向被動血凝試驗、放射免疫、間接免疫熒光試驗等，因操作復雜，不適於普遍採用。

⑵ 實驗室檢測家畜布氏桿菌病的方法主要有哪些

1．血象白細胞半數正常或輕度減少，淋巴細胞相對或絕對增多，分類可達60%以上。血沉在各期均增速。久病者有輕或中度貧血。 2．細菌學檢查患者血液、骨髓、乳汁、子宮分泌物均可做細菌培養。因牛種菌初分離困難。要求嚴格的環境，故各種標本最好採集兩份，一份用含肝浸液的肉湯做培基，在CO2孵箱中培養；另一份放一般環境中孵育，培養時間不得短於2周。急性期陽性率高，慢性期低。骨髓標本較血液標本陽性率高。有人建議慢性布魯氏菌病患者的血液接種到雞胚卵黃中可獲較高陽性率。 3．免疫學檢查 （1）血清凝集試驗（Wright試驗）試管法較靈敏。患者多在第二周出現陽性反應，1：100以上有診斷價值。病程中效價遞增4倍及以上意義更大。正常人可有低滴度的凝集素；某些傳染病的假陽性率可達30%以上，如兔熱病該凝集效價升高；注射霍亂疫苗的人90%可呈假陽性；接種布魯氏菌活菌苗者，凝集效價也增高。診斷時要注意分析。另外由於抗體IgA、IgG、IgM量的比例不同，如IgA含量高則可出現患者血清低稀釋度為陰性，高稀釋度反為陽性的所謂前帶現象。因此做該實驗時應增大患者血清稀釋范圍。 （2）補體結合試驗補體結合抗體主要為IgG，出現較遲，持續較久，一般1：16以上即為陽性。對慢性患者有較高特異性。 （3）抗人球蛋白試驗（Coombs』tist）用於測定血清中的不完全抗體。不全抗體可阻斷完全抗體與抗原的凝集反應，使凝集試驗呈假陰性。Coombs試驗是使不完全抗體與不可見抗原結合的復合物通過抗人球蛋白血清結合成塊，直接可見。故凝集試驗陰性者可作此檢查。

⑶ 布魯氏菌病診斷標准及處理原則的附錄A

布魯氏菌病診斷的特異性實驗室檢查技術
（補充件） A1.1 血培養
A1.1.1 雙相培養基培養：無菌從可疑病人靜脈取血液4～5mL，在酒精燈火焰附近將血液注入5～6支含雙相培養基的中試管內，或2～4隻含雙相培基燒瓶中，輕輕混合傾斜，使被檢血液分布在瓊脂斜面上，置37℃溫箱培養，如果懷疑病人是牛種布魯氏菌感染時，應有一半標本置CO（下標始）2（下標終）環境中培養，三天後觀察結果，如未見布氏菌生長，可按上法再傾斜，使血液塗在瓊脂斜面上，繼續培養，每隔一天觀察一次，如有可疑布魯氏菌落，可用鉑金耳勾出接種到瓊脂試管培基，獲得純培養，進一步作布氏菌鑒定，血培養二十天仍不出菌，可定為陰性。
A1.1.2 接種未受精雞卵法：取新鮮雞蛋兩個，把雞蛋放在固定架上，銳端向上，以碘酒和酒精依次消毒蛋殼，用眼科手術刀在頂部穿一小孔，用三厘米長注射針頭將被檢血液徐徐注入卵黃中，每個雞蛋接種血液0.2mL，立即用滅菌石蠟將孔密封，置37℃溫箱中培養，五天後把接種血液的雞蛋無菌打開，用滅菌的毛細管把接種血液部分的卵黃及蛋清吸出0.5～0.6mL，接種2～3支斜面培養基上，置37℃培養，2～3天觀察一次，15天仍不見可疑菌落生長，定為陰性。
A1.2 骨髓培養
用滅菌的導尿管將尿液導出放入滅菌容器中，為濃縮細菌，提高檢出率，可在尿液中加入1%～3%的高價布魯氏菌免疫血清，混合後，置37℃溫箱2h，高速離心沉澱，取沉澱物0.5mL接種在選擇性培基上培養，或注射豚鼠，用生物學法分離布魯氏菌。
A1.3 其他病原材料培養
由乳，腦脊液，關節液和滑囊液分離布魯氏菌，將液體標本無菌地接種到瓊脂斜面上，或培養平板上，塗布於培基表面，參照血培養法觀察結果，15天仍無可疑菌生長，定為陰性。
A1.4 生物學分離布魯氏菌法
為了提高對布魯氏菌的檢出率和從污染的材料中分離布魯氏菌，將被檢材料（固體標本加滅菌的生理鹽水研碾成漿液態）經皮下或腹腔注射豚鼠或小白鼠，豚鼠接種1mL，小鼠接種0.5mL，接種豚鼠，即可觀察血清變態反應情況，又可作細菌分離培養，小鼠感染後二十天解剖取臟器培養，豚鼠接種後三十天解剖取臟器培養。 A2.1 平板凝集試驗（PAT)
A2.1.1 器材及試劑
赫德遜氏凹玻板或一塊清潔無油脂玻璃板，平板凝集抗原，被檢血清，已知陰性和陽性血清，0.1mL吸管或微量加樣器，牙簽或細鐵絲。
A2.1.2 操作方法
A2.1.2.1 備方形潔凈的玻璃板，劃成25個方格（或更多），橫數5格，縱數5格，第一列各格寫下血清號碼。
A2.1.2.2 用0.1mL吸管按下列劑量加受檢血清於任何一行（橫格）的各格中：第一格0.08mL，第二格0.04mL，第三格0.02mL，第四格0.01mL。
A2.1.2.3 加平板凝集抗原0.03mL於各血清格中，用牙簽或細鐵絲混合，由血清量最小的格混起，每份血清用一根牙簽混合即可，用後燒毀，若用細鐵絲混合時，每份血清混合後用酒精棉球擦凈，然後再用作另一份血清。
A2.1.2.4 混勻後將玻璃板置於酒精燈火焰或凝集反應箱上，均勻加溫，使其達到30℃左右，5min內記錄反應結果。
A2.1.2.5 每次試驗用陰、陽性血清各1份作對照。
A2.1.2.6 按下列標准用加號記錄反應強度：
++++：出現大的凝集片或小的粒狀物，液體完全透明，100%凝集。
+++：有明顯的凝集片，液體幾乎完全透明，75%凝集。
++：有可見的凝集片，液體不甚透明，50%凝集。
+：液體混濁，只有少量粒狀物，25%凝集。
－：液體均勻混濁。
A2.1.2.7 平板凝集反應與試管凝集反應的關系：
0.08mL 血清量出現凝集相當於試管法1∶25的血清稀釋度，0.04mL相當於1∶50，0.02mL相當於1∶100，0.01mL相當於1∶200。
A2.1.3 判定
人血清0.02mL出現++及以上凝集程度判為陽性，人血清0.04mL出現++及以上凝集程度判為可疑。
A2.2 虎紅平板凝集試驗（RBPT)
A2.2.1 器材及試劑
清潔脫脂玻片或有凹型孔的玻片，0.1mL吸管或微量加樣器，牙簽或細鐵絲，虎紅平板凝集抗原，被檢血清。
A2.2.2 操作方法
在玻片上加0.03mL被檢血清，然後加入虎紅平板抗原0.03mL，搖勻或用牙簽混勻，在5min內判定結果。
A2.2.3 判定
判定凝集程度（－至++++）同平板凝集反應亦可只分為（+）陽性，（－）陰性兩類。
A2.3 試管凝集試驗（SAT)
A2.3.1 器材及試劑
試管凝集抗原，被檢血清，0.5%的石碳酸生理鹽水，吸管，凝集試管，溫箱和試管架等。
A2.3.2 操作方法
A2.3.2.1 被檢血清的稀釋：在一般情況下，每份血清用5支小試管（口徑8～10mm），第一管加入2.3mL石碳酸生理鹽水，第二試管不加，第三、四、五管各加0.5mL，用1mL吸管吸取被檢血清0.2mL，加入第一管中，混勻。混勻後，以該吸管吸取第一管中血清加入第二管和第三管各0.5mL，以該吸管將第三管混勻，並吸取0.5mL加入第四管，混勻。再從第四管吸取0.5mL，棄去。如此稀釋後，從第二管到第五管血清稀釋度分別為1∶12.5，1∶25，1∶50和1∶100。
A2.3.2.2 加入抗原：先以0.5%石碳酸生理鹽水將抗原原液作適當稀釋（一般是作1∶10稀釋）。稀釋後的抗原加入各稀釋的血清管（第一管不加，作為血清對照），每管加0.5mL，混勻。加入抗原後，每管總量1mL，血清稀釋度從第二管至第五管分別為1∶25，1∶50，1∶100和1∶200，從第一管再吸出0.5mL，剩1mL。
A2.3.2.3 對照：陰性血清對照，血清稀釋後加抗原（與被檢血清對照相似）。陽性血清對照，其血清稀釋到原有滴度，再加抗原，抗原對照，適當稀釋的抗原加石碳酸鹽水。
A2.3.3 判定
A2.3.3.1 判定比濁管制備：每次試驗須配製比濁管作為判定的依據。配製方法是：取本次試驗用的抗原稀釋液5～10mL，加入等量的0.5%碳酸鹽水作倍比稀釋，按表A1配製比濁管。
表A1 比濁管配製
A2.3.3.2 全部試驗管，對照管及比濁管充分振盪後置37℃溫箱中20～22h，取出後放室溫2h，然後以比濁管為標准判定結果。
A2.3.3.3 記錄結果：根據各管中上層液體的清亮度記錄結果。特別是50%清亮度（++）對判定結果關系較大，一定要與比濁管對比判定。
++++：完全凝集，上層液100%清亮。+++：幾乎完全凝集，上層液75%清亮。++：顯著凝集，液體50%清亮。+：有微量凝集，液體25%清亮。－：無凝集，液體不清亮。
確定每份血清滴度是以出現十十及以上的凝集現象的最高血清稀釋度。
A2.4 抗人免疫球蛋白試驗（COOMBS)
A2.4.1 器材及試劑
除試管凝集試驗所需的一般器材及試劑外，還需抗人免疫球蛋白血清及普通離心機。
A2.4.2 操作方法
A2.4.2.1 試管凝集試驗階段：按A2.3進行試管凝集試驗。
A2.4.2.2 抗免疫球蛋白的反應階段：選取試管凝集試驗的可疑反應管及全部陰性反應管，記錄管號，經4000r/min離心15min，用生理鹽水反復洗滌三次，然後向各管中加入生理鹽水0.5mL、一定稀釋度（一般是1∶20倍稀釋）的抗人免疫球蛋白血清，混勻，將反應管置37℃溫箱中20～22h，取出放室溫2h後判定結果。
A2.4.2.3 判定：判定結果的標准，程度均同試管凝集試驗。
A2.5 補體結合試驗（CFT)
A2.5.1 器材及試劑
37℃水浴箱，普通離心機，普通冰箱，各種容量的吸管，燒瓶，凝集管和試管架，生理鹽水，補體（新鮮豚鼠血清，或凍干補體），2%的綿羊紅細胞懸液，溶血素，補體結合抗原，陰性和陽性血清，被檢血清。
A2.5.2 操作方法
A2.5.2.1 補體滴度：在進行CFT時，必須當天滴定補體，將補體用生理鹽水稀釋為1∶20，通常在十支凝集管中分別依次加入不同量的1∶20稀釋補體0.02～0.2mL，然後各管中加入2個單位的抗原液0.2mL，再用生理鹽水把各管補至0.6mL，混勻後放37℃水浴中30min，再加0.2mL的溶血素（2個單位）和2%紅細胞0.2mL，混勻，置37℃水浴中30min，判定結果（見表A2）。
表A2 補體滴度程序和結果 mL
上例中產生完全溶血且合補體量最少管為第八管，定為一個恰定單位，前一管（即第七管）為一個完全單位。在正式試驗時採用兩個完全單位的補體量，按式（A1）計算出補體稀釋倍數X。
20∶2Y=X∶0.2………………………………………（A1）
式中：Y——1個完全單位補體量。
A2.5.2.2 溶血素及抗原滴定：在進行CFT時溶血素和抗原亦需滴定，但不必在試驗當天進行；而且，在購到此二試劑時出售單位（或提供單位）都已滴定了，需用單位按說明稀釋即可。
A2.5.2.3 被檢血清滅活：人血清滅活補體的溫度是56℃，時間為30min。
A2.5.2.4 本試驗：滅活後的被檢血清從1∶5稀釋開始，然後作倍比稀釋，每管中稀釋血清量為0.2mL，再向各管中加2個單位抗原0.2mL，2個單位補體量0.2mL，混勻，置37℃水浴中30min，取出後，向各管加0.4mL的溶血素，再放37℃水浴中作用30min，判定結果（見表A3）。
表A3 CFT本試驗程序 mL
A2.5.3 判定
++++：無溶血，SRBC沉於管底或懸浮。+++∶25%溶血。++∶50%溶血。+∶75%溶血。－：100%溶血。以50%(++）及以上不溶血確定CFT的滴度。
為防止判定的錯誤，可配製標准溶血管（見表A4）。
表A4 標准溶血管的配製 mL A3.1 器材及試劑
布魯氏菌素，75%酒精棉球，結核菌素注射器，皮內注射針頭，測量尺。
A3.2 操作方法
於被檢者前臂內側1/3處，用酒精棉球消毒後，晾乾，皮內注射0.1mL布魯氏菌素，在注射後24和48h作兩次觀察。
A3.3 判定
兩次觀察，以反應最強的結果為准，注射局部出現充血，浸潤為2.0cm×2.0cm及以上（或以反應面積≥4.0cm（上標始）2（上標終）），判為陽性。
附加說明：
本標准由衛生部委託技術歸口單位衛生部傳染病防治監督管理辦公室負責解釋。

⑷ 豬布氏桿菌病的疾病診斷

本病的流行情況、臨床症狀和病理變化均無明顯特徵，同時隱性感染動物較多。因此，應以實驗室檢查為依據，結合流行情況和症狀進行綜合診斷。 實驗室檢查 布魯氏菌病的實驗室檢查方法很多，而最簡單實用的方法是布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗。採取被檢豬血液，待凝固後，分離血清作為被檢材料。准備0.2毫升吸管和潔凈的玻璃板以及虎紅平板凝集試驗抗原。先用蠟筆在玻板上劃成4平方厘米的方格，在每一方格的血清樣品旁加0.03毫升的被檢血清，搖動抗原瓶使抗原均勻懸浮，用0.2毫升吸管吸取抗原，在每一方格的血清樣品旁加入0.03毫升抗原，用牙簽攪拌血清和抗原，使其均勻混合，於4分鍾內判定結果，出現凝集現象者判為陽性反應，否則判為陰性，一般用於豬群的布魯氏菌病檢疫。也可用其他凝集試驗和變態反檢查。