㈠ 外泌體還可以這樣研究嗎
外泌體的提取主要包括以下幾種方式。
一是超速離心法，這是目前外泌體提取最常用的方法 。此種方法得到的外泌體量多，但是純度不足，電鏡鑒定時發現外泌體聚集成塊， 由於微泡和外泌體沒有非常統一的鑒定標准，也有一些研究認為此種 方法得到的是微泡不是外泌體 。
二是過濾離心， 這種操作簡單、省時，不影響外泌體的生物活性 ，但同樣存在純度不足的問題。
三是密度梯度離心法， 用此種方法分離到 的外泌體純度 高，但是前期准備工作繁雜，耗時，量少。
四是免疫磁珠法，這種方法可以保證外泌體形態 的完整，特異性高、操作簡單、不需要昂貴的儀器設備，但是非中性pH 和非 生理性鹽濃度會影響外泌體生物活性， 不便進行下一步的實驗 。
五是PS親和法，該方法將PS（磷脂醯絲氨酸）與磁珠結合，利用親和原理捕獲外泌體囊泡外的PS。該方法與免疫磁珠法相似，獲得的外泌體形態完整，純度最高。由於不使用變性劑，不影響外泌體的生物活性，外泌體可用於細胞共培養和體內注射。2016.9 nature雜志發表了該方法最新數據，表明PS法可提取相當高純度的外泌體。
六是色譜法，這種方法分離到的外泌體在 電鏡下大小均 一， 但是需要特殊的設備 ， 應用不廣泛 。
㈡ 外泌體標志物怎麼選擇鑒定
外泌體標志物的選擇鑒定是外泌體研究中的關鍵環節，以下從標志物類型及選擇依據、鑒定方法等方面進行介紹：
常見外泌體標志物類型
膜蛋白標志物
CD63：屬於四次跨膜蛋白超家族，在多種細胞來源的外泌體表面高度表達，常被用於外泌體的鑒定和分離。
CD81：也是四次跨膜蛋白，參與細胞間的相互作用和信號傳導，在不同細胞分泌的外泌體中廣泛存在。
CD9：同樣是四次跨膜蛋白家族成員，與外泌體的生物發生和功能調節有關，可作為外泌體的通用標志物。
細胞質蛋白標志物
GAPDH：作為一種糖酵解途徑中的關鍵酶，在細胞內廣泛存在且含量相對穩定，常被用作內參蛋白，也可作為外泌體的標志物之一。
熱休克蛋白（HSP）：如 HSP70、HSP90 等，參與蛋白質的折疊、轉運和降解，在應激條件下，外泌體中 HSP 的表達會發生變化，可作為外泌體的特徵性標志物。
脂質標志物
神經醯胺：是外泌體膜的重要組成成分，在維持外泌體膜的結構和功能方面發揮重要作用，其含量和組成可作為外泌體鑒定的指標之一。
磷脂醯絲氨酸（PS）：正常情況下位於細胞膜內側，在細胞凋亡或外泌體形成過程中，PS 會外翻到細胞膜外側，可作為外泌體的一個特徵性標志物。
選擇依據
特異性：理想的標志物應在目標外泌體來源的細胞或組織中特異性表達，而在其他細胞或組織中表達量極低或不表達，這樣可以准確地識別和鑒定目標外泌體。
穩定性：標志物在不同的生理和病理條件下，以及在不同的實驗處理過程中，都應具有良好的穩定性，能夠可靠地反映外泌體的存在和特徵。
豐度：標志物在目標外泌體中的表達量應相對較高，以便於檢測和分析。高豐度的標志物可以提高檢測的靈敏度和准確性，減少假陰性結果的出現。
功能相關性：選擇與外泌體的生物發生、分泌、攝取或功能相關的蛋白質作為標志物，不僅可以用於外泌體的鑒定，還可以為研究外泌體的生物學功能提供線索。
鑒定方法
免疫印跡法（Western blot）：利用抗原與抗體的特異性結合原理，通過電泳分離外泌體蛋白，然後與特異性抗體反應，檢測外泌體標志物的表達情況，可用於確定外泌體中是否存在特定的標志物蛋白。
酶聯免疫吸附試驗（ELISA）：將外泌體捕獲在固相載體上，然後與特異性抗體結合，通過酶標二抗檢測結合的抗體量，從而定量分析外泌體標志物的含量，具有較高的靈敏度和特異性。
流式細胞術：將外泌體與熒游標記的特異性抗體結合，通過流式細胞儀檢測外泌體表面標志物的表達情況，可對單個外泌體進行分析，快速、准確地鑒定外泌體及其亞群。
免疫電鏡：將外泌體樣品與特異性抗體結合，然後用電子顯微鏡觀察，可直觀地看到外泌體表面標志物的分布和定位，同時還能觀察外泌體的形態和大小。
㈢ 流式細胞術檢測：細胞凋亡、細胞自噬、細胞因子、外泌體
流式細胞術(flow cytometry，FCM) 是一種高級細胞定量分析技術，以其快速、高精度、多參數和高通量的特點，廣泛應用於生物學和醫學研究中。以下是流式細胞術在細胞凋亡、細胞自噬、細胞因子檢測以及外泌體檢測中的應用。
在檢測細胞凋亡中，流式細胞術主要通過線粒體膜電位檢測和Caspase-3活性檢測來實現。線粒體膜電位檢測原理是利用熒光探針 JC-1 的聚集特性，正常細胞線粒體膜電位較高，JC-1形成聚合物並產生紅色熒光，而凋亡細胞線粒體膜電位降低，JC-1為單體，產生綠色熒光。通過檢測綠色和紅色熒光，可以定量分析線粒體膜電位的變化。Caspase-3活性檢測則是基於細胞內蛋白酶的級聯活化，通過檢測活化狀態的Caspase酶使底物發出熒光，以此量化凋亡細胞。
對於細胞因子的檢測，Cytometric Bead Array (CBA)技術被廣泛應用。CBA技術基於流式細胞檢測系統，能同時對單個樣品中的多個指標進行多重定量分析，實現樣本中細胞因子的精確檢測。
在細胞自噬檢測中，LC3-II作為自噬的生物學標記，其在自噬發生時位於自噬小體內。通過對比同型對照，分析平均熒光強度，可確定自噬的發生。
外泌體檢測則主要關注其特有的四次跨膜蛋白，如CD9、CD63和TSG101，外泌體表達的定性定量分析通過包被了抗體的珠子進行流式檢測實現。
最後，流式細胞術在科研和醫學研究中的廣泛應用，包括對照設置、儀器優化、陽性確定、實驗流程、標准化操作指南以及科研工具推薦等。這些內容涵蓋了流式細胞術的基本原理、應用技巧以及支持工具，是科研工作者不可或缺的知識庫。