食品廠大腸菌群檢測方法

Ⅰ 食品中大腸菌群的檢驗，有哪些需要注意的實驗步驟

食品微生物學檢驗 大腸菌群計數：大腸菌群平板計數法（GB 4789.3-2010）
一 試劑和儀器
煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB肉湯）
結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）
恆溫培養箱
自動稀釋儀
均質器
振盪器
二 樣品處理
固體樣品應在無菌條件下充分粉碎。本次演示以乳粉為例，取密封狀態良好的試樣，備用待測。
三 檢測過程
實驗前准備
進入無菌操作室前應更換無菌實驗服，戴帽子、口罩、無菌手套。進入無菌操作室後，首先用鑷子夾取適量酒精棉全面擦拭雙手，然後才能進行實驗操作。
酒精易燃，因此在擦拭雙手的過程中應離開酒精燈火焰一定距離，防止出現危險，待手上的酒精揮發完全後，再進行實驗操作。
樣品的稀釋
取一潔凈無菌均質袋於自動稀釋儀上，用酒精棉充分擦拭樣品袋，將剪刀置於酒精燈外焰上充分灼燒，小心剪開樣品袋。將稱樣勺於酒精燈外焰灼燒片刻，准確稱取25g樣品於無菌均質袋中。用酒精燈外焰灼燒注水口片刻，在盛有樣品的均質袋中注入225mL無菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液。取下均質袋，將均質袋放入拍擊式均質器中，用均質器拍打1min～2min，製成1:10的樣品勻液。
注意：樣品勻液的pH值應在6.5～7.5之間，必要時可用1 mol/L無菌氫氧化鈉或1mol/L無菌鹽酸溶液調節。
均質完畢後，做好標記，將均質袋置於樣品框中。
在裝有9mL生理鹽水的無菌試管上做好標記，用1mL無菌吸管吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩緩注入裝有9mL生理鹽水的無菌試管中，稀釋前後試管口都應在酒精燈上灼燒片刻。加塞後於振盪器上混合均勻，製成1:100的樣品勻液。同理，按上述操作，依次製成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。稀釋樣品時，注意吸管或吸頭尖端不得觸及稀釋液面；每遞增稀釋1次，換用1支1mL無菌吸管或吸頭。
接種及培養
在事先經滅菌處理的培養皿底部做好標記。根據對樣品污染狀況的估計，選取2～3個適宜的連續稀釋度。本次演示只做1:10和1:100的樣品稀釋液。
用無菌吸管吸取1:10樣品稀釋液1mL，加入到培養皿中，備用。同理，加入1:100稀釋液和空白液。注意，每個稀釋度應接種2個無菌培養皿，空白液即為以1mL生理鹽水代替1mL樣品稀釋液。
加完樣品梯度稀釋液後，即可傾倒培養基。傾倒前應將錐形瓶的瓶口在酒精燈上充分灼燒。灼燒後及時傾注15mL～20mL結晶紫中性紅膽鹽瓊脂於每個培養皿中，小心旋轉培養皿，將培養基與樣液充分混勻。傾注培養基時應將錐形瓶口盡量伸入培養皿內，防止傾倒時培養基掛在培養皿的內壁或外壁上，且傾倒過程應果斷，防止培養基沿錐形瓶外壁流出、滴落。培養基的溫度以46℃為宜，不能過高或過低，溫度過高不利於操作且對菌體有害，溫度過低培養基迅速凝固，菌體不能在培養皿內均勻的分布，導致菌落計數困難。轉動培養基時用力須均勻，防止培養基沾到培養皿上蓋或灑出。
倒完培養基後，靜置培養皿，等待培養基冷卻凝固。
待培養基凝固後，再加3mL～4mL 結晶紫中性紅膽鹽瓊脂覆蓋平板表層。加兩次培養基的主要目的是：使菌體均在培養基內部生長，以便於觀察典型菌落形態。等待培養基冷卻凝固。待培養基凝固後，翻轉平板，置於培養箱中於36℃±1℃條件下培養18h～24h。
平板菌落計數
選取菌落數在15CFU～150CFU之間的平板，分別計數平板上出現的典型和可疑大腸菌群菌落，其中典型菌落的特徵為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉澱環，菌落直徑為0.5mm或更大。
證實實驗
先在煌綠乳糖膽鹽肉湯管上做好標注。將接種環置於紅外滅菌器中滅菌，再用接種環從結晶紫中性紅膽鹽瓊脂平板上挑取10個不同類型的典型和可疑菌落，分別移種於煌綠乳糖膽鹽肉湯管內，振搖均勻。每次接種後都應及時將接種環在滅菌器中滅菌。將接種完的煌綠乳糖膽鹽肉湯管置於培養箱中，於36℃±1℃條件下培養24h～48h。培養完畢後，觀察煌綠乳糖膽鹽肉湯管中產氣情況。凡管內倒管有氣泡者，即可報告為大腸菌群陽性。

Ⅱ 檢測食品中大腸桿菌是什麼樣子的

GB4789.3—2010《食品安全國家標准食品微生物學檢驗大腸菌群計數》第一法：大腸菌群MPN計數法。第二法：大腸菌群平板計數法。兩種方法適用於各類食品中大腸菌群的計數。

大腸菌群（Coliforms）是一群在一定培養條件下能發酵乳糖、產酸產氣的需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌，其主要檢測意義在於反映食品衛生狀況並推測其存在腸道致病菌的可能性。常以大腸菌群作為糞便污染指標來評價食品的衛生質量，推斷食品中有否污染腸道致病菌的可能。

第一法：

進入無菌操作室前應更換無菌實驗服，戴帽子、口罩、無菌手套。進入無菌操作室後，將鑷子在酒精燈外焰充分灼燒，夾取適量酒精棉全面擦拭雙手，然後才能進行實驗操作。酒精易燃，因此在擦拭雙手的過程中應離開酒精燈火焰一定距離，防止出現危險，待手上的酒精揮發後，再進行實驗操作。

樣品的稀釋：取一潔凈無菌均質袋於自動稀釋儀上，將稱樣勺於酒精燈外焰灼燒片刻，准確稱取25g樣品於無菌均質袋中。用酒精燈外焰灼燒注水口片刻，在盛有樣品的均質袋中注入225mL無菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液。取下均質袋，將均質袋放入拍擊式均質器中，用均質器拍打1min～2min，製成1:10的樣品勻液。

注意：樣品勻液的pH值應在6.5～7.5之間，必要時可用1mol/L無菌氫氧化鈉或1mol/L無菌鹽酸溶液調節。均質完畢後，將均質袋置於樣品框中。用記號筆依次在無菌試管上做好樣品和稀釋度標記。用無菌吸管吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩緩注入裝有9mL生理鹽水的無菌試管中。稀釋前後試管口都應在酒精燈上灼燒片刻。加塞後於振盪器上混合均勻，製成1:100的樣品勻液。根據對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次製成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。稀釋樣品時，注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面；每遞增稀釋1次，換用1支1mL無菌吸管或吸頭。

初發酵試驗：每個樣品選擇3個適宜的連續稀釋度的樣品勻液，每個稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白腖（LST）肉湯，每管接種1mL。注意，當接種量超過1mL，則用雙料LST肉湯，雙料LST肉湯是指配置時除蒸餾水外其他成分加倍的培養基。

本次試驗中，前三管無菌試管中加入10mL十倍樣品稀釋液，培養基為雙料LST肉湯；第4～6管加入十倍稀釋液1mL，培養基為單料肉湯；第7～9管加入百倍稀釋液接種1mL，培養基為單料肉湯；接種前後試管口均需用酒精燈灼燒片刻，接種後及時振搖均勻。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過15min。

接種完畢後，將LST肉湯管置於培養箱中36℃±1℃條件下培養24h±2h。24h±2h後，觀察試管中的倒管內是否有氣泡產生，產氣者進行復發酵試驗；如未產氣則繼續培養至48h±2h，產氣者進行復發酵試驗，未產氣者報告為大腸菌群陰性。

復發酵試驗：進行復發酵試驗時，先將接種環置於紅外滅菌器中滅菌，再用接種環從產氣的LST肉湯管中分別取培養物1環，移種於煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）管中，接種完畢後應及時將接種環在滅菌器中滅菌。將接種完的煌綠乳糖膽鹽肉湯管置於培養箱中，36℃±1℃下培養48h±2h。36℃±1℃培養48h±2h後，觀察產氣情況，若試管中的倒管內有氣泡，計為大腸菌群陽性管，否則計為大腸菌群陰性。

四結果報告

按確證的大腸菌群LST陽性管數，參照GB4789.3—2010附錄中提供的大腸菌群最可能數檢索表，報告每g（mL）樣品中大腸菌群的MPN值。

第二法：

樣品處理：固體樣品應在無菌條件下充分粉碎。本次演示以乳粉為例，取密封狀態良好的試樣，備用待測。

檢測過程：

在裝有9mL生理鹽水的無菌試管上做好標記，用1mL無菌吸管吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩緩注入裝有9mL生理鹽水的無菌試管中，稀釋前後試管口都應在酒精燈上灼燒片刻。加塞後於振盪器上混合均勻，製成1:100的樣品勻液。同理，按上述操作，依次製成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。稀釋樣品時，注意吸管或吸頭尖端不得觸及稀釋液面；每遞增稀釋1次，換用1支1mL無菌吸管或吸頭。

接種及培養：在事先經滅菌處理的培養皿底部做好標記。根據對樣品污染狀況的估計，選取2～3個適宜的連續稀釋度。本次演示只做1:10和1:100的樣品稀釋液。

用無菌吸管吸取1:10樣品稀釋液1mL，加入到培養皿中，備用。同理，加入1:100稀釋液和空白液。注意，每個稀釋度應接種2個無菌培養皿，空白液即為以1mL生理鹽水代替1mL樣品稀釋液。

加完樣品梯度稀釋液後，即可傾倒培養基。傾倒前應將錐形瓶的瓶口在酒精燈上充分灼燒。灼燒後及時傾注15mL～20mL結晶紫中性紅膽鹽瓊脂於每個培養皿中，小心旋轉培養皿，將培養基與樣液充分混勻。傾注培養基時應將錐形瓶口盡量伸入培養皿內，防止傾倒時培養基掛在培養皿的內壁或外壁上，且傾倒過程應果斷，防止培養基沿錐形瓶外壁流出、滴落。培養基的溫度以46℃為宜，不能過高或過低，溫度過高不利於操作且對菌體有害，溫度過低培養基迅速凝固，菌體不能在培養皿內均勻的分布，導致菌落計數困難。轉動培養基時用力須均勻，防止培養基沾到培養皿上蓋或灑出。

倒完培養基後，靜置培養皿，等待培養基冷卻凝固。

待培養基凝固後，再加3mL～4mL結晶紫中性紅膽鹽瓊脂覆蓋平板表層。加兩次培養基的主要目的是：使菌體均在培養基內部生長，以便於觀察典型菌落形態。等待培養基冷卻凝固。待培養基凝固後，翻轉平板，置於培養箱中於36℃±1℃條件下培養18h～24h。

平板菌落計數：選取菌落數在15CFU～150CFU之間的平板，分別計數平板上出現的典型和可疑大腸菌群菌落，其中典型菌落的特徵為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉澱環，菌落直徑為0.5mm或更大。

證實實驗：先在煌綠乳糖膽鹽肉湯管上做好標注。將接種環置於紅外滅菌器中滅菌，再用接種環從結晶紫中性紅膽鹽瓊脂平板上挑取10個不同類型的典型和可疑菌落，分別移種於煌綠乳糖膽鹽肉湯管內，振搖均勻。每次接種後都應及時將接種環在滅菌器中滅菌。將接種完的煌綠乳糖膽鹽肉湯管置於培養箱中，於36℃±1℃條件下培養24h～48h。培養完畢後，觀察煌綠乳糖膽鹽肉湯管中產氣情況。凡管內倒管有氣泡者，即可報告為大腸菌群陽性。

四結果報告

經最後證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以計數的平板菌落數，再乘以稀釋倍數，即為每g（mL）樣品中大腸菌群數。