⑴ 誰知道測DNA甲基化的方法
http://www.ebiotrade.com/emgzf/genenews200404/gene5.htm您自己看吧！好多圖片粘貼不過來，還不如你自己看。
一種全新的DNA甲基化研究方法——Pyrosequencing技術
DNA甲基化是一種表觀遺傳修飾，它是由DNA甲基轉移酶（DNA methyl-transferase, Dnmt）催化S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，將胞嘧啶轉變為5-甲基胞嘧啶（mC）的一種反應，在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化學性修飾鹼基。CG二核苷酸是最主要的甲基化位點，它在基因組中呈不均勻分布，存在高甲基化、低甲基化和非甲基化的區域，在哺乳動物中mC約佔C總量的2－7％。一般說來，DNA的甲基化會抑制基因的表達。DNA的甲基化對維持染色體的結構、X染色體的失活、基因印記和腫瘤的發生發展都起重要的作用。
CpG雙核苷酸在人類基因組中的分布很不均一，而在基因組的某些區段，CpG保持或高於正常概率，這些區段被稱作CpG島。CpG島主要位於基因的啟動子和第一外顯子區域，約有60％以上基因的啟動子含有CpG島。 CpG甲基化的研究在腫瘤的研究中有著非常主要的地位。通過基因啟動子區及附近區域CpG島胞嘧啶的甲基化可以在轉錄水平調節基因的表達，從而引起相應基因沉默，去甲基化又可恢復其表達。DNA甲基化在生理情況下就參與了控制基因的時空表達，在腫瘤發生時，腫瘤細胞全基因組低甲基化是一個重要特徵。腫瘤細胞基因組甲基化的程度與正常細胞相比僅為20-60% , 同時伴有局部區域基因的高甲基化,包括腫瘤抑制基因、抑制腫瘤轉移和浸潤的基因、細胞周期調節基因、DNA修復基因、血管形成抑制基因等。但是目前研究手段的局限，限制了DNA甲基化的廣泛研究。
近年來，研究者不斷探索定性及定量檢測單個或多個甲基化位點的方法，但由於甲基化多態性區域存在的密度很高，所以對於延伸反應其引物的位置很難設計。Pyrosequencing技術作為一種新的序列分析技術，能夠快速地檢測甲基化的頻率，對樣品中的甲基化位點進行定性及定量檢測，為甲基化研究提供了新的途徑。
從原理上來看，Pyrosequencing是一種通過合成方法進行序列分析的方法，它通過核苷酸和模板結合後釋放的焦磷酸引發酶級聯反應，促使熒光素發光並進行檢測。這項技術曾經被用作單核苷酸多態性（SNP）的基因型和單倍型的檢測，以及細菌和病毒的鑒定和分型研究。這項技術的一個主要特點是在Pyrogarm™軟體上顯示的峰值高度來自於序列分析的原始數據，通過峰值的高度可以精確的檢測混合DNA模板中等位基因的頻率。
目前甲基化研究方面，很多甲基化定量分析的報道採用亞硫酸氫鹽處理甲基化樣本，並用混合的PCR產物
作為校正。其主要原理是：亞硫酸氫鹽可以將沒有甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶，而在適當的實驗條件下甲基化的胞嘧啶保持不變。因而，用它處理樣本後，再進行PCR擴增，甲基化的位點可以被當作一個C/T的SNP來處理，它的基因頻率為0－100％。在此，我們給大家介紹一個研究人員使用Pyrosequencing技術分析並精確定量DNA甲基化水平的例子。
研究者在一個Pyrosequencing反應中同時檢測了6個甲基化位點。這種方法同樣可以用於石蠟包埋的組織，並且具有較高的重復性和精確性。實驗選擇谷胱甘肽-S-轉移酶π（GSTP1）轉錄啟動位點的CpG島進行檢測。這些位點在正常前列腺組織中是非甲基化的，而在腫瘤樣本中高甲基化。通過PCR擴增一個包含17個甲基化多態位點140bp的片段，並用4個測序引物研究其中15個位點（Table 1）。使用在線的SNP測序引物設計軟體（Pyrosequencing AB）設計測序引物，其中一些甲基化多態性位點用最可能的鹼基所代替，以減少計算的數量。再通過人工檢測測序引物可能存在的錯配。此外，同時在PSQ 96MA DNA分析儀上運行空白對照，扣除由測序引物、生物素標記的引物或是模板引起的背景。
PCR引物設計完全與模板相匹配，不覆蓋任何甲基化多態性區域。使用10ng亞硫酸氫鹽轉化的DNA樣本或是10 fmol純化的PCR產物，10 pmol 正向（5』-GTGATTTAGTATTGG-3』）和反向（5』-biotin-AACTCTAAACCCCATC-3』）引物擴增GSTP1轉錄啟動位點的基因片段，擴增片段長度為144bp。反應體系為60 mM Tris-SO4, pH 8.9, 18 mM (NH4)2SO4, 1 mM MgSO4, 200 μM dNTPs，以及3 U Platinum Taq DNA高保真聚合酶，終體積為50μL。PCR循環設置：首先在95℃下變性4分鍾，然後在95℃ 30S，50℃ 45S以及72℃ 20S條件下重復50個循環，最後一步延伸步驟在72℃下4分鍾，中止反應。PCR反應在Eppendorf的Mastercycler 96
哺乳動物基因組中，DNA甲基化是指CpG二核苷酸中的胞嘧啶第5位碳原子被甲基化. DNA甲基化是一種基因外修飾，不改變DNA的一級結構; 他在細胞正常發育、基因表達模式以及基因組穩定性中起著至關重要的作用. 全基因組低甲基化，維持甲基化模式酶的調節失控和正常非甲基化CpG島的高甲基化是人類腫瘤中普遍存在的現象. DNA高甲基化是導致抑癌基因失活的又一個機制.
http://www.wjgnet.com/1009-3079/abstract_cn.asp?f=1420&v=11
⑵ 如何進行DNA甲基化分析
基因甲基化的檢測方法主要有以下幾種：
甲基化特異性的PCR(Methylation-specific PCR，MSP)
用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，所有未發生甲基化的胞嘧啶被轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變；隨後設計針對甲基化和非甲基化序列的引物進行PCR。通過電泳檢測MSP擴增產物，如果用針對處理後甲基化DNA鏈的引物能得到擴增片段，則說明該位點存在甲基化；反之，說明被檢測的位點不存在甲基化。
2、亞硫酸氫鹽測序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP)
用亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，則未發生甲基化的胞嘧啶被轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變。隨後設計BSP引物進行PCR，在擴增過程中尿嘧啶全部轉化為胸腺嘧啶，最後對PCR產物進行測序就可以判斷CpG位點是否發生甲基化稱為BSP-直接測序方法。將PCR產物克隆至載體後進行測序，可以提高測序成功率，這種方法稱為BSP-克隆測序法。
3、甲基化敏感擴增多態性
(Methylation-Sensitive Amplified Polymorphism,MSAP)
MSAP是利用對DNA甲基化敏感的兩種同裂酶Hpa II和Msp I來對基因組DNA進行酶切和連接。由於兩種酶能夠識別相同的限制性酶切位點，即CCGG位點。當DNA序列中的CCGG位點出現不同程度的甲基化狀態時，會分別被這兩種酶識別，以有無產物的方式體現出來。
4、焦磷酸測序(Pyrosequencing)
通過准確定量單個連續的CpG 位點上的甲基化頻率，焦磷酸測序能檢測並定量甲基化水平上的細微改變。在序列延伸過程中，根據C和T的摻入量來定量確定單個位點的C-T比例。因此，不同位點的甲基化變異就能被准確檢測。由於焦磷酸測序提供了真實的序列數據，甲基化狀態也就以序列形式呈現。