『壹』 核酸分子雜交探針
核酸分子雜交探針是現代分子生物學實驗中的一項關鍵技術。它涉及了將特定標記物，如放射性同位素32P或熒光物質異硫氰酸熒光素等，連接到特異性核酸序列片段上。其目的是識別和檢測靶DNA中的特定核苷酸序列。制備帶有標記物的探針，可使與靶序列互補形成的雜交雙鏈攜帶特定的信號。通過適當方法接受來自雜交鏈的信號，即可對靶序列DNA的存在及其分子大小進行准確鑒別。在分子生物學領域，核酸分子雜交與探針的制備和使用緊密相關，共同構成了研究核酸結構與功能的基礎技術。這一技術的應用范圍廣泛，涵蓋了基因序列分析、基因定位、基因表達檢測等多個方面。
在現代分子生物學實驗中，核酸分子雜交探針技術被廣泛應用於多個研究領域。通過精確設計和制備帶有標記的探針，科學家能夠對目標DNA序列進行特異性識別和定量分析。這一技術不僅能夠檢測靶序列是否存在，還能提供關於序列長度和結構的詳細信息。例如，在基因定位研究中，通過將探針與特定基因區域雜交，可以確定基因在染色體上的位置。此外，核酸分子雜交探針技術在基因表達分析中也發揮著重要作用，通過檢測特定mRNA序列的存在和量，可以揭示基因在不同組織或細胞狀態下的表達模式。
核酸分子雜交探針技術在基因組學領域中同樣展現出強大的應用潛力。通過設計與不同基因座或特定遺傳標記互補的探針，科學家能夠進行大規模的基因組掃描，探索遺傳變異與疾病之間的關聯。這一技術在遺傳病研究、基因編輯技術評估以及人類遺傳學研究中扮演著重要角色。通過精確檢測和量化特定基因或基因片段的存在，核酸分子雜交探針技術為遺傳學研究提供了強有力的工具。
總之，核酸分子雜交探針技術是現代分子生物學實驗中的核心手段之一。它不僅使科學家能夠對靶DNA序列進行特異性識別和定量分析，還為基因組學、遺傳學等領域的深入研究提供了強大的技術支持。通過精確設計和制備帶有標記的探針，結合核酸分子雜交技術，科學家能夠揭示基因序列的結構、表達模式及其與疾病之間的關聯，為遺傳病的診斷、治療以及遺傳資源的利用提供了重要依據。這一技術的應用范圍廣泛，對於推動生命科學領域的發展具有重要意義。
『貳』 細胞生物學中簡答細胞凋亡的檢測技術有哪些
一、形態學觀察方法
1、HE染色、光鏡觀察：凋亡細胞呈圓形，胞核深染，胞質濃縮，染色質成團塊狀，細胞表面有「出芽」現象。
2、丫啶橙（AO）染色，熒光顯微鏡觀察：活細胞核呈黃綠色熒光，胞質呈紅色熒光。凋亡細胞核染色質呈黃綠色濃聚在核膜內側，可見細胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體。
3、台盼藍染色：如果細胞膜不完整、破裂，台盼藍染料進入細胞，細胞變藍，即為壞死。如果細胞膜完整，細胞不為台盼藍染色，則為正常細胞或凋亡細胞。此方法對反映細胞膜的完整性，區別壞死細胞有一定的幫助。
4、透射電鏡觀察：可見凋亡細胞表面微絨毛消失，核染色質固縮、邊集，常呈新月形，核膜皺褶，胞質緊實，細胞器集中，胞膜起泡或出「芽」及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細胞吞噬現象。
二、DNA凝膠電泳
（一）檢測原理
細胞發生凋亡或壞死，其細胞DNA均發生斷裂，細胞內小分子量DNA片斷增加，高分子DNA減少，胞質內出現DNA片斷。但凋亡細胞DNA斷裂點均有規律的發生在核小體之間，出現180－200bpDNA片斷，而壞死細胞的DNA斷裂點為無特徵的雜亂片斷，利用此特徵可以確定群體細胞的死亡，並可與壞死細胞區別。
（二）結果判斷
正常活細胞DNA 電泳出現階梯狀（LADDER）條帶；壞死細胞DNA電泳類似血抹片時的連續性條帶。
三、酶聯免疫吸附法（ELISA）核小體測定
凋亡細胞的DNA斷裂使細胞質內出現核小體。核小體由組蛋白及其伴隨的DNA片斷組成，可由ELISA法檢測。
（一）檢測步驟
1、將凋亡細胞裂解後高速離心，其上清液中含有核小體；
2、在微定量板上吸附組蛋白體；
3、加上清夜使抗組蛋白抗體與核小體上的組蛋白結合；
4、加辣過氧化物酶標記的抗DNA抗體使之與核小體上的DNA結合；
5、加酶的底物，測光吸收制。
（二）用途
該法敏感性高，可檢測5*100/ml凋亡細胞。可用於人、大鼠、小鼠的凋亡檢測。該法不需要特殊儀器，適合基層工作，但是不能精確測定凋亡細胞發生的絕多對量。
四、流式細胞儀分析
（一）檢測原理
細胞發生凋亡時，其細胞膜的通透性也增加，但是其程度介於正常細胞與壞死細胞之間。利用一特點，被檢測細胞懸液用熒光素染色，利用流式細胞儀測量細胞懸液中細胞熒光強度來區分正常細胞、壞死細胞核凋亡細胞。
（二）應用價值
流式細胞儀檢測具有以下特點：
1）、檢測的細胞數量大，因此其反映群體細胞的凋亡狀態比較准確
2）、可以做許多相關性分析
3）、結合被檢測細胞的DNA含量的分析，可確定凋亡的細胞所處的細胞周期
■檢測形態學及細胞膜完整性的Hoechs-PI雙染色法
細胞發生凋亡時，其細胞膜的通透性液增加，但其程度介於正常細胞和壞死細胞之間，利用這一特點，被檢測細胞懸液用熒光素染色，利用流式細胞儀檢測細胞懸液中細胞熒光強度來區分正常細胞、壞死細胞和凋亡細胞。
利用Hoechs-PI染色法，正常細胞對染料有抗拒性，熒光染色很淺，凋亡細胞主要攝取Hoecha染料，呈現強藍色熒光，而壞死細胞主要攝取碘化丙啶（PI）而呈強的紅色熒光。
■DNA片斷原位標記法
凋亡細胞DNA片斷原位末端檢測技術是指在細胞（或組織）結構保持不變的情況下，用熒光素、地高辛或生物素標記的脫氧尿三磷酸（deoxyuridinetriphate，DUTP）和末端脫氧核苷酸轉移酶（TdT）相反應與凋亡細胞裂解後3.的羥基（－OH）端結合，經顯色反應後檢測DNA裂解點的技術。
DNA片段原位標記法有二種：
1、原位缺口轉移（in situ nick-translation，ISNT）技術，它是利用DNA多聚酶I將標記的核苷酸連接到斷裂DNA的3－OH端
2、原位缺口末端標記技術（in situ end labelling technique，ISEL），即TUNEL法，它是利用TdT將標記的DUPT接到3－OH端。研究證明，TUNEL法的敏感性遠高於ISNT，尤其對早期凋亡的檢測，TUNEL為合適。
■檢測細胞膜成分變化的Annexin V 聯合PI法
1、原理：在細胞凋亡早期位於細胞膜內側的磷脂醯絲氨酸（PS）遷移至細胞膜外測。磷脂結合蛋白V（Annexin V）是鈣依賴性的磷脂結合蛋白，它於PS具有高度的結合力。因此，Annexin V可以作為探針檢測暴露在細胞外測的磷脂醯絲氨酸。故利用對PS有高度親和力的Annexin V，將Annexin V標記上熒光素（如異硫氰酸熒光素FITC），同時結合使用PI拒染法（因壞死細胞PS亦暴露於細胞膜外測，且對PI高染）進行凋亡細胞雙染法後用流式細胞儀即可檢測凋亡細胞。
2、結果判斷：正常活細胞Annexin V 、PI均低染；凋亡細胞Annexin V高染、PI低染；壞死細胞Annexin V/PI均高染。
3、應用價值：細胞發生凋亡時，膜上的PS外露早於DNA斷裂發生，因此Annexin V聯合PI染色法檢測早期細胞凋亡較TUNEL法更為靈敏。又Annexin V聯合PI染色不需固定細胞，可避免PI染色因固定造成的細胞碎片過多及TUNEL法因固定出現的DNA片段丟失。因此，Annexin V聯合PI法更加省時，結果更為可靠，是最為理想的檢測細胞凋亡的方法。