免疫檢測常用方法間接法

Ⅰ 免疫組織化學染色法的檢查過程

用熒光抗體示蹤或檢查相應抗原的方法，稱熒光抗體法。用已知的熒光抗原標記物示襪敏蹤或檢查相應抗體的方法，稱熒光抗原法。免疫熒光組織化學分直接法、間接法和補體法。一、直接法(1) 檢查抗原方法這是最簡便、快速的方法，用已知特異性抗體與熒光素結合，製成特異性熒光抗體，直接用於細胞或組織抗原的檢查。此法特異性強，常用於腎穿刺，皮膚活檢和病原體檢查，其缺點是一種熒光抗體只純弊能檢查一種抗原，敏感性較差。(2)檢查抗體方法將抗原標記上熒光素，用此熒光抗原與細胞或組織內相應抗體反應，而將抗體在原位檢測出來。二、間接法(1)檢查抗體(夾心法)方法此法是先用特異性抗原與細胞或組織內抗體反應，再用此抗原的特異性熒光抗體與結合在細胞內抗體上的抗原相結合，抗原夾在細胞抗體與熒光抗體之間，故稱夾心法。(2)檢查抗體方法用已知抗原細胞或組織切片，加上待檢血清，如果血清含有切片中某種抗原的抗體，抗體結合在抗原上，再用間接熒光抗體(抗種屬特異性IgG熒光抗體)與結合在抗原上的抗體反應，在熒光顯微鏡下可見抗原抗體反應部位呈現明亮的特異性熒光。此法是檢驗血清中自身抗體和多種病原體抗體的重要手段。(3)檢查抗原法此法是直接法的重要改進，先用特異性抗體與細胞標本反應，隨後用緩沖鹽水洗去未與抗原結合的抗體，再用間接熒光抗體與結合在抗原上的抗體結合，形成抗原-抗體-熒光抗體的復合物。同直接法相比熒光亮度可增強3或4倍。此法除靈敏性高外，它只需要制備一種種屬間接熒光抗體，可以適用於同一種屬產生的多種第一抗體的標記顯示，這是現在最廣泛應用的技術。三、補體法(1)直接檢查組織內免疫復合物方法用抗補體C3熒光抗體直接作用組織切片，與其中結合在抗原抗體復合物上的補體反應，而形成抗原-抗體-補體—抗補體熒光抗體復合物，在熒光顯微鏡下呈現陽性熒光的部位就是免疫復合物上補體存在處，此法常用於腎穿刺組織活檢診斷等。(2)間接檢查組織內抗原方法常將新鮮補體與第做好族一抗體混合同時加在抗原標本切片上，經37℃孵育後，如發生抗原抗體反應，補體就結合在此復合物上，再用抗補體熒光抗體與結合的補體反應，形成抗原-抗體-補體—熒光抗體的復合物，此法優點是只需一種熒光抗體可適用於各種不同種屬來源的第一抗體的檢查。[1]四、雙重免疫熒光組織化學標記方法在同一組織標本上需要同時檢查兩種抗原時要進行雙重熒光染色，一般均採用直接法，將兩種熒光抗體(如抗A和抗B)以適當比例混合，加在標本上孵育後，按直接法洗去未結合的熒光抗體，抗A抗體用異硫氰酸熒光素標記，發黃綠色熒光;抗B抗體用TMRITC或RB200標記，發紅色熒光，可以明確顯示兩種抗原的定位。

Ⅱ 酶聯免疫檢測的幾種方法及其原理

（1）酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）：是將抗原或抗體吸附在固相載體表面。使抗原抗體反應在固相載體表面進行。可用間接法、雙抗體夾心法或競爭法測定抗原或抗體。
（2）夾心法（sandwich assay）:將已知的特異抗體包裝在固相載體（塑料板凹孔或紙片上），加入待檢標本，標本中的抗原即可與載體上的抗原結合，洗去未結合的材料後加入該抗原的酶標記抗體，洗去未結合的酶標抗體，加底物顯色，用酶免疫檢測儀測量顏色的光密度，可定量測定抗原。
間接法（indirecr ELISA）常用於檢查特異抗體。先將已知特異抗原包被固相載體，加入待檢標本（可能含有相應抗體），再加入酶標抗Ig的抗全（即第二抗體），經加底物顯色後，根據顏色的光密度計算出標本中抗體的含量。
（3）BAS-ELISA：近年來對酶免設分析法的改進是使用生物素-親合素-過氧化物酶復合物作為指示劑，組成一新的生物放大系統進一步提高檢測的敏感度。可用來檢測多種抗原抗體系統如細菌、病毒、腫瘤細胞表面抗原等。一個親合素（avidin）分子可以結合4個生物素分子（biotin）。結合非常穩定。親合素和生物素都可與抗全、酶、熒光素等分子結合，而不影響後者的生物活性。一個抗體分子可偶聯90個生物素分子，通過生物素又可連接多個親合素。因此大提高檢測的敏感度。目前應用生物-酶標親合素系統（biotinavidin system- ELISA,BAS-ELISA），它是通過生物素標記抗體連接免疫反應系統，同時藉助生物素化酶或酶標親合素引入酶與底物反應系統。