膽汁酸常用檢測方法

1. 膽汁酸的膽汁酸測定對於下列疾病具有重要臨床意義

1．肝膽疾病
2．胃腸疾病
3．引起膽汁酸代謝發生改變的其它疾病
在研究各種疾病對膽汁酸代謝的干擾作用時，經常對生物標本進行嚴格的分級分離，並運用層析技術對各個膽汁酸組分進行詳盡的研究。但是，在臨床實踐中，大多數情況下，如對肝病的篩選，只需對總膽汁酸水平進行簡單的酶學測定。本章將集中計論血清總膽汁酸對肝系統疾病的影響，並對臨床觀察到的大便、膽汁、腸道抽取物等標本中的總膽汁酸病理水平進行簡單的討論。
一、肝膽疾病中的血清膽汁酸
1．急性肝炎
發生急性肝炎時，血清膽汁酸濃度急劇升高。通常情況下，發病初期迅速升高並達到峰值的膽汁酸幾科與ASAT同時恢復於正常水平。但與其他臨床檢驗指標相比，膽汁酸水平恢復至正常進程比較緩慢，呈漸進狀態。
幾項研究已經證實，血清總膽汁酸對於跟蹤檢測病毒肝炎病情汁有價值。在急性病毒性肝炎康復期，餐後血清總膽汁酸水平是一個最靈敏的檢測指標。如果餐後血清總膽汁酸濃度持續升高，說明病毒性肝炎正在向慢性肝炎轉化。對處於急性肝炎康復期的患者，血清膽汁酸水平長期升高，則表明患者有可能發生了嚴重的肝損傷，需要對患者進行仔細的跟蹤監視，並可能需要做肝臟活檢。
2．慢性肝炎
由於常規肝臟檢查對慢性肝炎論斷的相對不敏感性，要評價慢性肝臟疾病(慢性持續肝炎、慢性活動性肝炎、肝硬化)嚴重程度，就必須進行組織學檢測分析。但是，近幾十年來的臨床研究結果表明，血清膽汁本能水平可作為檢測慢性肝炎中肝損傷的一個敏感指標。研究證實血清總膽汁酸濃度數值可以用來區分活動性與非活動性肝炎。血清膽汁酸測定還有助於對慢性肝炎的治療監控，並可以替代需要反復肝臟活檢實驗。
3．肝硬化
肝硬化患者由於膽汁酸貯存量減少，血清膽汁酸濃度升高，尿中硫酸化膽汁酸的排出量出隨之升高。嚴重肝硬化患者，由於功能性肝細胞數量減少，使膽汁酸合成能力受到抑制。但是，中等程度肝硬化患者膽汁酸貯存量的減少，則可能是由於膽汁酸合成調控發生缺陷引起的。肝硬化時，盡管膽汁酸合成總量有所下降，但是血清膽汁酸水平仍然升高，這可能與肝細胞受損、肝實質細胞數量減少以及門靜脈系統分流等因素有關。
肝硬化各個不同時期血清膽汁酸濃度均有所升高，但以肝硬化後期最為明顯。
有些肝硬化病人，盡管膽紅素、轉氨酸、鹼性磷酸酶水平保持正常，但血清膽汁酸水平明顯升高。
當肝硬化活動性減至最低，且其他常規肝功能恢復正常時，血清膽汁酸濃度常常仍然保持升高狀態，因而可將血清膽汁酸水平用於低活性期肝硬化患者的臨床檢測。
4．酒精性肝臟疾病
通常情況下，酒精性肝臟疾病患者的血清膽汁酸濃度明顯升高。與形態學損傷較輕的中度酒精性肝臟疾病患者相比，發生嚴重肝臟損傷的患者，如酒精性肝炎患者、血清膽汁酸濃度升高更為明顯。
最新的研究結果表明，與其他常規肝功能檢測方法如酶檢測、並乳糖減少試驗、BSP檢測法相比，血清膽糖酸測定所得到的關於酒精性肝臟疾病患者肝損傷程度方面的信息更為靈敏和可靠。血清膽汁酸與β-已糖胺酶組合測定，現以被建議作為有價值的評價酒精性肝疾病的檢測方法。
5．膽汁郁積
已經發現，血清膽汁酸的定量測定可作為檢測膽汁郁積的一種靈敏、特異的方法。在發生肝外膽汁阻塞時，血清膽汁酸濃度顯著升高。大多數肝內膽汁郁積患者，如急性肝炎、初級膽汁肝硬化、嬰兒膽汁郁積、妊娠性膽汁郁積、肝癌、良性復發性肝內膽汁郁積患者，血清膽汁酸濃度均明顯升高。
發生膽汁阻塞時，膽汁分泌下降，並迅速改變膽汁酸貯存量的分布，使得血清和尿液中的膽汁酸濃度顯著升高。
現已發現，大多數膽汁郁積患者血清中的鹼性磷酸酶、5i-核苷酸酶和γ-谷氨醯轉移酶的活性也明顯升高。膽汁阻塞時上述酶活性升高的機理目前尚不清楚。最可能的機理是:膽汁郁積發生時，肝臟中的這類膜結合酶產生誘導作用，隨後在膽汁酸的作用下濾過微管膜。
血清膽汁酸水平在發生膽汁阻塞後迅速達到峰值，並在此後長期的阻塞過程中基本保持不變。與此相反，膽紅素水平則在膽汁阻塞過程中緩慢升高。血清鹼性磷酸酶活性升高則呈不規則性，個體間差異性較大。
通過引流法解除肝外膽汁酸阻塞後，血清膽汁酸水平迅速降低。而血清膽紅素、鹼性磷酸酶和γ-谷氨醯轉移酶等的活性則在外部引流過程中慢慢恢復至正常。
但是，血清總膽汁酸測定似乎在監別診斷肝內膽汁郁積和肝外膽汁郁積方面作用不大。
6．初期膽汁肝硬化
初期膽汁肝硬化是一種膽汁郁積性疾病，這時的肝實質損傷可能是最小的，常規肝功能檢測僅能發現輕微的改變。對於大多數初期膽汁酸肝硬化患者來說，血清膽汁酸水平明顯升高，因此可將其用作評價此症的一項有價值的診斷指標。初期膽汁酸肝硬化早期階段，盡管空腹血清膽汁酸可能仍保持在正常范圍內，但餐後膽汁酸水平卻異常升高，說明膽汁肝硬化確已發生。
7．妊娠性膽汁郁積
無並發症妊娠時，血清總膽汁酸水平始終維持在正常范圍內，盡管隨著孕期的推移，經常會發生CDCA水平升高的現象。
但發生妊娠性膽汁郁積時，血清膽汁酸水平明顯升高。因此，膽汁酸的測定有助於鑒別診斷膽汁郁積性瘙癢和非膽汁郁積性瘙癢。
其他一些檢測指標，如γ-GT、膽經素、鹼性磷酸酶等，在正常妊娠過程中經常呈波動狀態，因此在這些情況下，血清膽汁酸具有重要的診斷價值。
8．兒科肝臟疾病
由於未成熟膽汁酸的代謝，新生兒血清膽汁酸水平明顯高於成人。發生新生兒肝炎及各種兒科膽汁郁積症時，患者空腹膽汁酸水平均急劇升高。但是，測定血清總膽汁酸似科並不足以鑒別診斷各種新生兒肝膽疾病。各個膽汁酸組分的測定，則不僅可為新生兒肝炎及其它各種不同類型的兒科膽汁郁積症提供病因學指征，而且政治家 助於對此類病症病情進展、病理活性、治療反應跟蹤監測。
9．中毒性肝臟疾病
現已證實，經常接觸肝細胞毒性物質可造成急性或慢性肝損傷。某些工業用有機溶劑，如四氯化碳、四氯乙烷等對肝細胞均有嚴重的損害作用。
由於環境中潛在的肝細胞毒性物質種類正在不斷增加，因此，臨床檢驗界迫切需要靈敏的篩選方法，對職業性和非職業性臟臟疾病進行早期檢測。
大多數常規肝功能檢測指標，如轉氨酶、γ-谷氨醯轉移酶等，對中毒性肝臟疾病早期診斷極不敏感。但是，血清膽汁酸的測定對於肝細胞毒性物質引起的輕度肝臟疾病的檢測篩選頗有價值。
最近的一項研究表明，在受檢的23名職業性接觸聚笨乙烯的工人中，11名工人的血清膽汁酸水平明顯升高，僅3名工人的肝臟酶指標升高比較明顯。對接觸氯乙烯的職業工人的檢測結果出表明，空腹血清膽汁酸水平可作為早期肝損傷的一項敏感的檢測指標。
血清膽汁酸的測定，對於檢測肝細胞毒性葯物急性中毒患者的肝損傷，以及跟蹤檢測此類患者的肝功能均具有重要價值。在檢測肝細胞毒性葯物的治療劑量效應方面，血清總膽汁酸水平也是一項重要的檢測指標。

2. 常用生化檢測項目分析方法舉例及參數設置

常用生化檢測項目分析方法舉例及參數設置

常用生化檢測項目有哪些你知道嗎?你對常用生化檢測項目了解嗎?下面是我為大家帶來的關於常用生化檢測項目分析方法舉例及參數設置的知識，歡迎閱讀。

一、常用生化檢測項目

1.終點法檢測常用的有總膽紅素(氧化法或重氮法)、結合膽紅素(氧化法或重氮法)、血清總蛋白(雙縮脲法)、血清白蛋白(溴甲酚氯法)、總膽汁酸(酶法)、葡萄糖(葡萄糖氧化酶法)、尿酸(尿酸酶法)、總膽固醇(膽固醇氧化酶法)、甘油三酯(磷酸甘油氧化酶酶法)、高密度脂蛋白膽固醇(直接測定法)、鈣(偶氮砷Ⅲ法)、磷(紫外法)、鎂(二甲苯胺藍法)等。以上項目中，除鈣、磷和鎂基本上還使用單試劑方式分析因而採用一點終點法外，其它測定項目都可使用雙試劑故能選用兩點終點法，包括總蛋白、白蛋白測定均已有雙試劑可用。

2.固定時間法苦味酸法測定肌酐採用此法。

3.連續監測法對於酶活性測定一般應選用連續監測法，如丙氨酸氨基轉移酶、天冬氨酸氨基轉移酶、乳酸脫氫酶、鹼性磷酸酶、γ谷氨氨醯基轉移酶、澱粉酶和肌酸激酶等。一些代謝物酶法測定的項目如己糖激酶法測定葡萄糖、脲酶偶聯法測定尿素等，也可用連續監測法。

4.透射比濁法透射比濁法可用於測定產生濁度反應的項目，多數屬免疫比濁法，載脂蛋白、免疫球蛋白、補體、抗"O"、類風濕因子，以及血清中的其他蛋白質如前白蛋白、結合珠蛋白、轉鐵蛋白等均可用此法。

二、分析參數設置

分析儀的一些通用操作步驟如取樣、沖洗、吸光度檢測、數據處理等，其程序均已經固化在存儲器里，用戶不能修改。各種測定項目的分析參數(analysisparamete)大部分也已設計好，存於磁碟中，供用戶使用;目前大多數生化分析儀為開放式，用戶可以更改這些參數。生化分析儀一般另外留一些檢測項目的空白通道，由用戶自己設定分析參數。因此必須理解各參數的確切意義。

一、分析參數介紹

(一)必選分析參數

這類參數是分析儀檢測的前提條件，沒有這些參數無法進行檢測。

1.試驗名稱 試驗名稱(test code)是指測定項目的標示符，常以項目的英文縮寫來表示。

2.方法類型(也稱反應模式) 方法類型(assay)有終點法、兩點法、連續監測法等，根據被檢物質的檢測方法原理選擇其中一種反應類型。

3.反應溫度 一般有30℃、37℃可供選擇，通常固定為37℃。

4.主波長 主波長(primary wavelength)是指定一個與被測物質反應產物的光吸收有關的波長。

5.次波長 次波長(secondary wavelength)是在使用雙波長時，要指定一個與主波長、干擾物質光吸收有關的波長。

6.反應方向 反應方向(response direction)有正向反應和負向反應兩種，吸光度增加為正向反應，吸光度下降為負向反應。

7.樣品量 樣品量(sampling volum)一般是2μl～35μl，以0.1μl步進，個別分析儀最少能達到1.6μl。可設置常量、減量和增量。

8. 第一試劑量 第一試劑量(first regengt volum)一般是20～300μl，以1μl步進。

9. 第二試劑量 第二試劑量(second regengt volum)一般也是20～300μl，以1μl步進。

10.總反應容量 總反應容量(total reacting volum)在不同的分析儀有一個不同的規定范圍，一般是180～350μl，個別儀器能減少至120μl。總反應容量太少無法進行吸光度測定。

11.孵育時間 孵育時間(incubate time)在終點法是樣品與試劑混勻開始至反應終點為止的時間，在兩點法是第一個吸光度選擇點開始至第二個吸光度選擇點為止的時間。

12.延遲時間 延遲時間(delay time)在連續監測法中樣品與反應試劑(第二試劑)混勻開始至連續監測期第一個吸光度選擇點之間的時間。

13.連續監測時間 連續監測時間(continuous monitoring time)在延遲時間之後即開始，一般為60～120s，不少於4個吸光度檢測點(3個吸光度變化值)。

14.校準液個數及濃度 校準曲線線性好並通過坐標零點的，可採用一個校準液(calibrator);線性好但不通過坐標零點，應使用兩個校準液;對於校準曲線呈非線性者，必須使用兩個以上校準液。每一個校準液都要有一個合適的濃度。

15.校準K值或理論K值 通過校準得到的K值為校準K值(calibrate coefficient)或由計算得出的K值為理論K值。

16.線性范圍 即方法的線性范圍(linearity range)，超過此范圍應增加樣品量或減少樣品量重測。與試劑/樣品比值有關。

17.小數點位數 檢測結果的小數點位數(decimal point digit)。

(二)備選分析參數

這類分析參數與檢測結果的准確性有關，一般來說不設置這類分析參數，分析儀也能檢測出結果，但若樣品中待測物濃度太高等，檢測結果可能不準確。

1.樣品預稀釋 設置樣品量、稀釋劑量和稀釋後樣品量三個數值，便可在分析前自動對樣品進行高倍稀釋。

2.底物耗盡值 底物耗盡值(substrate exhaust limit)在負反應的酶活性測定中，可設置此參數，以規定一個吸光度下降限。若低於此限時底物已太少，不足以維持零級反應而導致檢測結果不準確。

3.前區檢查 免疫比濁法中應用，以判斷是否有抗原過剩。將終點法最後兩個吸光度值的差別(ΔA)設置一個限值，如果後一點的吸光度比前一點低，表示已有抗原過剩，應稀釋樣品後重測。

4.試劑空白吸光度范圍 超過此設定范圍表示試劑已變質，應更換合格試劑。

5.試劑空白速率 連續監測法中使用，是試劑本身在監測過程中沒有化學反應時的變化速率。

6.方法學補償系數 用於校準不同分析方法間測定結果的一致性，有斜率和截距兩個參數。

7.參考值范圍 對超過此范圍的測定結果，儀器會列印出提示。

(三)某些參數的特殊意義

1.最小樣品量 最小樣品量是指分析儀進樣針能在規定的誤差范圍內吸取的最小樣品量。一般分析儀的最小樣品量是2μl，目前也有小至1.6μl的。在樣品含高濃度代謝產物或高活性酶濃度的情況下往往需採用分析儀的最小樣品量作為減量參數，從而使分析儀檢測范圍(與線性范圍不同)的上限得以擴大。

2.最大試劑量 方法靈敏度很高而線性上限低的檢測項目，如血清白蛋白的溴甲酚氯法測定，以往手工法操作時樣品量10μl，試劑量4ml，這樣試劑量/樣品量比例(R/S)為200，線性上限則為60g/L。此法移植到分析儀上後，R/S卻很難達到200，致使線性上限變低。因此對這類檢測項目最大試劑量非常重要。

3.彈性速率 在酶活性測定中，當酶活性太高，在連續監測期中已不呈線性反應時，有些儀器具有彈性速率(flexrate)功能，能自動選擇反應曲線上連續監測期中仍呈線性的吸光度數據計算結果，使酶活性測定的線性范圍得以擴大。如AST可從1000U/L擴展至4000U/L，從而減少稀釋及重測次數、降低成本。

4.試劑空白速率 當樣品中存在膽紅素時，膽紅素對鹼性苦味酸速率法或兩點法測定肌酐有負干擾。因為膽紅素在肌酐檢測的波長505nm有較高光吸收，而且膽紅素在鹼性環境中可被氧化轉變，因而在肌酐反應過程中膽紅素的光吸收呈下降趨勢。若在加入第一試劑後一段時間內設置試劑空白速率，因為此段中苦味酸尚未與肌酐反應，而膽紅素在第一試劑的鹼性環境中已同樣被氧化轉變，因而以第二試劑加入後的速率變化，減去試劑空白速率變化，便可消除膽紅素的負干擾，見圖7-8。

二、單波長和雙波長方式

(一)概念

採用一個波長檢測物質的光吸收強度的`方式稱為單波長(mono-wavelength)方式。當反應液中含有一種組分，或在混合反應液中待測組分的吸收峰與其它共存物質的吸收波長無重疊時，可以選用。在吸光度檢測中，使用一個主波長和一個次波長的稱雙波長方式。當反應液中存在干擾物的較大吸收、從而影響測定結果的准確性時，採用雙波長方式更好。

(二)雙波長的作用

雙波長(di-wavelength)測定優點是①消除噪音干擾;②減少雜散光影響;③減少樣品本身光吸收的干擾。從光源，到比色杯、單色器、檢測器的整個光路系統中，均存在著隨時間發生變化的不穩定的檢測信號，即噪音，而雙波長檢測是同時進行的，兩種波長檢測產生的噪音基本上相同，因而能消除噪音干擾。當樣品中存在非化學反應的干擾物如甘油三酯、血紅蛋白、膽紅素等時，會產生非特異性的光吸收，而干擾測定結果的准確性。採用雙波長方式測定可以部分消除這類干擾，提高檢測的准確性。

(三)次波長的確定方法

當被測物的主波長確定之後，再選擇次波長。如根據甘油三酯等干擾物吸收光譜特徵，選擇次波長，使干擾物在主、次波長處有盡可能相同的光吸收值，而被測物在主、次波長處的光吸收值應有較大的差異。一般來說，次波長應大於主波長100nm。以主波長與次波長吸光度差來計算結果。

(四)雙波長的具體應用

對於某些反應速度快且無法設置為兩點終點法的分析項目，尤其是單試劑分析中，可以利用雙波長的方式來部分消除樣品本身的光吸收干擾。目前用單試劑法測定的項目應用雙波長的為血清總蛋白(雙縮脲法)主波長500nm，次波長576nm;血清白蛋白(溴甲酚氯法)主、次波長分別為600和700nm;鈣(偶氮砷Ⅲ法)主、次波長分別為 660、770nm;磷(紫外比色法)主、次波長為340、405nm，鎂(二甲苯胺藍法)主、次波長為505和 600nm。

三、單試劑和雙試劑方式

反應過程中只加一次試劑稱單試劑方式，加兩次試劑便為雙試劑方式。目前的生化分析儀大多可用雙試劑方式分析，其優點是：①可提高試劑的穩定性，多數雙試劑混合成單一工作試劑時，其穩定時間縮短;②能設置兩點終點法，來消除來自樣品本身的光吸收干擾;③在某些項目檢測時能消除非特異性化學反應的干擾。如血清ALT測定，血清中的內源性丙酮酸及其它酮酸也可與試劑中的指示酶(乳酸脫氫酶)起反應，使結果偏高。若先加入缺乏α-酮戊二酸的第一試劑，使其它酮酸與指示酶反應之後再加入含有α-酮戊二酸的第二試劑，啟動真正的ALT酶促反應生成丙酮酸，而丙酮酸與乳酸脫氫酶的反應消耗的NAD+能真正反映ALT的活性，從而消除以上副反應的影響。

四、測定過程的自動監測

各種自動生化分析儀或多或少都具有對測定過程進行各種監測的功能，以便在沒有人"監督"化學反應的情況下提高檢測的准確性。高檔分析儀的監測功能更強。

1.試劑空白監測 每種試劑都有一定的空白吸光度范圍，試劑空白吸光度的改變往往提示著該試劑的變質：如利用Trinder反應為原理的檢測試劑會因酚被氧化為醌而變為紅色;鹼性磷酸酶、γ-谷氨醯轉移酶、澱粉酶等檢測試劑會因基質分解出硝基酚或硝基苯胺而變黃;有些試劑久置後變渾濁。這些情況均可使空白吸光度升高。丙氨酸氨基轉移酶、天冬氨酸氨基轉移酶等負反應檢測項目，其試劑在放置過程中空白吸光度會因NADH自行氧化為NAD+而下降等。

試劑空白的測定方法有兩種：①每瓶試劑在使用前通過對試劑空白校準來確定試劑空白吸光度，這種方式適用於先取樣品後加試劑的分析儀。②每個樣品測定前均檢測試劑空白吸光度，適用於先加試劑後取樣品的分析儀。

2.試劑空白變化速率監測 一些酶試劑在反應溫度下不穩定，其空白吸光度可隨著時間逐漸發生變化，這種變化的主要原因與工具酶或輔酶的純度有關，且因試劑的組成和生產廠家的不同而不同。這種變化會影響測定結果的准確性，一般使結果偏高。如果設置此項監測，分析儀在結果計算時會自動減去試劑空白變化速率。在以監測NAD(P)H減少為指示反應的酶活性測定中，空白速率可監測並消除由NADH自身氧化所造成的吸光度下降;在色素原為底物的酶活性測定中，空白速率可監測並消除底物自身分解造成的吸光度升高。有關空白速率監測在膽紅素對鹼性苦味酸速率法測定肌酐負干擾消除中的作用，已如前述。

3.樣品信息監測 由於樣品的溶血、脂濁、黃疸會對測定結果產生非化學反應的干擾。根據溶血、脂濁、黃疸的光譜吸收特性，用雙波長或多波長檢測其性質和程度，一般是測定樣品在600nm/570nm、700nm/660nm和505nm/480nm吸光度比值的大小來分別判斷樣品溶血、脂濁和黃疸程度。然後在結果計算時自動減去這部分干擾，這將有利於提高分析結果的可靠性。

4.結果可靠性監測

(1)終點監測：終點法測定要判斷所選的測光點是否到達終點或平衡點。一些分析儀在所選終點後再選一個測光點，比較這兩點吸光度的差異來判斷反應是否到達終點。

(2)線性期監測：連續監測法選擇時間-吸光度反應曲線上的線性期來計算酶活性或被測物濃度，因此儀器要確定此連續監測期是否呈線性。其監測方法為①將連續監測到的各吸光度值進行線性回歸，計算出各點的方差，根據方差值的大小來判斷是否呈線性;②取連續監測期開始若干點的變化速率與連續監測期最後若干點的變化速率進行比較，來判斷是否為線性期。

5.底物消耗的監測 在連續監測法測定酶活性時，如果在監測期內吸光度上升或下降超過其底物耗盡值，則說明該樣品酶活性非常高，底物將被耗盡，監測期的吸光度將偏離線性，使測定結果不可靠。此時不列印結果或列印結果同時也列印出底物耗盡提示，該樣品應稀釋一定的倍數重新測定。此監測對於採用負反應分析酶活性的方法甚為重要。見圖7-9

6.方法線性范圍監測 每種待測物分析都有一個可測定的濃度或活性范圍，樣品結果若超過此范圍，分析儀將顯示測定結果超過線性范圍的提示，多數分析儀會自動將樣品減量或增量重新測定。

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3. TBA是什麼意思

硫代巴比妥酸(TBA)法：TBA法的原理是脂質過氧化的降解產物之一一丙二醛(MDA)，可以與硫代巴比妥酸成色。是肝細胞以膽固醇為原料直接合成的膽汁酸，包括膽酸、鵝脫氧膽酸及相應結合型膽汁酸。

TBA法是一非常簡便的方法，一般實驗室均可進行。此法與熒光法、化學發光法等有較好的相關性，但不足之處是靈敏度較差，某些因素應加以控制，如線粒體污染，樣品中的鐵離子等。

(3)膽汁酸常用檢測方法擴展閱讀：

硫代巴比妥酸(TBA)法在520nm處進行比色測定，可檢測丙二醛相對含量的變化，以了解生物膜質過氧化的情況。 TBA法是一非常簡便的方法，一般實驗室均可進行。

此法與熒光法、化學發光法等有較好的相關性，但不足之處是靈敏度較差，某些因素應加以控制，如線粒體污染，樣品中的鐵離子等。