㈠ 原花青素是怎樣提煉除來的
葡萄籽原花青素的提取和檢測方法
1 葡萄籽原花青素的概念、性質和安全性
1．1 原花青素的概念
研究表明，葡萄籽中原花色素物質只有原花青素 一種[21。關於原花青素的定義還不統一。原花青素因在 酸性介質中加熱產生紅色的花青素而得名【3】，而兒茶素 類單體在熱酸條件下反應沒有花色素現象，所以兒茶 素單體應不屬於原花青素。這個概念也得到了美國葡 萄籽方法評定委員會和國內主要生產葡萄籽提取物的企業認可。葡萄籽原花青素是由兒茶素、表兒茶素及其 沒食子酸酯通過C4-C 或C4-C。鍵共價相連組成的多 聚體 ，結構通式見圖l【5J。通常把二～四聚體稱為低聚 體(OPCs)，五聚體及五聚體以上的稱為高聚體。
R=3p—OH兒茶素，R=3p—O一沒食子酸兒茶素O一沒食子酸酯 R-3a-OH表兒茶素。R-3a-O一沒食子酸表兒茶素o-沒食子酸酯
圖1 原花青素的結構及其組成單元
1．2 原花青素的主要性質
原花青素在熱酸條件下能夠生成紅色的花青素，此性質可用於原花青素的定性和定量分析。結構中具 有較多的羥基，具有較大的極性，使其能夠很好的溶解 於水、甲醇、丙酮、乙醇等極性溶劑而不溶解於苯、氯 仿、石油醚等非極性物質。較多羥基結構也使其成為良 好的氫原子給予體，具有較強的抗氧化性質。研究表 明，在0 一、·OH、·CH，中，原花青素對0：一·清除能力最 好，而且在聚合度2～5之間范圍內，隨聚合度增加而增 加柳。對其構效關系分析表明，帶有沒食子醯基的原花青 素具有更強的抗氧化活性，二聚體的抗氧化活性均比單 體兒茶素的活性強。c 一c 連接的二聚體比c 一c 連 接的二聚體具有更強的抗氧化活性 。原花青素的最大 吸收波長在280 nm附近，使其具有較強的紫外吸收能 力。以上的主要性質使原花青素很好的用於保健食品 和化妝品的開發。
13 原花青素產品的安全性
美國Creighton大學葡萄籽原花青素研究組與美 國環境保護局根據有毒物質控制條例健康效果測試手 冊協同進行了葡萄籽原花青素萃取物(GSPE)的一系 列毒性和生物功效研究。結果證明GSPE具有很高的 安全性和很好的清除自由基、抗氧化能力【8】。日本學者 Yamakoshi等也採用一系列毒理性試驗確證富含原花 青素的葡萄籽提取物具有很高的安全性。完全可以用 於功能性食品的開發.
2 原花青素的提取方法
提取原花青素常用的方法有水提取法、有機溶劑一 水提取法和儀器輔助提取法。葡萄籽中的原花青素物 質通常以結合態與蛋白質、纖維素結合在一起fl01，一般 不易提出，通常選用有機溶劑或水提取，具有斷裂氫鍵 的作用。同時由於有機溶劑的滲透性較差，一般不單獨 使用，常需要水作為傳質劑。
2．1 水提取法
Masquelier~l-嘬早從松樹皮中用沸水粗提、乙酸乙 酯純化得到原花青素。選水作為提取劑，浸提耗時長， 溫度高，容易造成原花青素的損失。同時水的極性較 大，溶出雜質也較多。
2．2 有機溶劑一水提取法
甲醇、丙酮、乙醇和乙酸乙酯是提取葡萄籽原花青 素常用的有機溶劑，它們對原花青素有很好的溶解性， 它們的極性大II,Jt~序為甲醇>乙醇>丙酮>乙酸乙酯。 乙醇是常用的提取溶劑，價格低廉，來源豐富。乙酸乙 酯提取出的原花青素成分生物活性較好，但是由於極 性較小，對原花青素的提取並不完全。甲醇和丙酮水溶 液(50％～75％)對原花青素都有較好的提取性能，同時也多用做原花青素含量測定時的提取溶劑。熊何 -21比 較了甲醇、乙醇、丙酮水溶液對多酚的提取效果，結果 表明70％丙酮水溶液為最好溶劑。丙酮水溶液提取效 果好的原因：原花青素分子含有多個苯環和醚鍵，油溶 性較強，同時又有大量的羥基連接在分子骨架上，在水 中具有很好的溶解性，擁有油水雙溶性的丙酮與之相 互匹配，原花青素的溶解度自然增加，其提取率相應得 到提高。
2-3 儀器輔助提取法
超臨界萃取和超聲波輔助提取越來越多的用於葡 萄籽原花青素的提取。超臨界CO：萃取率高，而且使原 花青素不受到空氣和光的影響，但由於設備昂貴，推廣 使用比較困難。超聲波法應用比較廣泛，超聲波產生的 強烈振動、高的加速度、強烈的空化效應、攪拌等特殊 作用，可以破壞植物的細胞壁，使溶劑滲透到細胞中， 令其中的化學成分溶於溶劑中，從而提高提取效率。 在提取原花青素之類的熱敏性物質顯示出優越的性 能.
3 葡萄籽原花青素的檢測
由於葡萄籽和葡萄籽提取物中大多數多酚是原花 青素(一般佔70％～85％)，所以很多廠家使用原花青 素來標定其中有效成分的含量。原花青素含量是反映 葡萄籽提取物或葡萄籽質量的關鍵指標，主要有兩個 指標，分別為原花青素值和原花青素含量。
3．1 原花青素值的測定
原花青素值的測定採用Bates—smith法和Poaer 法。原理：原花青素在酸性條件下加熱轉化為紅色的花 青素，而兒茶素、表兒茶素等黃烷一3一醇單體沒有此反 應(圖2)。它們測出的結果是原花青素的相對含量，分 別用原花青素指數和PVU表示，是根據經驗公式求得 的。葡萄籽提取物中的原花青素指數一般在80～100之 間，PVU一般在250～350之間。
原花青素值只是相對含量，並非原花青素的真實 含量。據調查，同為原花青素值95的產品，多酚含量相 差15％，質量大相徑庭四。很多生產廠家使用原花青素 指數來表示葡萄籽提取物中原花青素的百分含量是錯誤的。
圖2 花青素生成反應 Fig．2 Reaction ofprocing cyaniding
3．2 原花青素含量的測定
原花青素的含量測定方法很多，也比較混亂。常用 的有以下幾種方法。
3．2．1 鐵鹽催化法
此方法的反應原理與原花青素值測定原理相 同，在計算原花青素的含量時使用了原花青素標准 品。Fe¨、鹽酸為常用的催化劑和酸解劑。由於水、乙 醇為反應介質時吸光值很低，一般採用正丁醇為反 應介質【15-161。通常的具體操作：取1．0 mL樣液(或原花 青素溶液)於10 mL刻度試管中，加入6．0 mL正丁醇一 濃鹽酸(95：5)與2％ 硫酸鐵銨溶液(溶解於2 mol／L 鹽酸)0．2mL，混勻，置於沸水浴中加熱40min後，立即 取出用冰水快速冷卻至室溫，在550 Nm處測定吸光值。
此方法較簡便，而且對原花青素的選擇性反應較 好。鐵鹽催化法對反應體系中的含水量和Fe 濃度要求 比較嚴格，一般要求含水量6％，Fe 濃度4．5x10 ％， 而且過高的Fe¨濃度對反應沒有影響【l51。傅武勝【l61 研究表明3％～4％為合適的含水量，Fe 濃度選擇在 9．OxlO ％左右。但是也有學者總結分析2％～6％含 水量對花青素的形成有抑製作用，稍高的Fe¨濃度 (>15 g／L)也抑制花青素的生成.
在鐵鹽催化反應的基礎上，楊大進【l I等人利用高 效液相色譜法檢測了原花青素含量。該方法將原花青 素在上述鐵鹽催化條件下生成的深紅色花青素離子 進行高效液相色譜分析，從而確定原花青素的含量。 此方法能夠排除部分雜質的影響，具有定性定量准確 的優點。
3．2．2 香草醛法
測定原理：原花青素和兒茶素類單體的A環的化 學活性較高，在酸性條件下，其上的問苯二酚或間苯 三酚與香草醛發生縮和，產物在濃酸作用下形成紅色 的正碳離子，樣品的濃度與產生的顏色呈正相關，在500 llm波長下測定其吸收光值【l91(圖3)
圖3 酚醛縮合反應
香草醛法測定時，一般以兒茶素為標准物，以甲醇為溶劑。鹽酸、硫酸均可作為反應過程的催化劑，但在 使用硫酸時，濃度不易過高，過高的硫酸易使香草 醛發生自縮合反應和氧化分解 。具體的操作方式 較多：1 mL試液+2．5 mL 1％香草醛甲醇溶液+2．5 mL 25％硫酸或8％鹽酸(均溶解於甲醇)，30。【二下反應 15 min～20 min【2l。丑 ；1 mL試液+6 mL 4％香草醛甲醇 溶液+3 mL濃鹽酸，室溫下反應15 minL231；有的更是在 2O℃下反應15 h[241。操作方式差別較大，不利於使用 者的選擇，有待於統一。
3．2_3 紫外分光光度法
原花青素為無色物質，在可見光區無特徵吸收峰， 在紫外區有唯一特徵吸收峰，最大吸收波長在280 Nm 處。盡管此方法簡單快捷，但是此方法只適用於原花青 素含量純度特別高的產品，不適合一般原料中原花青 素的檢測。這是因為兒茶素類在280 Nm處也有最大吸 收，V 、Vc、Ve。、Ve 、蘆丁、B一胡蘿卜素等物質在此波長 處都有明顯的吸收.
3．2．4 Folin—Ciocaheau與HPLC結合法
此方法為美國葡萄籽方法評定委員會推薦使用的 方法。Folin—Ciocaheau法測定的是多酚含量，一般以沒 食子酸為對照物。在鹼性溶液中，多酚可以將鎢鉬酸還 原，生成藍色的化合物，在760 Nm處有最大吸收。葡萄 籽提取物中的多酚含量一般在75％～95％之間。利用 HPLC測定沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒 食子酸酯四種單體的含量來代表單體的總量。這是因 為它們四種單體的含量佔到了葡萄籽提取物中單體含 量的90．0％以上。原花青素的含量則為多酚含量與單 體含量相減之差。
此方法缺點是蛋白質、氨基酸、核酸、抗壞血酸等 易被氧化的物質也參與Folin—Ciocalteau反應。同時由 於葡萄籽提取物中沒食子酸含量甚微(0％～1．2％)，與 兒茶素(1．5％～7．3％)和表兒茶素(2．0％～5．1％)含量 相差懸殊四，原花青素含量用沒食子酸量來表示缺乏 代表性。
3．2．5 鉬酸銨分光光度法
它是基於鄰苯二酚與鉬酸銨在弱酸性介質中生成 黃色鉬酸酯，反應產物在333 nm波長處具有最大吸收。 馬亞軍 寸檢測條件進行了簡單摸索：取0．08 mol，L鉬 酸銨1 mL溶液置於25mL比色管，加人適量試液，用 1．OxlO mol／L鹽酸沖至刻度，反應瞬間完成。
根據反應原理，花色素、沒食子酸、兒茶素類都具 有鄰苯二酚結構，也參與鉬酸酯的生成，測定原花青素 的選擇性不高，受到雜質影響較大。
3．2．6 其它測定方法
馬亞軍 對原花青素含量測定方法進行了研究： 高鐵鹽一鐵氰化鉀分光光度法，它是基於原花青素能將 Fe 還原成Fe ，Fe 與鐵氰化鉀生成可溶性深藍色配 位化合物，在710 nm處有最大吸收的原理；硫酸高鈰 銨分光光度法，它是基於原花青素與Ce「在強酸性介 質中反應生成無色的Ce ，Ce「在319 nm波長處具有 最大吸收，通過測定黃色高鈰鹽的吸光度，間接測定原 花青素。另外還有流動注射一抑制化學發光法[271：在鹼 性條件下，利用原花青素還原H：O：可抑制魯米諾一 H20 體系的化學發光，其抑制的程度與原花青素濃度 之間呈線性關系。這三種方法如同Folin—Ciocaheau法 利用多酚的還原性質測定多酚含量的原理，結果都擴 大了原花青素的含量。
綜上所述，原花青素值的測定只是根據經驗公式， 並不是原花青素真實含量，與現代檢測方法相落伍。鐵 鹽催化法測定原花青素專屬性較強，有很好的應用前 景，但仍需要進一步的研究與改進。香草醛法測定的是 原花青素和黃烷一3一醇單體的總量，與HPLC法檢測黃 烷一3一醇單體：兒茶素、表兒茶素含量相結合起來可以 計算原花青素的含量。但是香草醛法操作方式較多，不 利於使用者選擇，具體操作方法還需要進行統一。國外 有學者利用HPLC／MS技術分析和檢測原花青素，過程 比較復雜，技術要求高，不能廣泛應用於原花青素產品 的測定。
4 展望
葡萄籽原花青素擁有高效的抗衰老、抗心血管疾 病、抗癌功能，此外還具有抗輻射、抗疲勞，改善記憶力 等作用，顯示出了無比的優越生物活性和安全性。目前 我國生產和銷售葡萄籽提取物就有50多家，年生產能 力超過80 t。因此，為了與葡萄籽提取物行業的蓬勃發 展相適應，迫切需要建立起統一的葡萄籽及其產品中 原花青素含量的測定方法，以利於企業的生產貿易、產 品的質量控制和顧客的消費指導。
㈡ 花青素含量的測定
方法1:原花色素的測定方法（分光光度法）
本方法適用於各種植物組織、器官及其制劑（如葡萄子與松樹皮提取物）中原花色素含量的測定。
1. 方法提要
原花色素（也稱縮合單寧）是黃烷-3-醇的寡聚體與多聚體，屬多酚類化合物。與其他酚類化合物不同，黃烷醇（縮合單寧，單體，雙體等）在酸性介質中可與香草醛反應，生成在500nm處有最大吸收的有色物質，可通過比色測其含量。
2. 儀器
分光光度計。
3. 試劑
所用水為去離子水或同等純度蒸餾水。
（1）香草醛、甲醇、濃鹽酸均為分析純級。
（2）提純的原花色素或兒茶素。
（3）4%香草醛甲醇液。
（4）標准使用液：將提純的原花色素溶於蒸餾水，製成1mg/mL儲備液，將儲備液稀至濃度為1×10-2mg/mL至1mg/mL的標准使用液。標准使用液應於測定當天配製。
如無提純的原花色素，可用兒茶素代替，配製方法同上。
4. 測定步驟
（1）樣品中原花色素的制備：植物材料經4倍體積丙酮+水（7+3，體積比）或者經60%甲醇提取，40℃以下減壓蒸餾去除有機溶劑，水相再經乙醚洗滌後定容。
冰凍乾燥的固體原花色素制劑，直接溶於水中（先加少量甲醇助溶）製成原花色素液。
原花色素液於5℃下暗環境中保存備用。
（2）樣品測定：用錫箔將試管（14mm×20mm）包裹嚴，僅留管口用於加樣。向管內加入試樣0.5mL，再加3.0mL 4%香草醛甲醇液混合，然後加入1.5mL濃鹽酸，徹底混勻，室溫下顯色15min。也可在暗環境下進行以上操作。最後在500nm處比色。
可按以上操作步驟製得標准曲線（即0.1mg原花色素在500nm處的吸收值為0.55）。
5. 結果計算
計算原花色素量的公式，
原花色素（1×10-3mg）=A500nm÷0.55×100×V
式中 V——試樣稀釋體積（倍數）。
6. 注釋
（1）本方法的檢測范圍為（5~500）×10-3mg/0.5mL樣液。精密度與准確度大於1×10-3mg。
（2）反應試管應用清潔劑浸泡24h，徹底洗滌干凈。
（3）進行比色時，用水作空白。
（4）500nm處的OD值應控制在3以下。
（5）試樣中原花色素含量較高時，應從香草醛存在下所測A500nm值中減去無香草醛時所測值。
（6）顯色液應避光放置。
方法2:保健食品中原花青素含量的測定方法
1、原理
原花青素易溶於含羥基的溶劑如甲醇等，本方法是將樣品中的前花青素，用甲醇提取，加入鹽酸家溫水解後將其轉化為深紅色氰定（C15H10O6·HCL）後進行高壓液向色譜測定。
2、試劑：
2.1二氯甲烷 分析純
2.2甲醇 色譜純
2.3異丙醇 分析純
2.4甲酸 分析純
2.5鹽酸 分析純
3、檢驗方法
3.1樣品 稱取約500mg油溶性樣品於100ml錐形瓶中，加入5.0ml二氯甲烷，振搖使其溶解。加入45.0ml甲醇，振搖5min後過20μm濾膜。取5.0ml濾液於25ml容量瓶中，加入5.0ml3mol/L鹽酸，振搖並用異丙醇定容至刻度。立即過5μm濾膜，取出一部分置於試管中，塞緊瓶塞並在100±5℃烘箱中放置45min進行水解，取出後放置至室溫後進行液相色譜分析。
3.2標准 除稱取25.0mg標准品於100ml錐形瓶中外，其餘步驟均同樣品。
3.3定量方法 標准曲線外標法定性定量分析。
4、色譜分析條件
4.1流動相：水：甲醇：異丙醇：甲酸＝73：13：6：8
4.2檢測波長：525nm
4.3色譜柱：島津Shim－Pak CLC ODS 15cm×6mm
4.4柱溫：35℃
4.5流速：1ml/min
㈢ 怎麼檢測食物中是否含有花青素
花青素的測定方法和可以套用原花青素的測定方法，原花青素本身沒有顏色，就是水解成花青素才有顏色，如果測定的是花青素就不用水解了。花青素是一類有顏色物質的總稱，是一種混合物，所以選用不同的對照品就會有不同的結果，只能以某一種單一成分計。
㈣ 花青素的純化方法
原花青素(簡稱PC)是植物界中廣泛存在的一大類多酚類化合物。植物化學家通常將從植物中 分離得到的一切無色的，在無機酸存在和加熱處理下能產生紅色的花青素(cyanidin)的一類多酚化 合物統稱為原花青素。從20世紀60年代初至今，原花青素抗氧化、清除自由基等一系列化學反應已 被初步揭示，這類天然產物在醫葯、食品、日用化 學品等領域的應用日益廣闊。全世界對原花青素的研究越來越深入，其中對原花青素提取、分離、純 化方法的研究是一大重點，現將原花青素提取、分 離、純化方法綜述如下。
1 原花青素的提取方法
植物材料中原花青素的提取率與材料的狀況和 提取條件密切相關。植物材料的貯存、乾燥、粉碎 度，提取溶劑、溫度等都可能導致原花青素化學結 構的變化和提取率的改變，從而改變原花青素的理化性質和生物活性.
當測定原材料中的原花青素含量時，貯存時間 越長，可能會導致測定結果降低。同時樣品中的水 分含量也會導致測定結果降低。而且乾燥條件的不 同也會導致提取率的變化，最好是採用冷凍乾燥， 避免高溫。
樣品提取前一般要經過粉碎，通常較細的粉末 有利於提取，但過細時提取率反而會降低。
提取劑的選擇也是影響提取率的關鍵因素。因 為原花青素在植物體內通常與蛋白質、多糖等以氫 鍵和疏水鍵形式形成穩定的分子復合物，原花青素 分子間也是如此。因此原花青素的提取劑，不僅要 求對其有很好的溶解性，而且還必須有氫鍵斷裂作 用。因此有機溶劑和水的復合體系(有機溶劑占總 體積的50％～70％)最適合提取。有機溶劑的提 取能力順序為丙醇<乙醇<甲醇<丙酮<四氫呋喃，其中應用較多的是丙酮一水體系和甲醇一水體 系。
當植物樣品中鐵等金屬離子含量較大時，原花 青素在中性條件下與金屬離子發生絡合沉澱，沉積 在纖維中不利於提取。此時也必須採用酸化溶劑， 一方面斷裂原花青素與蛋白質、多糖及本身離子間 的氫鍵和疏水鍵，另一方面斷裂原花青素一金屬離 子絡合鍵，提高提取率。
1．1 傳統有機溶劑提取
Ayroles等在1991年發明酮類化合物水溶液作 提取劑提取銀杏葉中的原花青素的方法。採用酮類化合物的水溶液作提取劑，提取液過濾後，用鹼調 節濾液pH值至9左右，使原花青素沉澱，再用酸 調節濾液至pH值為2左右，在(NH4) SO 存在條件下用c ～c 酮類萃取濾液中的原花青素，除去酮類 化合物，乾燥。
Romanczyk等發明從可可中提取原花青素時， 對脫脂可可豆用質量分數70％MeOH／去離子水提 取後，再用質量分數70％丙酮／去離子水溶劑提取 2次，真空濃縮，除去有機溶劑後，再溶於水中， 用CHC1，提取，其水相用乙酸乙酯提取後，真空濃 縮除去乙酸乙酯，水相冷凍乾燥，得到原花青素。
1．2 綠色溶劑—— 水提取技術
由於丙酮等有機溶劑可能帶來環境污染和產品 的有毒有機物殘留，人們在大力發展對環境友好的綠色提取技術。1998年Duncan和Gilmour發明一 種從植物材料(樹皮、樹葉、葡萄籽、皮、大豆、綠茶)中提取原花青素的方法。將材料粉碎(≤15 mm)，常壓、60℃～100℃或高壓100℃～125℃條 件下採用脫氧熱水提取(1 min～20 h)，過濾採用超濾 或反滲透或兩者連用，濃縮濾液，真空噴霧或冷凍 乾燥，此法主要是提取分子量≤5 000 D的水溶性原花青素，得率為0．5％～10．0％之間，通常為6．5％ 一9．6％ (隨取樣部位的差異而定)，分離得到原花 青素B 、B，、B 和c 。獲得的產物對AAPH引發 的亞油酸的氧化有明顯抑製作用，1肛g／mL能達 到70％～79％的抑制率。毒理學檢測表明：對於按人體重劑量給葯組和100倍人體重量的劑量給葯組 24 h內無毒害和副作用產生，慢性毒理學(5個月) 實驗也無明顯毒、副作用。
1999年Karim等人發明了在加壓條件下，採用 脫氧去離子水提取植物材料中的原花青素。將提取 液超濾後，採用疏水性微孔聚合物樹脂作填料的柱 色譜方法，選用極性洗脫液(乙醇+水)洗脫，將 洗脫液採用反滲透方法除去乙醇，乾燥得到原花青素。
1．3 超臨界流體萃取技術
孫傳經等發明一種採用超臨界二氧化碳加丙酮 和水組成的極性改性劑，從銀杏葉中萃取含有原花青素提取物的方法。在萃取溫度60℃～90℃，萃取 壓力20 MPa～35 MPa下加入丙酮與水的體積比為 (50％～80％)：(50％～20％)的極性改性劑，萃 取時向2 h-4 h，進行靜態、動態萃取。萃取液經傳統的樹脂濃縮和噴霧乾燥器乾燥，得到精製銀杏葉 提取物。產品含銀杏黃酮甙>35 g／100 g，萜內酯> 8 g／100 g，原花青素<7 g／100 g，酚酸<5 mg／kg。該法的優點是流程短，能萃取最強的天然抗氧化劑原花青素。2000年孫傳經等又發明一種超臨界CO 從黑加侖籽中提取黑加侖籽油和原花青素低聚物的方法。該法分兩步進行：第一步，是利用超臨界 CO 提取黑加侖籽油，控制萃取壓力在25 MPa一 29 MPa，溫度為60℃ ；第二步是超臨界CO2加人 丙酮與水的體積比為70：30的改性劑，CO 與改性 劑流量體積比為4：1，壓力為22 MPa～25 MPa，溫度為60℃，提取原花青素低聚物。黑加侖籽油得 率為16％，原花青素低聚物得率為4％。該法優 點是同時獲得兩種產品，流程簡單可靠，CO 和改 性劑循環利用，產品中無溶劑殘留，對環境無污 染。
1．4 微波提取技術
劉征濤等發明了一種採用頻率為2450 MHz或 915 MHz、功率為500 W～15 000 W 的微波對葡萄籽 在選用水、碳鏈長為C ～C，的醇、乙醚、丙酮、乙 酸乙酯、甲苯或其混合物的溶劑中進行處理，從葡 萄籽提取原花青素類物質的新方法。該方法較常規 化學法工藝簡便、高效、快速，成本低，廢液排放 量少。
1．5 雙水相萃取方法
自1956年瑞典倫德大學的Albertsson發現雙水 相體繫到1979年德國GBF的Kula等人將雙水相萃取分離技術應用於生物產品分離，雖然只有20多 年歷史，但由於其條件溫和，容易放大，目前已成 功地應用於蛋白質、核酸和病毒等生物產品的分離純化。近幾年來，有關雙水相萃取技術提取中草葯 有效成分的文獻開始報道，盡管數量不多，但是已 有的實例充分表明其有良好的應用前景。用雙水相萃取體系富集分離銀杏葉浸提液的研究，表現良好 的分配系數和分離效果。研究認為雙水相體系具有 分相快，使用溫度低，易於操作等待點，且所使用的PEG及鹽類對人體及環境無毒害，萃取率高，為 銀杏黃酮化合物富集分離的一種有效方法。盡管雙 水相萃取對中草葯提取研究的應用處於起步階段，這一技術的應用有望為從天然產物中提取有效成分 提供一個新的思路。
2 原花青素的純化、分離
2．1 液相萃取法
原花青素的純化多採用乙酸乙酯、甲苯、二氯 甲烷、醚等多級有機溶劑通過液相萃取的方法進行，這類方法因為有機溶劑用量大，對環境可能帶 來污染，同時也容易造成產品中有毒有機物殘留。
2-2 柱層析法
目前常採用的純化方法多用柱層析法進行。王 建清等對大麥中的原花青素丙酮提取液，採用 PVPP樹脂作柱層析的填料，以CH CN作流動相進 行純化。
Ricardo da silva等將葡萄用甲醇提取，提取液 回收甲醇後，通過聚醯胺柱進行初步分離，先用中 性水洗去酚酸，再用體積比30：70的乙腈／水洗脫 兒茶素，再用體積比75：25丙酮水洗脫原花青素， 進行純化。
劉睿等採用大孔樹脂對高粱中的原花青素用乙醇 的水溶液進行純化，得到產物純度大於95 g／100 g的 低聚體原花青素。
2．3 固相萃取法
從復雜體系中選擇性地萃取所需成分，固相萃 取(SPE)是其中最為有效的方法之一。1999年 Lazarus等人對杏仁皮、葡萄汁和紅葡萄酒中的原花 青素採用SPE方法進行純化，條件：supelcosil Envi一18 20mL SPE柱，流動相：丙酮：水：乙酸= 70：29．5：0．5 (體積比)。Kennedy和Waterhouse 對紅葡萄酒中的原花青素採用c一18柱(Alhech)， 流動相：水和甲醇。洗脫除去有機酸、糖類和其他 不溶於有機相中的化合物而將提取得到的原花青素 進行純化。
2，4 凝膠色譜法
凝膠色譜也常用於原花青素的純化。 SephadexLH一20是一種對黃酮類化合物具有高度親 和性的羥丙基化葡聚糖凝膠，Sephadex LH一20凝 膠色譜目前多用於原花青素的純化和分離。但 Sephadex LH一20凝膠的物理特性決定其並不能對原花青素進行高效率分離。所以進一步的純化和分離 要採用凝膠過濾色譜或HPLC進行。
此外，Sepherdex 75HR作為平均粒度為13 m 的葡聚糖聚合物，也用於原花青素的純化、分離， 其能承受超過1．8 MPa的反壓，盡管這種材料的商業 柱通常用於蛋白質的分離，發現其分離原花青素的 能力優於Sephadex LH一20。McMurrough和Madigan 將大麥提取液濃縮後，直接採用高效凝膠過濾色譜 (Sepherdex 75HR)，用甲醇洗脫，根據uV檢測， 收集洗脫物，用DMACA鑒定每個組分。Escribano— Bail 6 n et al採用Sephadex LH一20和半制備RP—HPLC對葡萄籽中的原花青素進行純化。
Rigaud等對可可和葡萄籽的提取物，採用凝膠 滲透色譜(GPC)TSK G 2500 Hxl和TSK G3000 Hxl， 採用四氫呋喃(流速1 mL／min)洗脫進行純化。
2．5 微生物發酵法
Ariga等發明一種由活性酵母，可將用水和有 機溶劑提取得到的提取物中的澱粉發酵除去而達到 純化原花青素的目的；同時還發現純化的原花青素 中金屬離子也能較好的被除去，如果提取劑是水和 水／乙醇，能直接濃縮後發酵，若提取劑是丙酮， 則要除去丙酮後才能進行發酵。常用的酵母有：葡 萄酒酵母、酵母屬和接枝酵母屬的菌株。
2．6 高速逆流色譜法
高速逆流色譜技術由美國國家醫學院Ito Yiochiro 博士20世紀60年代首創，最初是一種制備型色譜技術，是一種不用固體載體或支撐體的液液分配色 譜，主要根據化合物在不相溶的兩相間的分配能力 進行分離，具有分離效率高，產品純度高，不存在載體對樣品的吸附和污染，制備量大，溶劑消耗 少，而且操作條件簡單(室溫、Teflon惰性柱材) 的特點。目前已被廣泛用於天然葯物材料的制備和分析。
目前高速逆流色譜儀已成功開發出分析型和制 備型兩大系列。即高速逆流色譜儀既可用於天然葯 物成分的制備分離，又可定量。進樣量從幾毫克到克，進樣體積從幾毫升到幾十毫升，不但適於非極 性化合物的分離，也適用於極性化合物的分離，既 適合於天然產物功效成分的粗分，也可進一步精製、純化。
2-7 分子烙印技術
分子烙印技術(molecular imprinting technology， MIT)是20世紀末出現的一種高選擇性分離技術，由於MIT模仿了生物界的鎖匙作用原理，使制備的 材料具有極高的選擇性，因而很快在許多相關領域 如手性分離和底物選擇性分離、固相萃取、化學或生物感測器、不對稱催化和模擬酶等方面得到了應 用。在普通分離方面，較之傳統方法，MIT法具有 高效、快速、專一的優點。MIT法在手性分離方面的作用更是無與倫比。據統計，現有葯物60％具 有一個或一個以上的手性中心，而對映體間的葯效 及對人體影響有很大不同，因此1992年美國食品和葯物管理局規定，今後含不對稱中心的葯物必須 將光學異構體分離開。相對於傳統方法的一籌莫展，MIT法就顯得非常珍貴了。P>
周力等人在2002年制備了以槲皮素為模板的 分子烙印聚合物(MIP)，從沙棘粗提物中分離提取槲皮素和異鼠李素兩種黃酮，得到良好的分離效果。 謝建春等用非共價法，在極性溶劑中、以丙烯醯胺 作功能單體，以強極性化合物槲皮素為模板，制備了分子烙印聚合物(MIP)。液相色譜實驗表明，MIP 對懈皮素具有特異的親合性，將此MIP直接分離銀杏葉提取物水解液，得到主要含模板槲皮素及與槲 皮素結構相似化合物山奈酚兩種黃酮的組分。研究 證實了MIP技術用於直接分離、提取中草葯中具有特定葯效化合物的可行性。