檢測病毒活性的最佳方法

1. 植物病毒檢測的血清學技術都有哪些

植物病毒的外殼是一種核蛋白，在蛋白的表面帶有抗原決定簇，當植物病毒進入動物體內時，即可產生與抗原相應的抗體，這種帶有抗體的血清即為抗血清。相應的抗原抗體之間可產生專化性的結合，即抗體只能與其相應的抗原結合並產生一定的反應，此即血清反應。這種反應在植物體外也能進行，根據這種反應可以測定兩種病毒間的關系。因而，血清學檢測成為植物病毒的重要鑒定技術。常見的血清反應主要有以下幾種：

中和反應：使含有植物病毒的汁液與相應抗血清中的抗體充分結合，當抗體過量時，可將所有植物病毒抗原全部吸收掉，此時因植物病毒汁液中已沒有病毒粒子存在而失去侵染性。此即為中和反應，不僅可對植物病毒進行定性，還可用於定量測定。

沉澱反應：將一系列稀釋度的抗原（病毒）和一系列稀釋的抗體（抗血清）分別混合，在兩者稀釋比例適宜范圍內可出現沉澱物，此即為沉澱反應。此類反應如：微量沉澱反應，瓊脂雙擴散反應，及免疫電泳等，都是在植物病毒檢驗中最常見的血清學技術。

凝集反應：把病毒的抗體先吸於一種與免疫無關的顆粒表面，然後使其與相應的抗原結合而出現的凝集，即為凝集反應。常用於吸附抗體的顆粒有皂土、乳膠、炭末、血細胞、A蛋白等。

抗體標記：對抗體用熒光素、酶或同位素等進行標記，然後通過對標記物的檢測追蹤抗原，常用的有酶聯免疫吸附、熒光免疫、同位素免疫實驗等，這類檢測技術靈敏度極高，適於對微量抗原的檢測。

現將在植物檢疫中常用的幾種血清學技術介紹於下。

1.微量沉澱反應

在溶有抗原的溶液內按適當比例加入抗血清時，抗原與抗體互相結合而沉澱。其方法如下：

（1）用蠟筆在培養皿底部各劃8條橫豎線形成方格。

（2）取兩排小試驗管，每排7～8個，一排用於抗原，一排用於抗血清，每試管中加0.2ml的緩沖液。

（3）制備1mg/ml純化病毒原液，在抗原稀釋排中加0.2ml原液於第一試管，用1ml的移液管再從中吸0.2ml移至第二管，然後再移0.2ml於第三管，一直移到最後一管，各管的稀釋度分別為原液的1/2至1/128。

（4）在小試管中加1.5ml含0.025%防腐劑NaN3的緩沖液，在緩沖液內混入0.1ml未稀釋的抗血清，制備出1/16稀釋度的抗血清作為原液；在第二排的第一試管中加0.2ml的原液，混合後移0.2ml至第二管，如此一直到最後一管，制備出1/32～1/2048的稀釋系列的抗血清。

（5）用微量移液管從抗血清最高稀釋度（1/2048）開始，在培養皿的第七橫排的每個方格滴加1滴，同樣將1/1024稀釋度的抗血清加到第六橫排，這樣將板上所有的方格均滴加各種稀釋度的抗血清。

（6）用另一移液管從最稀的抗原液開始，在第七縱排每方格內滴加1滴，按同樣方法在第一至第七縱排各方格內滴加各種稀釋度的抗原。在所有第八橫排和縱排的方格內滴一滴緩沖液做對照。隨後在反應液滴上復蓋一層液體石蠟油防止蒸發。

（7）將制備好的培養皿在室溫濕潤環境下孵育2h後，在暗室用雙目解剖鏡觀察，然後在普通冰箱內過夜，第二天繼續觀察結果，此時沉澱已清晰可見。

以最濃的沉澱為四，以下逐漸減弱的梯度分別記為三、二、一，以三為抗原最大稀釋度和產生沉澱的最小血清用量，作為抗原抗體最適比例

微量沉澱技術測定抗原抗體最適反應濃度表

（8）實際測定時，用最適稀釋度的抗血清與其相應的抗原和異種抗原進行反應，或用最適稀釋度的抗原與其相應的抗血清和異種抗血清進行反應，均可觀察它們間的血清學關系。如表0-4-2所示，

微量沉澱技術測定多種抗原間血清學關系表

各供試抗原的稀釋度為1.56mg/ml，與1/4至1/1024的不同稀釋度的抗血清反應結果表明，第一、二、五、六、七橫排的抗原與抗血清的相應抗原是相同的，第三、四兩排抗原與抗血清的相應抗原雖然不同，但有一定親緣關系，第八、十排抗原則與抗血清的相應抗原有遠緣關系或無血清學關系，第九排的抗原則完全無關。

2.瓊脂雙擴散試驗

瓊脂凝膠的含水量極高，允許分子質量20萬u以下的大分子物質自由通過，絕大多數的抗原和抗體分子質量都在20萬u以下，在瓊脂凝膠中的運動所受阻力甚小，可自由擴散，免疫雙擴散就是應用這一原理，在一塊瓊脂凝膠板上打幾個小孔，分別置入抗原及其相應抗體，抗原與抗體分別向凝膠中擴散，形成濃度梯度，在抗原抗體濃度最適比例處，形成肉眼可見的抗原抗體結合物的沉澱帶，帶的大小形狀數量和密度決定於所測試的抗原抗體的特性。本法適於檢測植物粗汁液、澄清液和高度純化的抗原。試驗時需設置健康植物汁液及標准抗原作為陰性和陽性對照。本法的特點是可同時檢測一種抗原對多種抗體，或一種抗體對多種抗原間的血清學關系，對病毒的鑒別極為方便。缺點是靈敏度較低，抗血清用量大，檢測時間長。具體檢測技術如下：

（1）稱取瓊脂加入適當的緩沖液中，用水浴或微波爐加熱至瓊脂溶解，按0.1%加疊氮化鈉。置培養皿或玻璃平板於水平檯面，當瓊脂冷卻至60℃時，倒適當量於板上厚2mm（50mm*9mm的板需9ml，100mm*13mm的板需26ml）。靜置至凝固。

（2）將模式圖置於板下，用打孔器打孔，挑除孔中瓊脂，孔的排列有多種形式，常用的排列，由一個中央孔和周圍六個孔組成，孔的直徑7mm，周圍孔與中央孔的距離為3～4mm。

（3）用緩沖液或生理食鹽水在小試管中稀釋抗原，在周圍孔中加最適稀釋度的抗原，在中央孔中加最適稀釋度的抗血清。外圍孔中加倍比稀釋系列的抗原，中央孔加倍比稀釋系列的抗血清，產生緻密狹窄的沉澱線的組合為最適濃度。

（4）將培養皿在保濕環境下進行孵育，次日在暗背景下觀察沉澱線出現情況。在印有排列模式團的紙上，圖記沉澱線的形式，沉澱線圖形可用照相或染色保留。

（5）結果的判斷：根據沉澱線的形狀分析抗原與抗體，及抗原互相間的關系。

對長形病毒進行瓊脂雙擴散檢測時，可在瓊凝膠介質中加入十二烷基磺酸鈉（SDS），此劑為一種陽離子表面活性劑，可將病毒裂解成具有抗原活性的可擴散的片斷利於檢測。

3.對流免疫電泳

在以瓊脂凝膠為介質的情況下，免疫球蛋白帶有微弱負電荷不能抵消電滲作用，故在電泳時向負極遷移，而一般抗原蛋白帶有較強的負電荷，抵消電滲後仍向正極遷移。依此設計的對流免疫電泳是將瓊脂電泳與免疫沉澱相結合的方法，將抗原病毒放在瓊脂凝膠靠近陰極一側，抗體放在靠近陽極一側，在直流電場中，抗原遷向正極，免疫球蛋白遷向負極，相遇後形成免疫沉澱線。具體技術如下：

（1）凝膠床的制備。取定量瓊脂粉用蒸餾水浸泡2～3d，每日換水1～2次，用硼酸緩沖液配成1%～1.2%的瓊脂液，加0.1%疊氮化鈉。將玻璃放在水平台上用吸管將緩沖液瓊脂注到板面，製成2mm厚的凝膠床並打孔。

（2）將制好的凝膠床放在電泳槽內，加緩沖液（用配製瓊脂凝膠的緩沖液稀釋1倍）離床面2～4cm，在瓊脂板陰極一端孔中加入抗原，在靠陽極一端孔中加入特異性抗血清，在瓊脂床的兩端用兩層紗布使瓊脂板與電泳槽中的緩沖液相連，進行電泳。

（3）進行電泳時，電壓、電流和時間，根據緩沖液離子強度、電泳床大小和抗原性質而有所不同。只要不使病毒抗原變性，盡量保持較高的電壓，如電流超過2mA，電泳應在低溫下進行。

（4）電泳完畢後，將電泳板放在黑色背景處觀察，也可將電泳完畢的瓊脂凝膠板先浸在生理食鹽水中30min，然後放在苦味酸溶液中20min，可將背景染成黃色，沉澱為白色，便於觀察。

免疫電泳與瓊脂雙擴散相比有三個優點，快速、靈敏並可用於在瓊脂中擴散慢的長形病毒。

4.乳膠凝集試驗及A蛋白乳膠凝集試驗

用特異性抗血清提純的免疫球蛋白，將其吸附在乳膠粒子上，制備抗體免疫球蛋白致敏乳膠。當與相應的抗原相遇時即可產生凝集反應。這是一種靈敏度高特異性強的血清學技術，但是每次都要特異性抗血清提取抗體γ球蛋白，制備手續繁雜不便應用，如直接用抗血清致敏乳膠則顯著影響效果。其後Querfurth（1979）發現A蛋白可吸附免疫球蛋白且不影響與相應抗原結合。這樣就可先使A蛋白與乳膠粒子結合，再與抗血清中的免疫球蛋白結合，形成A蛋白-乳膠-免疫球蛋白的復合體。這種乳膠凝集試驗可簡化致敏免疫球蛋白的過程，而獲得同樣效果。具體做法如下。

（1）免疫球蛋白致敏乳膠的制備。

將特異抗血清用33%飽和硫酸鹽析法提取球蛋白，懸浮於0.05mol/L、pH7.2的Tris-HCl（含0.02%PVP）緩沖液內，取10%空白乳膠稀釋15倍後與等量適宜濃度的球蛋白液混合，置室溫2h後移入冰箱內過夜。經低速離心（7000r/min，20min）取沉澱懸浮於緩沖液內，經反復離心洗滌2次後將最後沉澱物懸浮於緩沖液內即可得抗體球蛋白的致敏乳膠。

（2）A蛋白乳膠致敏抗體的制備。

將市售A蛋白溶於0.1mol/L、pH8.2的甘氨酸緩沖液內，製成A蛋白溶液，與等量稀釋15倍的空白乳膠液混合，置室溫3h，移入冰箱過夜。低速離心（7000r/min20min）後將沉澱懸浮於甘氨酸緩沖液，反復離心洗滌2次，沉澱懸浮於甘氨酸緩沖液制備A蛋白乳膠溶液，與等量適宜稀釋度的抗血清混合，置室溫下3h後移入冰箱過夜。再反復離心洗滌2次，最後將沉澱懸浮於與抗血清等等量的甘氨酸緩沖液內，即可得A蛋白乳膠致敏抗體。

（3）檢測法。

用0.05mol/L、pH7.2的Tris-HCl緩沖液（含0.02%PVP，0.02%NaN3）按等倍比稀釋抗原，製成20、40、80、160、320、640、1280的系列濃度，在一潔凈玻璃板上，用筆畫好方格，每格加2滴不同稀釋度的抗原，然後再加1滴乳膠致敏抗體（或A蛋白乳膠致敏抗體）用微量血液振盪器以120r/min振盪混合後，用肉眼或10～25倍解剖鏡觀察結果。同時設空白乳膠液和健汁液對照。

陽性反應表現有明顯的絮狀或顆粒狀凝集物，背景清明透亮，陰性反應則仍為均勻的牛乳狀液。也可用濁度計檢測其凝集度。

此法受健康植株蛋白的干擾較小，適於直接采自病株的澄清液，不但適合球狀病毒，對桿菌狀病毒，棒狀病毒，線狀病毒也適用，並有較高的靈敏度。但對效價低的抗血清或含有乳狀膠體的植物不適用。

5.酶聯免疫吸附試驗

酶聯免疫吸附試驗是一種固相吸附和免疫酶技術相結合的方法，將抗原或抗體包被在固相支持物上，使免疫反應在固體表面進行，並藉助標記在抗體上的酶與底物所產生的顏色，檢測相應的抗原。此法靈敏度高，特異性強，快速簡便極適宜植物檢疫應用。常用的檢測方法有以下幾種：

（1）直接法。

將待測樣品抗原（病毒）加入聚乙烯多孔板內，保溫後洗滌，使附著於壁上的抗原與加入的酶標抗體γ球蛋白反應，洗滌後保留與抗原結合的酶標γ球蛋白，加入酶的底物，用分光光度計進行檢測。

（2）間接法。

先用抗兔球蛋白山羊抗體與酶結合制備酶標記抗體，將待檢抗原包被於固相載體，經過孵育洗滌，加入特異性兔抗血清，孵育洗滌後加羊抗兔酶標記抗體，孵育洗滌後加入底物，觀察結果。

（3）雙抗體夾心法。

先將特異抗體免疫球蛋白包被於固相載體，保溫洗滌後，加待測抗原，使與吸附於載體上的抗體反應，保溫洗滌後再加入特異抗體的酶標記物，最後加底物觀察反應結果。

（4）A蛋白酶聯法。

將A蛋白用pH9.6的甘氨酸緩沖液稀釋後包被微板，加入特異性抗血清，使其與已固定在微板上的A蛋白結合，再加入待測抗原使其與特異性抗體反應，再加入特異性抗體，使其與抗原反應，再加酶標記A蛋白，最後加酶的底物測其光密度值。

（5）異種動物雙抗體夾心法。

先將第一抗體（兔血清抗體）包被微量反應板，加待測抗原後，加適宜濃度的第二抗體（鼠腹水抗體），再加入市售羊抗鼠酶標記物，最後加底物觀察反應，一般8h即可得出結果。此法保持了雙抗體夾心法快速准確靈敏度高的特點，對球狀病毒、桿狀病毒、線狀病毒、棒狀病毒均可應用。抗體不必純化可直接使用（但未純化的抗血清需先選擇其最適工作濃度），使用市售酶標記物，可省去制備酶標記抗體的復雜手續，還可克服間接法非特異性反應干擾大的弱點。

（6）生物素抗生物素酶聯法。

生物素具有很強的親和力，是抗原抗體反應的1萬倍，兩者一旦結合就難以離解，且不受酸鹼變性劑蛋白溶解酶及有機溶劑的影響，具有高度穩定性，生物素一經活化可與蛋白質呈偶聯結合，即一個大分子可結合多個生物素分子，生物素又可大量結合在酶標記物上，使酶標記物成為多價，而抗生物素本身又是一個多價分子，每一亞基均可結合一個生物素分子，因此，這種方法可產生多級放大，使靈敏度提高10倍以上，並降低非特異性反應，把酶聯免疫吸附技術又提高一步。具體方法如下：

先將第一特異抗體（兔抗體或鼠腹水抗體）包被在固相載體，加待檢抗原，加第二特異性抗體（鼠腹水抗體或兔抗體），再加入相應生物素化（羊抗鼠或羊抗兔）免疫球蛋白，再加抗生物素酶結合物，最後加入底物觀察O.D.值。

（7）膜上斑點酶聯法。

先用軟鉛筆在一張適宜大小的硝酸纖維素膜上劃好邊長1cm的方格網，把纖維素膜浸入TBS緩沖液漂洗30min，然後將膜放在兩張濾紙之間，在室溫下風干，用移液器將抗原抽提液滴在各方格中央，室溫下風干，用TBS-T緩沖液（含0.5%Tween的TBS液）洗膜5min，取出後放在濾紙上至膜表面水滴消失，然後浸入封閉液（含1%牛血清蛋白，和2%聚乙烯吡咯烷酮的TBS-T液），在37℃下保溫1h，取出晾乾後，浸在用封閉液稀釋的第一抗體溶液，在37℃下保溫1h，用TBS-T液洗膜10次，每5min換液一次。將膜浸入稀釋度1/200的酶聯球蛋白，室溫保溫1h，用上法洗膜後，用鹼性磷酸酯酶緩沖液沖洗兩次，每次10min，將膜浸入酶底物溶液內，室溫下避光5～15min，顯色完全後棄去底物液，用終止液（10mmol/LTris-HCl，pH7.5，5mmol/LEDTA）洗膜30min，置膜於濾紙內徹底風干後觀察結果。

此法可克服塑料板的不足，只用目測就可對結果定性，不需要復雜的儀器，所需抗原抗體量均很少，靈敏度比常規酶聯法高10倍以上，適合大量抗原的檢測。

6.免疫電鏡

電鏡檢測可快速確定病毒粒子的形狀，是鑒定病毒不可缺少的技術，但有的樣品濃度很低，用普通的電鏡技術不易觀察，如將病毒粒子包被後，抗體可把病毒粒子捕捉成聚集物便於觀察。同時還可從病毒粒子與抗體的結合情況，觀察兩者間的血清學關系。通常使用的有以下幾種方法：

（1）葉片浸沾血清技術。

把一滴稀釋的抗血清，滴在有膜的銅網上，將葉片的新鮮切口浸入血清滴中1～2s，置於室溫下5～10min，使血清與相應的病毒聚集並裝飾起來，再進行負染檢鏡。

（2）Derrick氏法。

把火棉膠膜銅網在24℃下，置於按1∶10比例稀釋於Tris緩沖液的抗血清內，然後將銅網用緩沖液沖洗後使用。把病毒的粗提液稀釋於含HCl的Tris緩沖液內，將已用血清包被的銅網浮於0.1ml的病毒稀釋液內1h（24℃），先用Tris-HCl液再用水沖洗，然後乾燥噴鍍。

（3）聚集法。

把抗血清用磷酸緩沖液稀釋到1/100的濃度，取10μl滴於載玻片，將切成2mm見方的病葉在血清滴中壓碎，在濕室中保濕15min，用鑷子持有膜銅網蘸取液滴，用20倍磷酸緩沖液沖洗後，再用蒸餾水洗，最後用5滴醋酸氧鈾染色觀察。

（4）修飾法。

取2mm見方的病葉在載玻片上的10μl蒸餾水中壓碎，持有膜銅網沾此液滴，將病毒粒子吸附於銅網上，然後將銅網用20滴的磷酸緩沖液沖洗，吸去水分後加1滴稀釋成1/100的抗血清，在濕室中保濕15min後，將銅網用20滴磷酸緩沖液和30滴蒸餾水沖洗，最後用醋酸氧鈾染色檢鏡。

（5）誘捕修飾法。

先將銅網用稀釋1/10或1/100的特異性抗血清包被，再把病毒樣品滴於銅網，保濕15min，用緩沖液及蒸餾水沖洗吸干，再加1滴稀釋成1/100的特異性抗血清，孵育15min後，用緩沖液和蒸餾水沖洗，吸干染色檢鏡。

（6）羊抗兔血清誘捕修飾法。

在誘捕修飾法未染色以前，再加1滴稀釋1/20的羊抗兔血清，孵育15min，洗滌後染色鏡檢。此法因病毒粒子外殼包被有兩層血清，明顯加粗，在2000倍的低倍電鏡下即可清晰地看到病毒粒子。

（7）A蛋白誘捕修飾法。

在福爾馬膜的銅網上滴1滴50mg/ml的A蛋白液，孵育後洗去多餘的A蛋白，再包被稀釋100倍的特異性抗血清，滴加抗原，再滴加特異性抗血清，最後染色鏡檢。此法比一般誘捕修飾法靈敏度高，能捕捉更多病毒粒子。

2. 病毒的血清學技術有什麼作用

這是檢測病毒的有效辦法。血清學診斷和鑒定病毒的方法很多，常見的有ELISA（酶聯免疫吸附法）、免疫電鏡、瓊脂雙擴散、免疫電泳等。其中，ELISA（酶聯免疫吸附法）為世界公認的植物病毒檢測方法。應用抗血清鑒定植物病毒的親緣關系，檢測花卉的種子、鱗球莖和苗木中傳帶的病毒，是植物病毒檢疫和檢測上常用的快速鑒定和檢驗技術，經常和生物學、電鏡技術等配合使用。

血清學反應的原理是人或高等動物對於侵入自身的有些異體物質產生免疫反應，即異體物質刺激淋巴組織產生相應的球蛋白稱為抗體，能刺激機體產生抗體的異物稱為抗原，抗原與其相對應抗體可以在機體內或機體外進行特異性反應，這種反應可以被用來預防疾病（人或動物）、鑒定和檢測病原物。

抗原的分子具有許多化學活性基團，稱為抗原決定簇，它們的一定結構決定了抗原的特異性。一般來說，抗原決定簇數目愈多，抗原性就愈強。植物病毒是核蛋白，外殼由許多亞基組成，抗原決定簇位於亞基上。植物病毒是良好的抗原，其蛋白外殼，尤其是外殼的表面起著抗原的作用；單鏈核酸雖不能作為抗原，但它與外殼蛋白同時存在時，能增強外殼在動物體內的免疫反應；一般來說，植物病毒比其寄主的正常植物蛋白有更強的抗原性。

抗體是動物機體受到抗原刺激後，由動物機體的免疫活性細胞產生的免疫球蛋白，通常以「Ig」來表示。在抗體中至少含有5種免疫球蛋白，即IgG，IgM，IgD和IgE，其中以IgG最主要，約佔70%～90%。IgG為易彎曲的Y形分子。由4條多肽鏈（2條重鏈和2條輕鏈）借4個2硫鏈連接組成。鏈的一端為氨基端，另一端為羧基端，酶可以降解IgG成為斷片。常用木瓜酶和胃酶。前者將IgG降解成Fab和Fc兩種片段；後者降解為F（ab）2和FC兩種片段。Fab片段有抗體活性，1個Fab與1個抗原分子結合；F（ab）2為雙體，可與2個抗原分子結合。抗體存在於免疫動物的血清或體液中。

植物病毒的抗血清，是將病毒的提純液作為抗原，一般以家兔，有時也以小鼠或母雞等為免疫動物，通過靜脈、肌肉或腹腔等途徑，逐漸增加劑量，多次注射抗原。待抗體產生後，采血，取出其血清即為該病毒的抗血清。免疫家兔產生的抗血清稱為兔抗體；免疫小鼠產生含特異抗體的腹水，採收的腹水，內含「腹水抗體」；免疫母雞，產生含抗體的雞蛋，從蛋黃中提取的抗體稱為「蛋黃抗體」。運用細胞融合技術，將小鼠骨髓瘤細胞和小鼠脾細胞雜交，產生雜交瘤細胞，其增殖能力很強，可在體外連續培養產生抗體。選擇其中能產生某單一抗體的細胞株，所產抗體稱「單克隆抗體」。單克隆抗體開創了在動物體外產生抗體的新時代。

這里介紹幾種常用的血清學檢測技術。

1 免疫雙擴散法

又稱奧氏瓊脂雙擴散法。瓊脂在水中加熱溶解，冷卻時成為凝膠平板，在上打數孔，分別放入抗原和抗體，它們各自向凝膠中擴散，於抗原和抗體比例最適的位置上形成沉澱反應。

具體步驟：按每1～2g（一般用1.2g）瓊脂粉，於100ml生理鹽水中，置沸水浴或家用高壓鍋中溶化，配成1%～2%瓊脂，加0.1%疊氮化鈉，防腐，用吸管或其他物品，將瓊脂均勻地鋪於潔凈的玻璃平板（可用載玻片或裁製成的大小一致的玻板）上，以熱的瓊脂液剛鋪滿為限，約1.5～2mm厚，靜止待凝固，製成的瓊脂板置保濕器皿中待用。檢測時，瓊脂板下放一「孔排列圖」，用打孔器按圖樣打孔。孔的排列方式很多，有梅花形，有7孔，即中間1孔，四周6孔；方陣形，有5孔，即中間1孔，四周4孔（圖1）。打出孔後，用針或吸器將孔中凝膠圓片取出，在孔中加適宜稀釋度的抗原或抗體，抗原孔中應包括已知陽性抗原、待測抗原和健株對照，可以用病健株的汁液或提純病毒液。加滿各孔，持平放於保濕器中數小時或放置至次日，在有黑背景的散射或斜射燈光上方觀察沉澱線。抗原和抗體的適宜濃度是影響反應結果的主要因素，因此必須注意：第一，孔徑和孔距（相鄰兩孔邊的最短距離）要適宜，兩者之比以2∶1為宜，即孔距等於孔的半徑，孔距過大，沉澱線便不能出現或變模糊，並且反應時間拉長，不能很快見到結果；第二，掌握反應物的最適濃度，為此，對所用抗體或抗原，分別作倍比稀釋，先測知兩者反應的最適濃度後，再進行正式反應。

圖1 打孔圖樣