蔗糖酶酶活力簡單監測方法

❶ 正交實驗法的正交實驗法舉例

用正交法測定幾種因素對蔗糖酶活力的影響
目的要求
1.初步掌握正交實驗設計方法的使用
2.求出蔗糖酶的最適溫度和最適pH值
實驗原理
酶的催化作用是在一定條件下進行的，它受多種因素的影響，如：底物濃度、酶濃度、溶液的pH值和離子濃度、溫度、抑制劑和激活劑等都能影響催化反應的速度。通常是在其他因素恆定的條件下，通過對某因素在一系列變化條件下的酶活性測定，求得該因素對酶活力的影響，這是單因素的簡單比較法。
本實驗用正交法測定溫度、pH值、底物濃度和酶濃度四種因素對蔗糖酶活性的影響，這是多因素（≥3）的實驗方法。
正交法是通過正交表安排多因素實驗，利用統計數學原理進行數據分析的一種科學方法，它符合「以盡量少的試驗，獲得足夠的、有效的信息」的實驗設計原則。正交試驗法的程序為下列八個步驟：
（1）確定試驗目的。實驗目的是多種多樣的，如找出產品質量指標的最佳組合、確定最佳工藝條件等。本實驗的目的是為了提高酶的反應速度，提高酶的活力。
（2）選擇質量特性指標。應選擇能提高或改進的質量特性及因素效應。對於本實驗來說就是產物（葡萄糖）生成量的多少。
（3）選定相關因素。即選擇和確定可能對實驗結果或質量特性值有影響的那些因素，可人為控制與調節的因素，如溫度、pH等。這些因素之間有相互獨立性。
（4）確定水平。水平，又稱位級，是因素的一個給定值或一種特定的措施，或一種特定的狀態。水平也就是因素變化的各種狀態。在確定水平時，應考慮選擇范圍、水平數和水平位置。如本實驗的溫度水平可以選擇20℃、30 ℃、50 ℃三個水平。
（5）選用正交表。應從因素數、水平數以及有無重點因素需要強化考察等各方面綜合考慮選用正交表。一般情況下，首先根據水平數選用2或3系列表，然後，以容納試驗因素數，選用實驗次數最少的正交表。如有重點考察的因素，則根據其多考察的水平數，選混合型正交表。
（6）配列因素水平，制定實驗方案。按隨機原則，把因素配列於選用的正交表中，制定實驗的順序、時間等，即制定實驗具體方案。
（7）實施實驗方案。按實驗方案，認真、正確地試驗，如實記錄各種實驗數據。
（8）實驗結果分析。對實驗中取得的各種數據進行分析。如從數據中直接選出符合或接近質量特性期望值的實驗條件組。如不能採用直觀分析方法，則應採用其他分析方法，確定各因素主次地位可用極差分析方法，定量分析各個因素對實驗結果的影響程度，則用方差分析方法。
操作方法
1.實驗設計：
1）確定指標：即實驗的結果。本實驗的指標是酶活力。這里，用A520值表示。
2）制定因素水平表：考察四個因素（溫度、pH值、底物濃度和酶濃度），每個因素取三個水平（如溫度選擇20℃、35 ℃ 和50 ℃ 三個水平）。水平是因素變化的范圍（通常是根據專業知識確定。如無資料可借鑒，應先加寬范圍再逐步縮小）內要進行實驗的具體條件，如表1。
表1 因素水平表
3）選擇正交表：可容納三因素三水平的正交表有L9（34）、L27（313）、L18（36×6）和L27（38×9）。本實驗不考察各因素間的交互作用，也沒設計混合水平，只有水平數均為3的的四個因素，故選用L9（34）表，見表2。
分析：
A. 判斷各因素的水平范圍是否選偏；
B. 判斷各因素顯著性大小的順序；
C. 判斷實驗結果的置信度。
實驗安排
具體操作步驟：
1、將已配製好的三種不同pH的0.2mol/L的緩沖液於試管中。
2、將酶粉用蒸餾水溶解（適當體積10-30ml不等），離心去
除不溶物，10,000rpm/min,10min,4℃。
3、酶活預示實驗，確定酶的稀釋倍數。（可根據產物稀釋的
倍數來確定酶的稀釋倍數）A520在0.4-2.0之間即可。
4、准備10支試管。其中一支為「0」號管，作為測量時的參比溶液。其他九支試管根據前面的圖表3加入相關的溶液，分別在不同的條件下進行酶反應。利用二硝基水楊酸的方法測定不同管在A520下的光密度值。
5、計算同一因素不同水平的級差，級差小代表離散度小，表示該水平為酶反應的最適條件。
1）數據記錄：將上述兩組平行實驗的結果取平均值後的9個數據，填入表4中的Yi項內。
2）數據整理及分析：對於一般的實驗，可用極差分析，該分析方法簡單、直觀。對要求精細的實驗，則要用方差分析，該方法可給出誤差的大小估計，但有一定的計算量。對於有混合水平的正交實驗，只能用方差分析。
本實驗，只使用極差分析：
A. 計算出各水平實驗結果總和，即第1、2、3、4列上的k1、k2、k3，並求出k1、k2、k3和k的R值（極差）。
B. 選出優水平組合：據R值的大小，排出因素顯著性的順序，並比較k值選出優水平組合（即好的實驗條件）。
由上述數據分析及驗證實驗，討論在本實驗條件下，溫度、pH值、底物濃度和酶濃度對蔗糖酶活性的影響；求出蔗糖酶的最適溫度和最適pH值。

❷ 菠蘿蛋白酶提取，純化與活性鑒定過程中所用緩沖液ph值不同，為什麼

菠蘿蛋白酶提取，純化與活性鑒定過程中所用緩沖液ph值不同
蔗糖酶的提取及初提純試驗中影響酶得率得因素有酶的濃度、底物濃度、pH值、溫度、抑制劑、激活劑等。

實驗原理：
蔗糖酶分離提純原理： 酵母中的蔗糖酶含量很豐富，實驗以安琪酵母粉為原料，首先採用自溶法破碎細胞壁、再用乙醇分級和DEAE—纖維素柱層析兩步分離提純，制備純度較高的蔗糖酶制劑。酶分離提純的原理與蛋白質的相同。但酶是有催化活性的蛋白質，在分離提純過程中必須注意：防止酶變性失活；隨時測定酶的比活力，並跟蹤酶的去向、衡量酶提純的程度及得率。
有機溶劑分級純化蔗糖酶原理： 利用不同蛋白質在不同濃度的有機溶劑—乙醇中溶解度的差異將蔗糖酶蛋白與其它蛋白質雜質進行有機溶劑分級沉澱，而使提取的蔗糖酶得以純化（32％的乙醇飽和度沉澱分離雜蛋白，47.5％的乙醇飽和度沉澱分離酶蛋白）。操作必須在低溫下進行且避免有機溶劑局部過濃；分離後應立刻除去有機溶劑並用水或緩沖溶液溶解沉澱的酶蛋白（復溶），確保酶的活性；pH多選在酶蛋白的等電點附近；有機溶劑在中性鹽存在時能增加蛋白質的溶解度減少變性，提高分離效果。
蔗糖酶的離子交換層析法純化原理： 本實驗採用DEAE-纖維素（DEAE-C11）微粒狀的、弱鹼性的陰離子纖維素為柱料，進行蔗糖酶的進一步純化。它具有解析度高、化學性質穩定、有開放性的長鏈結構、有較大的表面積、對蛋白質的吸附容量大等優點；纖維素上離子基團的數量不多，排列疏散，對蛋白質的吸附不是太牢固，用緩和的洗脫條件即可達到分離的目的，不致引起蛋白質的變性。
蔗糖酶活力與比活的測定：在蔗糖酶的純化過程中，通過3、5-二硝基水楊酸法測定蔗糖酶催化蔗糖生成還原糖的量，測定酶活力大小，跟蹤酶的活力。在本實驗條件下，每3min釋放lmg還原糖所需的酶量定義為一個活力單位；通過Folin法測定酶蛋白的含量，計算蔗糖酶的比活。單位質量的酶蛋白中所含酶的活力稱為酶的比活。
主要實驗器材：
1. 試管、血糖管； 2. 秒錶； 3. 冰鹽浴； 4. 恆溫水浴； 5.離心機；6. 721- 型分光光度計；7. 柱層析裝置； 8. 梯度洗脫裝置；9. 部分收集器；10. 電磁攪拌器；11. 冰箱；12. DEAE—纖維素。