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❷ 在本實驗中使用了有機溶劑純化多糖，有其他替代的試劑或方法嗎
多糖（polysacharides，PS），又稱多聚糖，是由10個以上的單糖通過苷鍵連接而成的，具有廣泛生物活性的天然大分子化合物。它廣泛分布於自然界高等植物、藻類、微生物（細菌和真菌）與動物體內。20世紀60年代以來，人們逐漸發現多糖具有復雜的、多方面的生物活性和功能[1]：(1)多糖可作為廣譜免疫促進劑，具有免疫調節功能，能治療風濕病、慢性病毒性肝炎、癌症等免疫系統疾病，甚至能抗AIDS病毒[2]。如甘草多糖具有明顯的抗病毒和抗腫瘤作用[10]，黑木耳多糖、銀杏外種皮多糖和蘆薈多糖可抗腫瘤和增強人體免疫功能[3-5]。(2)多糖具有抗感染、抗放射、抗凝血、降血糖、降血脂、促進核酸與蛋白質的生物合成作用。如柴胡多糖具有抗輻射，增強免疫功能等生物學作用[6]，麥冬多糖具有降血糖及免疫增強作用[7-8]，動物黏多糖具有抗凝血、降血脂等功能[9]。(3)多糖能控制細胞分裂和分化，調節細胞的生長與衰老。如爬山虎多糖具有抗病毒和抗衰老作用[10]，銀杏外種皮粗多糖具有抗衰老、抗過敏、降血脂、止咳祛痰、減肥等功能[11]。
另外，多糖作為葯物，其毒性極小，因而多糖的研究已引起人們極大的興趣。
由於多糖具有的生物活性與其結構緊密相關，而多糖的結構又是相當復雜的，所以在這一領域的研究相對緩慢。但人們在多糖的分離提取與純化方面已做出了不少工作。
1. 多糖的提取[12]
1.1 熱水浸提法：
1.1.1多糖提取條件的優選
根據文獻報道[13]：影響熱水浸提多糖的因素主要有提取時間、提取次數、溶劑體積、浸提溫度、pH值、醇析濃度和植物顆粒大小等。在試驗前對上述多種因素利用正交實驗法做出優選，才能選出最佳提取方案。
1.1.2其步驟為：原料→粉碎→脫脂→粗提（2－3次）→吸濾或離心→沉澱→洗滌→乾燥
首先除去表面脂肪。原料經粉碎後加入甲醇、乙醚、乙醇、丙酮或1：1的乙醇乙醚混合液，水浴加熱攪拌或迴流1－3小時，脫脂後過濾得到的殘渣一般用水作溶劑（也有用氫氧化鉀鹼性水液、氯化鈉水液、1％醋酸和1％苯酚或0.1－1M氫氧化鈉作為提取溶劑）提取多糖。溫度控制在90－100℃，攪拌4－6小時，反復提取2－3次。得到的多糖提取液大多較粘稠，可進行吸濾。也可用離心法將不溶性雜質除去，將濾液或上清液混合（得到的多糖若為鹼性則需要中和）。然後濃縮，再加入2－5倍低級醇（甲醇或乙醇）沉澱多糖；也可加入費林氏溶液或硫酸銨或溴化十六烷基三甲基銨等，與多糖物質結合生成不溶性絡合物或鹽類沉澱。然後依次用乙醇、丙酮和乙醚洗滌。將洗干後疏鬆的多糖迅速轉入裝有五氧化二磷和氫氧化鈉的真空乾燥器中減壓乾燥（若沉澱的多糖為膠狀或具粘著性時，可直接冷凍乾燥）。乾燥後可得粉末狀的粗多糖。
1.2 微波輔助提取法：
其原理為利用不同極性的介質對微波能的不同吸收程度，使基體物質中的某些區域和萃取體系中的某些組分被選擇性加熱，從而使萃取物質從基體或體系中分離出來，進入到介電常數小，微波吸收能力較差的萃取劑中[14]。
由於微波能極大加速細胞壁的破裂，因而應用於中草葯中有效成分的提取能極大加快提取速度，增加提取產率。而且由於其選擇性好，提取後基體能保持良好的性狀，提取液也較一般的提取方法澄清[15]。
聶金源等在柴胡多糖和黃酮化合物的提取[18]中對微波輔助提取法、超聲輔助法和索氏提取法進行比較，發現微波輔助提取法所需時間最短（10min），多糖的提取率最高（28.46％）。
1.3 超聲輔助法：
其原理是利用超聲波的空化作用加速植物有效成分的浸出提取，另外超聲波的次級效應，如機械振動、乳化、擴散、擊碎、化學效應等也能加速欲提取成分的擴散釋放並充分與溶劑混合，利於提取[16]。
超聲波輔助法與常規提取法相比，具有提取時間短、產率高、無需加熱等優點[17]。
1.4 索氏提取法：
將植物粉末置於索氏提取器中，加入石油醚，60℃-90℃條件下提取至無色（一般為6小時）。過濾，濾渣揮發乾燥完溶媒後加入80%乙醇，再提取6小時，過濾，濾渣乙醇揮發乾燥後加蒸餾水。迴流提取2次，趁熱過濾，濾液減壓濃縮，再除蛋白，醇沉，除色素。60℃乾燥，稱重。
1.5 醇提法：
先後將90%和50%乙醇加入植物粉末中，振盪充分再抽濾。濾液中加入足量無水乙醇，至於4℃冰箱中過夜。減壓抽濾，再除去色素，得多糖粗品，在60℃通風乾燥箱中乾燥，再置乾燥皿中恆重保存。
醇提法方法簡單，易於操作，但提取率較低，乙醇使用量大，不宜大規模提取使用。
1.6 其它方法：
多糖的提取方法還有稀鹼液浸提法、稀酸液浸提法、酶法等。但由於稀酸、稀鹼條件下，易使多糖發生糖苷鍵的斷裂，部分多糖發生水解而使多糖的提取率減少，因而很多試驗中避免採用稀鹼液浸提法和稀酸液浸提法。
2. 多糖的純化
2.1 多糖中雜質除去方法 粗多糖中往往混雜著蛋白質、色素、低聚糖等雜質，必須分別除去。
2.1.1 除蛋白質
採用醇沉或其它溶劑沉澱所獲得的多糖，常混有較多的蛋白質，脫去蛋白質的方法有多種：如選擇能使蛋白質沉澱而不使多糖沉澱的酚、三氯甲烷、鞣質等試劑來處理，但用酸性試劑宜短，溫度宜低，以免多糖降解。常用的方法有[19]：
2.1.1.1 沙維積法（Sevag法）[20]：根據蛋白質在氯仿等有機溶劑變性而不溶與水的特點，將多糖水溶液、氯仿、戊醇（或正丁醇）之比調為25:5:1或25:4:1，混合物劇烈振搖20到30分鍾，蛋白質與氯仿－戊醇（或正丁醇）生成凝膠物而分離，然後離心，分去水層和溶劑層交界處的變性蛋白質。此種方法較溫和，在避免降解上有較好效果，但效率不高，如五味子多糖的提取實驗中要重復處理達三十幾次。並且每次除去蛋白質變性膠狀物時，不可避免的溶有少量多糖，另外少量多糖與蛋白質結合的蛋白聚糖和糖蛋白，在處理時會沉澱下來，造成多糖的損失。如能配合加入一些蛋白質水解酶，再用Sevage法效果更佳。
2.1.1.2 三氟三氯乙烷法[21]：多糖溶液與三氟三氯乙烷等體積混合，低溫下攪拌10min左右，離心得上面水層，水層繼續用上述方法處理幾次，即得無蛋白質的多糖溶液，此法效率高，但溶劑沸點較低，易揮發，不宜大量應用。
2.1.1.3 三氯醋酸法：在多糖水溶液中滴加5％－30％三氯醋酸，直至溶液不再繼續混濁為止，在5－10℃放置過夜，離心除去沉澱即得無蛋白質的多糖溶液。此法會引起某些多糖的降解。
Sevag法、三氟三氯乙烷法和三氯醋酸法三種方法均不適合糖肽，因糖肽也會像蛋白質那樣沉澱出來。對於對鹼穩定的糖蛋白，在硼氫化鉀存在下，用稀鹼溫和處理，可以把這種結合蛋白質分開[1]。
2.1.1.4 酶解法[22]：在樣品溶液中加入蛋白質水解酶，如胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、鏈霉蛋白酶等，使樣品中的蛋白質降解。通常將其與Sevag法綜合使用除蛋白質效果較好。
2.1.1.5 鹽酸法[23]：取樣品濃縮液，用2mol/L鹽酸調節其PH至3，放置過夜，在3000r/min條件下離心，棄去沉澱，即脫去蛋白質。
另有李知敏[23]和葉將瑜[25]等人分別在植物多糖實驗中證明：鹽酸法、三氯乙酸法及Sevag法脫蛋白率分別為72.5％、46.1％和42.3％，多糖的損失率分別為15.1%、6.1％和14.3％。鹽酸法脫蛋白率高，但多糖的損失率也較高;三氯乙酸法較溫和，但除蛋白效率不高；Sevag法的脫蛋白效果不及前兩種。
2.1.1.6 其它方法：可以加入5%ZnSO4溶液和飽和Ba（OH）2溶液，振盪後離心去蛋白。此法除蛋白不夠徹底，可結合Sevag法使用。還可在提取液中加入50%的TCA溶液至沉澱完全，在4000r/min的條件下離心10min，收集上清液，即為除蛋白液。還有人使用4:1的氯仿-乙醇溶液除蛋白，將混合液清搖，再靜置，取上清液。此過程需重復多次方可除盡蛋白。
除去蛋白質的樣品用紫外分光光度計檢驗，觀察在280mm處是否有吸收，如果無吸收則表明蛋白質已經除盡[24]。
2.1.2 除色素
2.1.2.1活性炭（activated carbon）除色素[12]：活性炭屬於非極性吸附劑，有著較強的吸附能力，特別適合於水溶性物質的分離。它的來源充足，價格便宜，上柱量大，適用於大量制備性分離。目前用於色譜分離的活性炭主要分為粉末狀活性炭、顆粒狀活性炭、錦綸活性炭三種。一般情況下，盡量避免用活性炭處理，因為活性炭會吸附多糖，造成多糖的損失。
2.1.2.2對於植物來源的多糖，可能含有酚型化合物而顏色較深，這類色素大多呈負性離子，不能用活性炭吸收劑脫色，可用弱鹼性樹脂DEAE纖維素或DuoliteA－7來吸附色素。
2.1.2.3若糖和色素時結合的，易被DEAE纖維素吸附，不能被水洗脫，這類色素可進行氧化脫色：以濃氨水或NaOH液調至PH8.0左右，50℃以下滴加H2O2至淺黃色，保溫2小時。
2.1.2.4 依次用丙酮、無水乙醚和無水乙醇洗滌多糖，即可得到較為純凈的多糖。此法較為簡單，便於操作，多糖損失也較小。
2.1.2.5 用4:1的氯仿-正丁醇除色素。操作簡單，多糖有一定損失。
2.1.2.6發酵來源的多糖顏色一般較淺，色素含量較少，一般可不除色素。
2.1.2.7對於動物，微生物等提取得到的多糖也可根據不同情況按上述方法處理。
2.1.3 除低聚糖等小分子雜質
2.1.3.1採用逆向流水透析法。即准備好一桶蒸餾水，用一根導管將水通入透析袋的燒杯底部，另用一根導管將水引出，根據水量控制流速，使水緩慢流動48小時。這樣得到的就是多糖的半精品。
2.1.3.2利用溶液濃度擴散效應，將分子量小的物質如無機鹽、低聚糖等從透析袋滲透到袋外的蒸餾水中，不斷換水即可保持濃度差，從而除盡小分子雜質。具體的做法是根據多糖溶液的體積截取相應長度的透析袋，用透析夾夾住一端，灌入多糖液，離液面2－3cm處夾緊透析袋，置於一大燒杯中，注入蒸餾水至完全浸沒透析袋後，用磁力攪拌器慢速攪拌，每12小時換一次水，重復3－4次。
2.2 多糖的純化方法 純化是將多糖混合物分離為單一多糖的過程，純化的方法主要有以下幾種：
2.2.1 分部沉澱法 根據各種多糖在不同濃度的低級醇或丙酮中具有不同溶解度的性質，逐次按比例由小到大加入甲醇或乙醇或丙酮，收集不同濃度下析出的沉澱，經反復溶解與沉澱後，直到測得的物理常數恆定（最常用的是比旋光度測定或電泳檢查）。這種方法適合於分離各種溶解度相差較大的多糖。為了多糖的穩定，常在pH7進行，唯酸性多糖在pH7時－COOH是以－COO` 離子形式存在的，需在pH2－4進行分離，為了防止苷鍵水解，操作宜迅速。此外也可將多糖製成各種衍生物如甲醚化物、乙醯化物等，然後將多糖衍生物溶於醇中，最後加入乙醚等極性更小的溶劑進行分級沉澱分離。
2.2.2 鹽析法 在天然產物的水提液中，加入無機鹽，使其達到一定濃度或飽和，促使有效成分在水中溶解度降低沉澱析出，與其它水溶性較大的雜質分離。常做鹽析的無機鹽的有氯化鈉、硫酸鈉、硫酸鎂、硫酸銨等。
2.2.3 季銨鹽沉澱法 季銨鹽及其氫氧化物是一類乳化劑，可與酸性糖形成不溶性沉澱，常用於酸性多糖的分離。通常季胺鹽及其氫氧化物並不與中性多糖產生沉澱，但當溶液的PH增高或加入硼砂緩沖液使糖的酸度增高時，也會與中性多糖形成沉澱。常用的季銨鹽有十六烷基三甲胺的溴化物（CTAB）及其氫氧化物（cetyl trimethyl ammonium hydroxide，CTA－OH）和十六烷基吡啶（cetylpyridinm hydroride，CP－OH）。CTAB或CP－OH的濃度一般為1％－10％（W/V）的多糖溶液中，酸性多糖可從中性多糖中沉澱出來，所以控制季銨鹽的濃度也能分離各種不同的酸性多糖。值得注意的是酸性多糖混合物溶液的PH要小於9，而且不能有硼砂存在，否則中性多糖將會被沉澱出來。
2.2.4 柱層析：包括纖維素柱層析、纖維素陰離子交換柱層析、凝膠柱層析、親和層析、高壓液相層析和其它柱層析。如用活性炭及硅膠做載體的柱層來分離多糖；或用硼砂型的離子交換樹脂分離中性多糖。
纖維素柱層析 纖維素柱層析對多糖的分離既有吸附色譜的性質，又具有分配色譜的性質，所用的洗脫劑是水和不同濃度乙醇的水溶液，流出柱的先後順序通常是水溶性大的先出柱，水溶性差的最後出柱，與分級沉澱法正好相反。
纖維素陰離子交換柱層析 最常見的交換劑為DEAE－纖維素（硼酸型或鹼型），洗脫劑可用不同濃度的鹼溶液、硼砂溶液、鹽溶液等。此方法目前最為常用。它一方面可純化多糖，另一方面還適於分離各種酸性多糖、中性多糖和粘多糖。
凝膠柱層析 凝膠柱層析可將多糖按分子大小和形狀不同分離開來，常用的凝膠有葡聚糖凝膠（sephadex G）、瓊脂糖凝膠（sepharose bio－gel A）、聚丙烯醯胺凝膠（bio－gel P）等，常用的洗脫劑是各種濃度的鹽溶液及緩沖液，但它們的離子強度最好不低於0.02。出柱的順序是大分子的先出柱，小分子的後出柱。由於糖分子與凝膠間的相互作用，洗脫液的體積與蛋白質的分離有很大的差別。在多糖分離時，通常是用孔隙小的凝膠如sephadex G－25、G－50等先脫去多糖中的無機鹽及小分子化合物，然後再用孔隙大的凝膠sephadex G－200等進行分離。凝膠柱層析法不適合於粘多糖的分離。
親和層析 用凝聚素（一般是蛋白質和糖蛋白）做親和色譜來分離多糖。
高壓液相層析
2.2.5 制備性區域電泳 分子大小、形狀及所負電荷不同的多糖其在電場的作用下遷移速率是不同的，故可用電泳的方法將不同的多糖分開，電泳常用的載體是玻璃粉。具體操作是用水將玻璃粉拌成膠狀、柱狀，用電泳緩沖液（如0.05mol/L硼砂水溶液，PH9.3）平衡3天，將多糖加於柱上端，接通電源，上端為正極（多糖的電泳方向是向負極的），下端為負極，其單位厘米的電壓為1.2－2V，電流30－35MA，電泳時間為5－12小時。電泳完畢後將玻璃粉載體推出柱外，分割後分別洗脫、檢測。該方法分離效果較好，但只適合於實驗室小規模使用，且電泳柱中必須有冷卻夾層。
2.2.6 金屬絡合物法 常用的絡合劑有費林溶液、氯化銅、氫氧化鋇和醋酸鉛等。
2.2.7 其它方法：純化除採用上述方法外，還有超過濾法（多糖溶液通過各種已知的超過濾膜就能達到分離）、活性炭柱色譜。另據報道，國外多採用的LKB柱色譜系統，用比旋度、示差折射及紫外檢測多糖，各組分的峰位自動記錄，分離效果好且方便。
2.3 多糖純度的鑒定
2.3.1超離心法 由於微粒在離心力場中移動的速度與微粒的密度、大小和形狀有關，故當將多糖溶液進行密度梯度超離心時，如果是組分均一的多糖，則應呈現單峰。具體的做法是將多糖樣品用0.1molNaCl或0.1molTris鹽緩沖溶液配製成1％－5％的溶液，然後進行密度超離心，待轉速達到恆定後（通常是60000r/min），採用間隔照明的方法檢測其是否為單峰。
2.3.2高壓電泳法 由於中性多糖導電性差、分子量大、在電場中的移動速度慢，故常將其製成硼酸絡合物進行高壓電泳。多糖的組成不同、分子量不同，其與硼酸形成的絡合物就不同，在電場作用下的相對遷移率也會不同，故可用高壓電泳的方法測定多糖的純度。通常高壓電泳所用的支持體是玻璃纖維紙、純絲綢布、聚丙醯銨凝膠、纖維素醋酸酯薄膜等。緩沖液是PH9.3－12的0.03－0.1mol的硼砂溶液，電壓強度約為30－50V/cm，時間是30－120min。由於電泳時會產生大量的熱，所以要有冷卻系統，將溫度維持在0℃左右，否則會燒掉支持體。一般單糖、低聚糖因醛基而發生的顏色反應在多糖上不明顯，電泳後常用的顯色劑是p－茴香胺硫酸溶液（p－anisidine）和過碘酸希夫試劑等。
2.3.3凝膠柱層析 常用的凝膠是Sephadex、Sepharose、Sephacryl，展開劑為0.02－0.2molNaCl溶液或0.04mol吡啶與0.02醋酸1：1的緩沖溶液，柱高和柱直徑之比大於40。
2.3.4旋光測定法 在多糖水溶液中加入乙醇使其濃度為10％左右，離心得沉澱。上清液再加入乙醇使其濃度為20％－25％，離心所得二次沉澱，比較二次沉澱的比旋度。如果比旋度相同則為純品，否則為混合物。
2.3.5其它方法：官能團摩爾比恆定法，即如為純品兩次分離所得產物的官能團如－COOH、－NH2、－SO3H、－CHO等摩爾比應該恆定。類似的方法還有示查折射法、HPLC法等。此外德國常用高壓液相法來檢測多糖純度，結果可靠。
必須注意的是：純度檢查一般要求有上述兩種方法以上的結果才能肯定。
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