基因組檢測方法

1. 易基因｜全基因組DNA甲基化測序分析全流程

全基因組DNA甲基化實驗怎麼做？從技術原理、建庫測序流程、信息分析流程和研究套路等四方面詳細介紹。

表觀修飾不需要改變 DNA 序列便能實現對性狀的改變，表觀修飾的改變與基因功能乃至細胞狀態段爛陸、發育、衰老、疾病等存在重要的關聯。在眾多的表觀遺傳修飾中，最為重要且研究最為廣泛的修飾之一是 DNA 甲基化，而全基因組甲基化測序（WGBS-seq）無疑是最有效的研究手段。

全基因組甲基化測序利用重亞硫酸鹽能夠將未甲基化的胞嘧啶（C）轉化為胸腺嘧啶 （T）的特性，將基因組用重亞硫酸鹽處理後測序，即可根據單個 C 位點上未轉化為 C 未轉化為 T 的 reads 數目與所有覆蓋的 reads 數目的比例，計算得到甲基化率。該技術對於全面研究胚胎發育、衰老機制、疾病發生發展的表觀遺傳機制，以及篩選疾病相關的表觀遺傳學標記位點具有重要的應用價值。

全基因組甲基化測序原理示意圖入下：

樣品檢測——樣品打斷 ——文庫構建——BS處理——文庫質檢

（一）樣品檢測

對DNA樣品的檢測主要包括2種方法：

（1）瓊脂糖凝膠電泳分析DNA降解程度以及是否有污染，檢測具有明顯的主帶，且條帶清晰；

Qubit 2.0對DNA濃度進行精確定量，DNA檢測總量不低於1ug。

（二）文庫構建

樣本檢測合格後，使用Bioruptor系統將1µg樣品基因組DNA與未甲基化的lambda DNA混合，然後將其片段化，平均大小約為250bp。片段化後，純化的隨機片段化DNA隨後用T4 DNA聚合酶，Klenow片段和T4多核苷酸激酶的混合物進行修復，鈍化和磷酸化末端。隨後使用Klenow片段（3'-5'exo-）對鈍的DNA片段進行3'腺苷酸化，然後與連接5'-甲基胞嘧啶而不是使用T4 DNA連接酶的胞嘧啶連接的銜接子進行連接。完成每個步驟後，使用磁珠純化DNA。之後，根據說明使用ZYMO EZ DNA甲基化金試劑盒將未甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶。最後，用JumpStart Taq DNA聚合酶進行PCR擴增，再使用磁珠對PCR產物進行純化獲得最終文庫。

（三）文庫質檢

文庫構建完成後，先使用Qubit2.0進行初步定量，稀釋文庫至1ng/ul，隨後使用Agilent 2100對文庫的insert size進行檢測，insert size符合預期後，使用qPCR方握頃法對文庫的有效濃度進行准確定量（文庫有效濃度> 2nM），以保證文庫質量。

（四）上機測序

文庫檢測合格後，把不同文庫按照有效濃度及目標下機數據量的需求pooling後在illumina Nova平台測序，測序策略為PE150。

（一）原始下機數據質控

原始下機數據為FASTQ格式，是高通量測序的標准格式。FASTQ文件每四行為一個單位，包含一條測序序列（read）的信息。該單位第一行為read的歷逗ID，一般以@符號開頭；第二行為測序的序列，也就是reads的序列；第三行一般是一個+號，或者與第一行的信息相同；第四行是鹼基質量值，是對第二行序列的鹼基的准確性的描述，一個鹼基會對應一個鹼基質量值，所以這一行和第二行的長度相同。以下為一條read信息的示例：

原始下機數據包含建庫時引進的接頭序列以及質量過低的鹼基，這些因素會導致後續比對到基因組的reads較少，從而導致得到的信息較少，因此需要進行過濾。利用trim_galore軟體對原始數據進行去除接頭序列及低質量鹼基等質控步驟。

（二）序列比對

經過質控的reads需要根據與參考基因組的序列相似度比對到參考基因組上。相比於常規基因組及轉錄組測序，WGBS測序方法產生的數據的特點決定其在比對時存在三大困難：

（1）DNA片段正鏈和負鏈經過重亞硫酸鹽轉化後將不再反向互補，再經過PCR，便會產生四條不同的序列，這將大大增加比對時的計算量。

（2）經過重亞硫酸鹽轉化後，DNA序列大部分C鹼基被轉化成T鹼基，因此序列含大量T而缺乏C；經過PCR後，產生的互補鏈則含有大量A而缺乏G。這樣便導致序列的復雜度降低（即序列的組成特徵更單一），從而增加比對的難度。

（3）C和T的比對是不對稱的。經過重亞硫酸鹽轉化後，序列中非甲基化的C鹼基（佔大部分）被轉化為T，這將導致測序序列與參考基因組不匹配，T既可能應該比對到T上，有可能應該比對到C上；而C則只能比對到C上。這也增加了比對的難度。

利用BSMAP軟體進行比對。BSMAP進行比對時，先以參考基因組上C鹼基的位置作為指導，將reads中對應參考基因組C鹼基位置的T標記為C，其他T保持不變，從而使reads可以直接比對到參考基因組。

（三）甲基化水平計算

甲基化水平可根據未轉化為 T 的 C 與轉化為 T 的 C 的 reads 的比例計算得到，即：

Beta-value = C-reads / (C-reads + T-reads) * 100%

其中，Beta-value 即為該胞嘧啶的甲基化水平，C-reads 為覆蓋該位點的支持甲基化的reads 數目（測得該位點為 C 的 reads），T-reads 為覆蓋該位點的不支持甲基化的 reads 數目（測得該位點為 T 的 reads）。 計算原理示意圖如下：

利用BSMAP統計甲基化水平。

（四）差異甲基化區域（DMR）鑒定及統計

DMR檢測使用權威期刊發表的metilene軟體。該軟體先將基因組進行預分段，以排除較長序列中不包含CG位點的片段。隨後，利用二元分隔演算法，遞歸縮小檢測范圍，以搜索得到組間累積平均甲基化差異最大的區域，作為可能的DMR；最後，結合雙重統計學檢驗（MWU-test和2D KS-test），得到准確的DMR。檢測原理如下圖所示：

本分析檢測DMR的標准如下：

（1）區域平均甲基化差異不小於0.1；

（2）CpG位點數不少於5個；

（3）區域長度不小於50 bp；

（4）甲基化水平差異統計檢驗的校正P值小於0.05；

（5）2D KS-test檢驗P值小於0.05。

（五）信息分析流程示意圖

DNA甲基化組學研究的核心內容在於對DNA甲基化數據的挖掘。DNA甲基化一般遵循三個步驟進行數據挖掘。

首先，進行整體全基因組甲基化變化的分析，包括平均甲基化水平變化、甲基化水平分布變化、降維分析、聚類分析、相關性分析等。

其次，進行甲基化差異水平分析，篩選具體差異基因，包括DMC/DMR/DMG鑒定、DMC/DMR在基因組元件上的分布、DMC/DMR的TF結合分析、時序甲基化數據的分析策略、DMG的功能分析等。

最後，將甲基化組學&轉錄組學關聯分析，包括Meta genes整體關聯、DMG-DEG對應關聯、網路關聯等。

Whole-Genome Bisulfite Sequencing of Two Distinct Interconvertible DNA Methylomes of Mouse Embryonic Stem Cells. 兩種狀態的小鼠胚胎幹細胞的甲基化組學研究

1、背景

小鼠胚胎幹細胞一般生長在含有血清的基質中，被稱作血清幹細胞(serum ESCs)；加兩種激酶抑制因子使胚胎幹細胞在無血清的情況下更能保持多能性的基態，這種幹細胞稱為2i幹細胞(2i ESCs)；這兩種狀態的胚胎幹細胞可以互相轉化。以前這方面的甲基化研究大多基於質譜，覆蓋度和研究結果有限，尚缺乏2i胚胎幹細胞的甲基化組學研究。

2、方法

利用全基因組重亞硫酸鹽甲基化測序（WGBS），對這兩種可互相轉換的小鼠胚胎幹細胞進行甲基化組學研究

3、結論

全面准確的檢測了兩種小鼠胚胎幹細胞的DNA甲基化修飾並進行了系統的比較；同serum ESCs相比，雄性2iESCs全局低甲基化；在血清中，雌性ESCs跟雄性2i ESCs類似呈現全局低甲基化，而在2i ESCs狀態下，甲基化水平會進一步降低。

以上就是關於全基因組甲基化測序實驗流程和分析思路的介紹。

參考文獻：

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[8] Gao F, et al. De novo DNA methylation ring monkey pre-implantation embryogenesis. Cell Res. 2017 Apr;27(4):526-539. pii: cr201725.

2. 基因多態性的主要檢測方法有哪些

1．限制性片段長度多態性（Restriction
Fragment
Length
Polymorphism，RFLP）：由DNA
的多態性，致使DNA
分子的限制酶切位點及數目發生改變，用限制酶切割基因組時，所產生的片段數目和每個片段的長度就不同，即所謂的限制性片段長度多態性，導致限製片段長度發生改變的酶切位點，又稱為多態性位點。最早是用Southern
Blot/RFLP方法檢測，後來採用聚合酶鏈反應（PCR）與限制酶酶切相結合的方法。現在多採用PCR-RFLP法進行研究基因的限制性片段長度多態性。
2．單鏈構象多態性（SSCP）：是一種基於單鏈DNA構象差別的點突變檢測方法。相同長度的單鏈DNA如果順序不同，甚至單個鹼基不同，就會形成不同的構象。在電泳時泳動的速度不同。將PCR產物經變性後，進行單鏈DNA凝膠電泳時，靶DNA中若發生單個鹼基替換等改變時，就會出現泳動變位（mobility
shift），多用於鑒定是否存在突變及診斷未知突變。
生物幫上面有這方面的資料，
http://www.bio1000.com/zt/proct/millipore.html

millipore,默克密理博,,millipore公司,反滲透純水系統,millipore純水系統

3. 人類的全部基因組是如何測試出來的

我們身體每一個細胞中都有一組長達32億組鹼基對的遺傳指令。

要解讀這些指令是一項無比艱巨的任務，但對我們了解自身有著深遠的意義。

人類基因組計劃這種及時分享數據的做法並不常見。科學家們更傾向於在他們可以分析並且發布結果的時候再公布研究數據。

然而，人類基因組計劃的這種做法 加速了研究過程，並且促成了研究領域一項 空前的國際合作。自此，在公共和私人領域的 研究得到深入開發，使很多與基因相關的疾病 得以被檢測出來，同時測序方法也被不斷完善。

如今，一個人的全部基因測序 只需要幾天就能完成。

但是，能夠解讀基因只是第一步而已。要了解大多數基因的功能以及它們是如何被控制的，我們還有很漫長的路要走。

這些工作將要交給我們下一代充滿進取心的研究者來完成了。

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4. 基因檢測方法

一般有三種基因檢測方法：生化檢測、染色體分析和DNA分析。

1.生化檢測

生化檢測是通過化學手段，檢測血液、尿液、羊水或羊膜細胞樣本，檢查相關蛋白質或物質是否存在，確定是否存在基因缺陷。用於診斷某種基因缺陷，這種缺陷是因某種維持身體正常功能的蛋白質不均衡導致的，通常是檢測測試蛋白質含量。還可用於診斷苯丙酮尿症等。

2.染色體分析

染色體分析直接檢測染色體數目及結構的異常，而不是檢查某條染色體上某個基因的突變或異常。通常用來診斷胎兒的異常。

常見的染色體異常是多一條染色體，檢測用的細胞來自血液樣本，若是胎兒，則通過羊膜穿刺或絨毛膜絨毛取樣獲得細胞。將之染色，讓染色體凸顯出來，然後用高倍顯微鏡觀察是否有異常。

3.DNA分析

DNA分析主要用於識刖單個基因異常引發的遺傳性疾病，如亨廷頓病等。DNA分析的細胞來自血液或胎兒細胞。

5. 基因檢測方法有好幾種，哪一種方式比較好

需要按照實際需求去選擇，沒有哪個最好的說法，合適的就是最好的
常用基因診斷技術：
一、Southern印跡法（Southern blot）

基本原理是：硝酸纖維膜或尼龍濾膜對單鏈DNA的吸附能力很強，當電泳後凝膠經過DNA變性處理，覆以上述濾膜，再於其上方壓上多層乾燥的吸水紙，藉助它對深鹽溶液的上吸作用，凝膠上的單鏈DNA將轉移到濾膜上。轉移是原位的，即DNA片段的位置保持不變。轉移結束後，經過80℃烘烤的DNA，將原位地固定於膜上。
當含有特定基因片段已原位轉移到膜上後，即可與同位素標記了的探針進行雜交，並將雜交的信號顯示出來。雜交通常在塑料袋中進行，袋內放置上述雜交濾膜，加入含有變性後探針的雜交溶液後，在一定溫度下讓單鏈探針DNA與固定於膜上的單鏈基因DNA分子按鹼基到互補原理充分結合。結合是特異的，例如只有β珠蛋白基因DNA才能結合上β珠蛋白的探針。雜交後，洗去膜上的未組合的探針，將Ⅹ線膠片覆於膜上，在暗盒中日光進行放射自顯影。結合了同位素標記探針的DNA片段所在部位將顯示黑色的雜交帶，基因的缺失或突變則可能導致帶的缺失或位置改變。

二、聚合酶鏈反應

近年來，基因分析和基因工程技術有了革命性的突破，這主要歸功於聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction,PCR）的發展和應用。應用PCR技術可以使特定的基因或DNA片段在短短的2－3小時內體外擴增數十萬至百萬倍。擴增的片段可以直接通過電泳觀察，也可用於進一步的分析。這樣，少量的單拷貝基因不需通過同位素提高其敏感性來觀察，而通過擴增至百萬倍後直接觀察到，而且原先需要一、二周才能作出的診斷可以縮短至數小時。

三、擴增片段長度多態性

小衛星DNA和微衛星DNA的長度多態性可以通過PCR擴增後電泳來檢出，並用於致病基因的連鎖分析，這種診斷方法稱為擴增片段長度多態性（amplified fragment length polymorphism,Amp-FLP）連鎖分析法。PCR擴增後，產物即等位片段之間的差別有時只有幾個核苷酸，故需用聚丙烯醯胺凝膠電泳分離鑒定。此法多用於突變性質不明的連鎖分析.

四、等位基因的特異寡核苷酸探針診斷法

當基因的突變部位和性質已完全明了時，可以合成等基因特異的寡核苷酸探針（allele-specific oligonucleotide,ASO）用同位素或非同位素標記進行診斷。探針通常為長20bp左右的核苷酸。用於探測點突變時一般需要合成兩種探針，與正常基因序列完全一致，能與之穩定地雜交，但不能與突變基因序列雜交；另一種與突變基因序列一致，能與突變基因序列穩定雜交，但不能與正常基因序列穩定雜交，這樣，就可以把只有一個鹼基發生了突變的基因區別開來.

PCR可結合ASO，即PCR－ASO技術，即先將含有突變點的基因有關片段進行體外擴增，然後再與ASO探針作點雜交，這樣大大簡化了方法，節約了時間，而且只要極少量的基因組DNA就可進行。

五、單鏈構象多態性診斷法

單鏈構象多態性（signle strand conformation polymorphism,SSCP）是指單鏈DNA由於鹼基序列的不同可引起構象差異，這種差異將造成相同或相近長度的單鏈DNA電泳遷移率不同，從而可用於DNA中單個鹼基的替代、微小的缺失或手稿的檢測。用SSCP法檢查基因突變時，通常在疑有突變的DNA片段附近設計一對引物進行PCR擴增，然後將擴增物用甲醯胺等變性，並在聚丙烯醯胺凝膠中電泳，突變所引起的DNA構象差異將表現為電泳帶位置的差異，從而可據之作出診斷。

6. 常用的基因突變檢測方法有哪些

1、焦磷酸測序法

測序法的基本原理是雙脫氧終止法，是進行基因突變檢測的可靠方法，也是使用最多的方法。但其過程繁瑣、耗時長，靈敏度不高，對環境和操作者有危害，故在臨床應用中存在一定的限制。

焦磷酸測序法適於對已知的短序列的測序分析，其可重復性和精確性能與SangerDNA測序法相媲美，而速度卻大大的提高。

焦磷酸測序技術產品具備同時對大量樣品進行測序分析的能力。為大通量、低成本、適時、快速、直觀地進行單核苷酸多態性研究和臨床檢驗提供了非常理想的技術操作平台。

2、微數字聚合酶鏈反應

該方法為將樣品作大倍數稀釋和細分，直至每個細分試樣中所含有的待測分子數不超過1個，再將每個細分試樣同時在相同條件下聚合酶鏈反應後，通過基因晶元逐個計數。該方法為絕對定量的方法。

3、聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性分析技術

聚合酶鏈式反應（PCR）是一種用於放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加。該法一般用於檢測已知的突變位點。

因此，無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發、皮膚或血液，只要能分離出一丁點的DNA，就能用PCR加以放大，進行比對。這也是「微量證據」的威力之所在。

由1983年美國Mullis首先提出設想，1985年由其發明了聚合酶鏈反應，即簡易DNA擴增法，意味著PCR技術的真正誕生。到如今2013年，PCR已發展到第三代技術。1976年，台灣科學家錢嘉韻，發現了穩定的Taq DNA聚合酶，為PCR技術發展也做出了基礎性貢獻。

PCR是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈，低溫（經常是60°C左右）時引物與單鏈按鹼基互補配對的原則結合，再調溫度至DNA聚合酶最適反應溫度（72°C左右）。

DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈。基於聚合酶製造的PCR儀實際就是一個溫控設備，能在變性溫度，復性溫度，延伸溫度之間很好地進行控制。

4、高效液相色譜法

該方法是基於發生錯配的雜合雙鏈DNA與完全匹配的純合雙鏈DNA解鏈特徵的差異而進行檢測的，可檢測出含有單個鹼基的置換、插入或缺失的異源雙鏈片段。

與測序法相比，該法簡單、快速，不僅可用於已知突變的檢測，還可用於未知突變的掃描。但只能檢查有無突變，不能檢測出突變類型，結果判斷容易出錯。

5、單鏈構象異構多態分析技術

依據單鏈DNA在某一種非變性環境中具有其特定的第二構象，構象不同導致電泳的遷移率不同，從而將正常鏈與突變鏈分離出來。與測序法相比，靈敏性更高。