1. 簡述雞新城疫病毒的分離鑒定步驟。
（1）病料的採集和處理可採集病雞呼吸道分泌物、脾臟、血液、腦組織，按1：5的比例假入滅菌的生理鹽水或緩沖液，用研磨器將組織研碎製成20%的懸液，反復凍融2-3次，5000r/min離心20分鍾，取上清，用滅菌濾器過濾除菌或加抗生素殺滅病料中雜菌。
（2）分離培養將處理好的病料經尿囊腔接種9-11日齡無母源抗體的雞胚，37℃孵育，每天照蛋2次，棄除24小時內死亡胚，收集24-96小時死亡胚，96小時內未死亡胚取出。
（3）收集雞胚尿囊液採用血凝試驗檢查是否有血凝活性，對有血凝活性分離物應用標準的抗新城疫病毒，採用血凝抑制血清學試驗對病毒進行鑒定。
確定為新城疫病毒後對病毒的致病性做進一步鑒定--致病性試驗。
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3. 如何對新城疫病毒感染的病雞進行微生物學診斷
微生物學診斷
（一）病毒的分離
1．雞胚分離法。
2．細胞培養分離法 將經過處理的檢樣材料接種於雞腎單層細胞或雞胚成纖維單層細胞上，經過35～37℃孵育2d，觀察單層細胞上出現的蝕斑
（二）血清學試驗
1. 紅細胞凝集抑制試驗（HI） 應用已知雞新城疫病毒來檢測病雞體內的抗體。病程5～6d以上者，血液有抗體產生，病程10d以上者，其抗體效價可達1:1280或更高，所以應用已知病毒來測定可疑血清的方法更有實際意義。
免疫與治療
嚴格按照免疫程序接種。雛雞10～12日齡首免,用Ⅳ系苗點眼和滴鼻；25～30日齡二免,用Ⅳ系苗飲水免疫；60～70日齡三免,用Ⅰ系苗或油乳劑滅活苗0.5ml皮下注射,以後每隔半年加強免疫１次。
4. 流感新城疫抗原膠體金試紙的使用方法
提要：本文主要介紹禽流感新城疫抗原膠體金試紙的使用方法，並就具體操用、判定認知和試紙本身檢測等生產實際中常用的一些問題進行了探討。
關鍵詞：禽流感新城疫膠體金試紙 操作野毒 疫苗毒 檢測
禽用禽流感新城疫抗原膠體金快速診斷試紙相比於傳統的診斷方法具有很多優點，一經推出便受到了較好的應用。其准確及時的診斷能為疾病的防疫和控制爭取了到寶貴的時間，許多養殖場、種禽場也因此避免了因無法及時確診疾病所帶來的不應有的損失。試紙條的主要優點如下：
1、快速。十幾分鍾就能快速捕捉相關病毒，確定疾病。而酶聯反應法（ELISA法）和基因擴增法（PCR法）則需要幾個小時以上。
2、靈敏。好的產品靈敏度最低值是3×103EID50/ml，而感染禽流感或新城疫的家禽排毒量常在108EID50/ml以上。所以完全可以滿足廣大基層生產和診斷實際需要。
補：通俗地說，一般試紙的靈敏度高於0.25個血凝單位。其中使用的單克隆抗體對不同的毒株會有不同的結合度，比如對於KR1的流感毒株的靈敏度就是0.031個血凝單位，而對於分型的毒株的單克隆抗體，其靈敏度就是0.062個血凝單位。不分型的單抗是針對核衣殼蛋白的，而分型用的單抗則是對於血凝素上的某個位點的。對於野毒來說，大部分的靈敏度仍高於0.25個血凝單位，分型的試紙高於0.5個血凝單位。
有許多朋友問這個東西准不準，實際上它與早孕試紙使用差不多，沒有幾個人懷疑早孕試紙的准確性。這個試紙主要的問題在於研發時的難度比早孕試紙大，使用起來差不多。
3、及時。由於是捕捉病毒，所以不但在疾病前驅期和症狀明顯期能夠測到，在潛伏期排毒時就能檢測。能將診斷疾病的時間大大提前。而抗體測定則要晚幾天到十幾天，才能測到抗體的變化。這對快速發病的高致病力禽流感和強毒株新城疫病來說就太晚了。而且由於禽流感毒株的變異，常使新的毒株能夠避開疫苗產生的抗體的攻擊（免疫逃逸）而使家禽養殖場在疫苗抗體很高很好時遭受巨大的損失，而這一變化在抗體測定上常反映不出來。
4、簡便。攜帶方便操作簡單，田間野外也可進行操作，且不需要專門的儀器。不象ELISA和PCR方法需要價格不菲的儀器、專門的實驗室和專業的培訓。
5、價廉。成本低廉，從幾元到幾十元不等。一棟5000隻的雞舍一般使用一兩條即可。
6、穩定。試紙2～30℃常溫保存一般在一年半以上。好的產品保存期長達兩年以上。
7、面廣。雞、鴨、鵝、鴿、火雞、孔雀、鵪鶉等大部分家禽都能測定。可採集的樣本有氣管液體、腸道內容物、泄殖腔內容物和經處理的臟器組織等。
但是試紙作為新出現的高科技產品在使用過程中，仍有一些需要注意的問題。下面從具體操作、判定及判定認知和試紙本身檢測三個方面就遇到一些問題進行探討，以期達到拋磚引玉的作用。
一、 試紙具體操作上的一些問題
（一）、正常操作步驟
目前一套完整的試紙常分兩種：一種是一條試紙、一個含病毒洗脫液瓶的洗液瓶、一個吸液管、一個棉簽；另一種其它一樣，只是在功能上將洗液瓶和吸液管合並成一個可以做滴液瓶的組合洗液瓶，其瓶蓋上有一個可折的下部中空的小桿，打開後反轉洗液瓶即可做滴管。正常的操作步驟如下：
1、用棉簽在合適的地方（氣管、腸道、泄殖腔等處）取樣。
2、將樣本插到裝有洗脫液瓶中並加以攪拌。蓋好瓶蓋並加以搖晃，使病毒盡量從樣本中釋放到洗脫液中。
3、用吸管吸取上部較清液體，滴到試紙的滴孔處。陸續滴4～5滴。如果是可作滴管的組合洗液瓶，則掰開瓶蓋上的小桿，露出小孔反轉小瓶作滴管用。
4、30分鍾內觀測結果。
（二）具體使用中的一些技巧
1、采樣要求
鑒於家禽排毒量與日齡常呈正相關，日齡越小排毒量相對越少。所以建議六十天以下的小雞剖檢取樣，六十天以上雞可以通過泄殖腔采樣。從已死亡的家禽身上取樣時要注意，氣管采樣不取痰，只在氣管清亮處或病變部位采就行。在十二指腸、小腸中段卵黃蒂周圍取樣時，要用剪子輕刮一下打開的腸道面，在暴露出的腸道淋巴濾泡腫脹、出血和潰瘍的部位取樣就行。
因為試紙本身是捕捉病毒的，所以只取眼觀發病或病死家禽就行，不用象測抗體那樣，按比例隨機抓家禽。試紙初始設計是一條試紙測一隻家禽，實際應用中可以一條試紙測3～5隻家禽的樣本，這樣既擴大采樣量增加了准確率，又能大幅降低使用成本。就是要注意多次使用的棉簽，注意每次采樣後要盡量將含棉球部分沿洗脫液瓶轉著擠一下，讓樣本液盡量多留到洗脫液中，又能使棉球再具一定的吸水力以便再采樣有效。同時要注意多次采樣時，所采樣本不要過於粘稠，這樣不利於金標在試紙上的流動。如果在滴液過程中發現因此原因而致金標流動不暢，可以在試紙滴孔上加一滴未用過的洗脫液助其流動，同時也可用棉簽的另一端在滴孔處輕輕攪幾下助樣本液滲透。
2、加液要求
一般洗脫液要求加滴4～5滴，不要少加或多加。加少了，金標有時會跑不到試紙的未端；加多了，金標會飄浮，也不利於金標的流動。同時要注意試紙條放置要盡量水平。
3、金標流動
要讓金標跑完後再下結論，因為試紙檢測上噴塗有捕捉病毒用的單克隆抗體，其本身在硝酸纖維膜上有個高度，會對流動的金標有個阻擋作用，所以不要在金標流動中下結論。既使紅色的金標液沒有跑完，如有相應的病毒，檢測線上會呈現一條直線。不是金標本身流動中頭部產生的彎月形的曲線。
現在最新一代的金標試紙採用紫金技術，不再有現行紅金技術的紅霧和紅彎曲線的干擾了。請廣大使用者注意技術上的進步情況。
4、病毒量與檢測線顏色的關系
檢測線上的顯示的病毒顏色與病毒的量成正比。色越深病毒越多，色越淺病毒越少。在生產實際中，隨著發病家禽經防疫控制後再整體檢測病毒，如果抗體上升較好，檢測線上的顏色會從最初的較深逐漸變淺，直至消失，即病毒沒有了或低於檢測最低值了。這時家禽整體狀態也會出現很好的恢復。
5、洗脫液與洗液瓶的問題
洗脫液之間配方稍有不同，可以混用，但最好專用。有些獸醫想用生理鹽水來代替洗脫液，這種想法不行。因為生理鹽水洗脫病毒功能較差且沒有洗脫液專有的緩沖系統作用和消泡等作用。
采樣要求用專配的洗瓶瓶和吸管進行。盡量不要用其它代用品，因為已多次發現有的試驗室的器具被病毒污染，盡管多次洗滌和消毒但仍能測到病毒（包括死病毒）的存在，應用這樣器具就會出現不應有的假陽性。
6、試紙保存
試紙要求在2～30℃保存，禁止冷凍。
二、試紙結果判定與判定認知
膠體金試紙盡管操作簡單，但也有個從不熟悉到熟練的過程。而試紙使用中更主要的問題表現在實驗室結果與傳統眼觀和剖檢經驗之間的沖突。這類沖突在認知上的解決和整合對獸醫診療水平的提高具有極大的意義。對於獸醫適應養殖業升級的內在要求也有很大價值。
（一）、初期使用
剛開始使用試紙建議用標准抗原或活疫苗來熟悉和觀察金標如何捕捉病毒並顯色，同時與無病毒對照多次使用直到熟練為至。這種鍛煉一是檢測試紙靈敏度並建立對產品的信心，二是對後面的田間操作是個很好的基礎。
有一部分使用者拿到試紙後直接用於田間測定，結果與通過眼觀和剖檢預判很一致。很快就能進行熟練掌握試紙的使用和相關的判定工作。但另外許多基層獸醫使用者卻沒有這樣幸運，主要問題有以下幾種情況：
1、自己認為是新城疫或禽流感，或者眼觀與剖檢預判「確診」是這些病時，用試紙檢測卻什麼也測不到；而當自己認為只是輕微呼吸道不會是什麼大病時，用試紙卻能測到大量的新城疫病毒或禽流感病毒。
2、再一種情況是，與自己的經驗嚴重不符。自己認為是新城疫，結果測出來是禽流感；或者自己認為是禽流感，卻只能測到新城疫病毒。
如果連續出現幾次這種情況，使用者就會出現兩種認識傾向：一是產品根本不準，二是自己平時的診斷是否有問題，甚至懷疑「平時看的此類病例是不是半數都不對？」從本質上說，膠體金試紙實際上屬於實驗室用產品，出現上述情況是實驗室結果與眼觀和剖檢的經驗之間的沖突。如何解決這些沖突呢？
（二）、引起認識混亂的原因與解決方法
造成前述混亂情況有以下幾種原因：
1、試紙操作不熟練。這可以通過多練習、多對比、多總結來解決。一般獸醫人員經過幾次練習就能熟練掌握操作要領。
2、所采樣本不合適，沒有抓到發病家禽或排毒家禽。這可以通過多抓幾只家禽和多測幾次來減少失誤率。畢竟給家禽看病，是通過幾個個體的檢測來給群體定病的。
3、至於「自己」通過眼觀和剖檢所「確診」的疾病，而試紙檢測結果與「確診」內容不符的情況。首先，確診疾病是用實驗室手段如病毒捕捉、基因測定、病毒分離等手段來驗證，而不是反過來，眼觀或剖檢叫「確診」。這也是一些「好獸醫」心理深處不願接受的。但這一關過不了。高新產品反而會成為這些獸醫斷病的一個障礙。
造成此種情況的另一個原因就是，眼見病症明顯或家禽處於疾病轉歸期時，排毒量反而很少或不排毒了，盡管是禽流感或新城疫引起的，但卻可能檢測不到病毒。一般患症家禽是在疾病的潛伏期、前驅期和證狀明顯期三個階段排毒較多，過了這些階段的家禽排毒反而少了。另外一個情況就是目前家禽都大量做新城疫和禽流感疫苗，其產生的抗體對病毒的繁殖也會有程度不同的抑製作用。但這些可能通過多采患病家禽樣本多用幾條試紙檢測來解決。
還有一個深層次的原因，就是養殖戶認為「拿葯出錢檢測免費」，而獸醫門市也不願多貼錢。雙方都不願為確診疾病而投入，這就導致實際操作中也不多病例采樣本也不搞多次檢測，使得檢測沒有深入進行。這種「重治不重防」的情況在種禽場也大量存在。這也說明我們疾病控制從「重治」轉化「重防」不光是資金問題，還有深層次上心理認識和觀念認識上的問題。
（三）、解決相關判定認知的意義
我國家禽養殖場已經越過生產與消費正反饋相互促進增長的階段，進入相對飽和的狀態。當前家禽業特別是肉雞和蛋雞養殖業已進入「祖代種雞多、父母代種雞多、商品代雞多、消費量反而減少」的「三多一少」階段，家禽養殖業就要擺脫「小規模大群體」進入「小群體大規模」的升級狀態，其對獸醫的要求也要大大提高。光憑眼觀看病或「一把剪子闖天下」的時代就要結束了，所以積極引進膠體金試紙等新技術提高診療水平也是獸醫和養殖場技術工作者的一個內在需求了。這也是下一步更激烈競爭的一個重要要求。
（四）、一些數據和問題
從使用試紙檢測統計上的數據來看，在近幾年檢測到的近5000例新城疫與禽流感病例中，70%是新城疫、25%是禽流感H9、5%是禽流感H5。其中極少一部分是禽流感與新城疫混合感染。當然在某一階段某一種疾病可能佔主要數量。
由於家禽大量應用疫苗，就是發現新城疫和禽流感野毒也不一定嚴重發病，而且在一些抗體正常的種禽場或養殖場仍能檢測到新城疫野毒和禽流感野毒的存在。變異病毒一旦出現免疫逃逸常會使養殖業造成極大的損失。
一些養殖場常在感染禽流感時習慣性地做新城疫疫苗，往往造成較大損失。也有一些門診獸醫將禽流感當新城疫「治」，讓養殖戶打Ⅰ系苗，結果造成大量死亡，引起較大的「醫患糾紛」。
在實際檢測中發現，禽流感無論是H9還是H5，與新城疫混合感染時，（在防止針頭傳播的前提下）做新城疫苗者均有較大損失。建議做二者的滅活苗。
還有一個發現就是，能在有的種雞場種雞發病時所用種蛋的孵化死胚中測到H5病毒和新城疫病毒，說明最少在種禽發生新城疫和禽流感時應停用種蛋，新城疫與禽流感能否垂直傳播還要待科研人員研究。
（五）、關於野毒與疫苗毒的問題
試紙本身並不能分出野毒和疫苗毒。但我國目前只有注射用的禽流感油乳劑滅活苗，且這些滅活的病毒不會出現在試紙樣本採集的氣管和腸道部位。所以只要試紙檢測到病毒，它就是野毒。
我國的實驗室曾研發成功禽流感新城疫基因重組苗。這個病毒是在新城疫病毒上表達一個H5血疑素蛋白，所以在試紙測量中，能測到新城疫病毒，通用型禽流感試紙測不到禽流感病毒，但禽流感H5試紙會檢測到H5病毒（實際上是捕獲了新城疫病毒上的禽流感H5的血疑素）。不過這一疫苗未在市場上流通。
新城疫油苗也不會被試紙檢測到。但在活疫苗免疫後一周內，有可能測到疫苗毒。如果家禽群免疫應答正常時，一周後於測到疫苗毒的概率就大大降低了。但有一點還可以來幫助鑒別疫苗毒和野毒。一般情況下，疫苗毒不會引起家禽群出現大批發病情況。也就是疫苗毒不會出現眼觀症狀和剖檢病變。從做苗時間、試紙測量和眼觀剖檢情況綜合考慮也不難做出正確的判斷。
三、試紙本身的檢測
試紙的靈敏度可以用標准抗原來測定，其中新城疫試紙還可以用活疫苗來檢測。當然，試紙也能測量疫苗有沒有病毒、病毒的大致含量。試紙不能直接檢測油乳劑滅活苗，經處理去油後的滅活尿囊液是可以測定的。
5. 檢測雞新城疫抗體常用的血清學實驗是
血凝抑制試驗。