A. 免疫細胞分類及分離方法是什麼
免疫細胞（immune cell）主要是指能識別抗原，產生特異性免疫應答的淋巴細胞等。淋巴細胞是免疫系統的基本成分，在體內分布很廣泛泛，主要是T、B淋巴細胞受抗原刺激而被活化（activation），分裂增殖、發生特異性免疫應答。除T淋巴細胞和B淋巴細胞外，還有K淋巴細胞和NK淋巴細胞，共四種類型。T淋巴細胞是一個多功能的細胞群。除淋巴細胞外，參與免疫應答的細胞還有漿細胞、粒細胞、肥大細胞、抗原呈遞細胞及單該吞噬細胞系統的細胞。免疫細胞分離技術
1、淋巴細胞的分離
取肝素抗凝血1m1 加Hanks 液1m1 稀釋後，沿管壁徐徐滴流疊加盛有2m1 淋巴細胞分離液的試管內(注意勿與分離液混合，然後2000r／min 水平離心20min，管內分為4 層，自上而下依次為血漿，單個核細胞，顆粒白細胞、紅細胞(圖2—1)。用毛細管伸至單個核細胞層中(位於細胞分離液與血漿的界面上)，沿管壁輕輕吸出全部細胞。然後用Hanks 液洗兩次，每次2000r／min 離心10min，最後用RPMI l640 培養液將細胞配成2×106／m1 的細胞懸液備用。
2、T 細胞及B 細胞的分離
將淋巴細胞懸液通過尼龍棉柱，B 細胞粘附於尼龍棉上，T細胞則不粘附，先用RPMI l640 培基洗脫尼龍棉柱，流下的細胞懸液含有豐富的T 細胞。然後用力反復擠壓尼龍柱、擠出粘附在尼龍棉上的B 細胞，並用少量的RPMI l640 培基洗脫，此細胞懸液含有豐富的B 細胞。尼龍柱(塑料管)的長短和尼龍棉的多少，視分離細胞的多少而定。
3、CD4 細胞及CD8 細胞的分離
（1）CD4 細胞的分離：將一定量的T 細胞懸液通過一根SephDdexC—10 柱，然後用少量的RPMll640 培養洗滌，收獲的細胞懸液約含85％的CD4 細胞。
（2）CD8 細胞分離：用Tris 緩沖液稀釋羊抗鼠IgG(濃度為10μg／m1)包被一平皿表面，然後放置4℃過夜，沒有包被上的抗體用PBS 洗凈。然後將已標記有抗CD8 單克隆抗體的T 細胞(細胞濃度為1×l07／m1)3m1 加入上述的平皿內，4℃放置2 小時，用PBS 輕輕洗凈末粘附的細胞，然後用毛細管加入10m1 PBS 吹打。收集的脫落細胞經洗滌後懸浮在RPMI l640 培基中備用。CD4 細胞亦可用此法分離。
4、單核巨噬細胞的分離
單核巨噬細胞有粘附塑料或玻璃表面的特性，而淋巴細胞則無此特性，藉此可將這兩類細胞分開，其方法簡述如下。將待分離的細胞懸液(如實物動物的腹腔液)加入適當大小的塑料或玻璃平皿內，置於37℃ C02 溫箱內溫育1 小時，然後用RPMI 1640 培基輕輕漂洗平皿表面，去除非粘附細胞，再將粘附有細胞的平皿表面用上述培基輕輕洗刷，收集粘附的單核巨噬細胞。如果要獲得純度較高的單核巨噬細胞，可重復上述過程。
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C. 求人外周血B、T淋巴細胞的分離方法
目前常用Ficoll密度梯度離心法直接分離和純化外周血單個核細胞。
方法:
1.在短中管中加入適量淋巴細胞分離液。
2.取肝素抗凝靜脈血與等量Hank's液或RPMI1640充分混勻，用滴管沿管壁緩慢疊加於分層液面上，注意保持清楚的界面。水平離心2000rpm×20分鍾。
3.離心後管內分為三層，上層為血漿和Hank's液，下層主要為紅細胞和粒細胞。中層為淋巴細胞分離液，在上、中層界面處有一以單個核細胞為主的白色雲霧層狹窄帶(如下圖)，單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞。此外，還含有血小板。
4.用毛細血管插到雲霧層，吸取單個核細胞。置入另一短中管中，加入5倍以上體積的Hank's液或RPMI1640，1500rpm×10分鍾，洗滌細胞兩次。
5.末次離心後，棄上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重懸細胞。取一滴細胞懸液與一滴0.2％台盼蘭染液混合，於血球計數板上，計數四個大方格內的細胞總數。
單個核細胞濃度(細胞數／1毫升細胞懸液)＝
4個大方格內細胞總數
──────────×104×2(稀釋倍數)
4
6.細胞活力檢測：死的細胞可被染成蘭色，活細胞不著色。計數200個淋巴細胞。計算出活細胞百分率。
活細胞數
活細胞百分率＝──────×100％
總細胞數
用本法分離PBMC，純度在90％以上，收獲率可達80～90％，活細胞百分率在95％以上。
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E. 請教：小鼠單個核細胞分離及Ficoll
單核細胞（monocytes）是體積最大的白細胞.其細胞核常偏位,呈多形性,如卵圓形、腎形、馬蹄形、不規則形等,常有折疊感；染色質呈疏鬆網狀,著色較淺.胞質較多,嗜鹼性,但因含大量細小的嗜天青顆粒而染成灰藍色,顆粒含過氧化物酶.血塗片,Giemsa染色 .
單個核細胞是指只有一個細胞核的細胞.一般醫學檢驗書上說的是「外周血中單個核的白細胞」包括「淋巴細胞和單核細胞」.外周血單個核細胞（Peripheral blood mononuclear
cell,PBMC)即外周血中具有單個核的細胞,包括淋巴細胞和單核細胞.體外檢測淋巴細胞首先要分離外周血單個核細胞,目前主要的分離方法是
Ficoll-hypaque（葡聚糖－泛影葡胺）密度梯度離心法,因為血液中各有形成分的比重存在差異,因此得以分離.紅細胞和
粒細胞密度大於分層液,同時因紅細胞遇到Ficoll而凝集成串錢狀而沉積於管底.血小板則因密度小而懸浮於血漿中,唯有與分層液密度相當的單個核細胞密
集在血漿層和分層液的界面中,呈白膜狀,吸取該層細胞遞經洗滌高心重懸.本法分離單個核細胞純度可達95%,淋巴細胞約佔90%～95%,細胞獲得率可達
80%以上,其高低與室溫有關,超過25℃時會影響細胞獲得率.