⑴ 食品衛生微生物學檢驗.大腸菌數測定
微生物
一、大腸菌群的檢測GB4789.3-2010
第一法 大腸物寬察菌群MPN計數法 第二法 大腸菌群平板計數法
1.1月桂基硫酸鹽胰蛋白腖（LST）肉湯:稱取35.6g溶於1000ml蒸巧拆餾水中，加熱煮沸至完全溶解，分裝於有倒立發酵管的試管中，每管10ml，121℃高壓滅菌15min後備用。雙料除蒸餾水外其他成分加倍。
1.2煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯：稱取30g溶於1000ml蒸餾水中分裝 ，經115℃15min高壓滅菌備用。
1.3無菌生理鹽水：稱取8.5gNaCl溶於1L蒸餾水中。分裝於250ml的錐形瓶中，121℃高壓滅菌15min後備用
1.4結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）：稱取41.6g溶於1L蒸餾水中，充分搖勻，加熱煮沸2min冷卻至50℃，傾注平板。
無菌 1 mol/L NaOH：稱取40 g氫氧化鈉溶於1 000 mL蒸餾水中，121 ℃高壓滅菌15 min。
無菌 1 mol/L HCl：移取濃鹽酸90 mL，用蒸餾水稀釋至1 000 mL，121 ℃高壓滅菌15 min。
二、大腸菌群的檢測GB4789.3-2003 第一法 大腸菌群MPN計數法
2.1稱取乳糖膽鹽發酵培養基35.0g溶於1000ml蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，分裝於有倒立發酵管的試管中，每管10ml，115℃高壓滅菌15min後備用。雙料除蒸餾水外其他成分加倍。
2.2伊紅美藍瓊脂平板：稱取伊紅美藍瓊脂37.5g溶於1000ml蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，分裝、115℃高壓滅菌15min後備用。
2.3乳糖發酵管：稱取乳糖發酵培養基35.0g溶於1000ml蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，分裝於有倒立發酵管的試管中，每管10ml，115℃高壓滅菌15min後備用
2.4無菌生理鹽水：稱取8.5gNaCl溶於1L蒸餾水中。分裝於250ml的錐形瓶中，121℃高壓滅菌15min後備用
2.5革蘭氏染色按GB/T4789-2003中罩茄2規定。
⑵ 食品中大腸菌群的檢驗，有哪些需要注意的實驗步驟
食品微生物學檢驗 大腸菌群計數：大腸菌群平板計數法（GB 4789.3-2010）
一 試劑和儀器
煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB肉湯）
結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）
恆溫培養箱
自動稀釋儀
均質器
振盪器
二 樣品處理
固體樣品應在無菌條件下充分粉碎。本次演示以乳粉為例，取密封狀態良好的試樣，備用待測。
三 檢測過程
實驗前准備
進入無菌操作室前應更換無菌實驗服，戴帽子、口罩、無菌手套。進入無菌操作室後，首先用鑷子夾取適量酒精棉全面擦拭雙手，然後才能進行實驗操作。
酒精易燃，因此在擦拭雙手的過程中應離開酒精燈火焰一定距離，防止出現危險，待手上的酒精揮發完全後，再進行實驗操作。
樣品的稀釋
取一潔凈無菌均質袋於自動稀釋儀上，用酒精棉充分擦拭樣品袋，將剪刀置於酒精燈外焰上充分灼燒，小心剪開樣品袋。將稱樣勺於酒精燈外焰灼燒片刻，准確稱取25g樣品於無菌均質袋中。用酒精燈外焰灼燒注水口片刻，在盛有樣品的均質袋中注入225mL無菌生理鹽水或磷酸鹽緩沖液。取下均質袋，將均質袋放入拍擊式均質器中，用均質器拍打1min～2min，製成1:10的樣品勻液。
注意：樣品勻液的pH值應在6.5～7.5之間，必要時可用1 mol/L無菌氫氧化鈉或1mol/L無菌鹽酸溶液調節。
均質完畢後，做好標記，將均質袋置於樣品框中。
在裝有9mL生理鹽水的無菌試管上做好標記，用1mL無菌吸管吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩緩注入裝有9mL生理鹽水的無菌試管中，稀釋前後試管口都應在酒精燈上灼燒片刻。加塞後於振盪器上混合均勻，製成1:100的樣品勻液。同理，按上述操作，依次製成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。稀釋樣品時，注意吸管或吸頭尖端不得觸及稀釋液面；每遞增稀釋1次，換用1支1mL無菌吸管或吸頭。
接種及培養
在事先經滅菌處理的培養皿底部做好標記。根據對樣品污染狀況的估計，選取2～3個適宜的連續稀釋度。本次演示只做1:10和1:100的樣品稀釋液。
用無菌吸管吸取1:10樣品稀釋液1mL，加入到培養皿中，備用。同理，加入1:100稀釋液和空白液。注意，每個稀釋度應接種2個無菌培養皿，空白液即為以1mL生理鹽水代替1mL樣品稀釋液。
加完樣品梯度稀釋液後，即可傾倒培養基。傾倒前應將錐形瓶的瓶口在酒精燈上充分灼燒。灼燒後及時傾注15mL～20mL結晶紫中性紅膽鹽瓊脂於每個培養皿中，小心旋轉培養皿，將培養基與樣液充分混勻。傾注培養基時應將錐形瓶口盡量伸入培養皿內，防止傾倒時培養基掛在培養皿的內壁或外壁上，且傾倒過程應果斷，防止培養基沿錐形瓶外壁流出、滴落。培養基的溫度以46℃為宜，不能過高或過低，溫度過高不利於操作且對菌體有害，溫度過低培養基迅速凝固，菌體不能在培養皿內均勻的分布，導致菌落計數困難。轉動培養基時用力須均勻，防止培養基沾到培養皿上蓋或灑出。
倒完培養基後，靜置培養皿，等待培養基冷卻凝固。
待培養基凝固後，再加3mL～4mL 結晶紫中性紅膽鹽瓊脂覆蓋平板表層。加兩次培養基的主要目的是：使菌體均在培養基內部生長，以便於觀察典型菌落形態。等待培養基冷卻凝固。待培養基凝固後，翻轉平板，置於培養箱中於36℃±1℃條件下培養18h～24h。
平板菌落計數
選取菌落數在15CFU～150CFU之間的平板，分別計數平板上出現的典型和可疑大腸菌群菌落，其中典型菌落的特徵為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉澱環，菌落直徑為0.5mm或更大。
證實實驗
先在煌綠乳糖膽鹽肉湯管上做好標注。將接種環置於紅外滅菌器中滅菌，再用接種環從結晶紫中性紅膽鹽瓊脂平板上挑取10個不同類型的典型和可疑菌落，分別移種於煌綠乳糖膽鹽肉湯管內，振搖均勻。每次接種後都應及時將接種環在滅菌器中滅菌。將接種完的煌綠乳糖膽鹽肉湯管置於培養箱中，於36℃±1℃條件下培養24h～48h。培養完畢後，觀察煌綠乳糖膽鹽肉湯管中產氣情況。凡管內倒管有氣泡者，即可報告為大腸菌群陽性。