池塘底中弧菌檢測方法

1. 霍亂弧菌的檢測方法

根據弧菌O抗原不同，分成Ⅵ個血清群，第Ⅰ群包括霍亂弧菌的兩個生物型。第Ⅰ群A、B、C三種抗原成份可將霍亂弧菌分為三個血清型：含AC者為原型（又稱稻葉型），含AB者為異型（又稱小川型），A、B、C均有者稱中間型（彥島型）。
1992年10月在印度東南部又發現了一個引起霍亂流行的新血清型菌株（0139），它引起的霍亂在臨床表現及傳播方式上與古典型霍亂完全相同，但不能被01群霍亂弧菌診斷血清所凝集，抗01群的抗血清對0139菌株無保護性免疫。在水中的存活時間較01群霍亂弧菌長，因而有可能成為引起世界性霍亂流行的新菌株，推薦使用天津生物晶元生產的霍亂弧菌診斷血清。 1,普通聚合酶鏈反應法
核酸擴增技術，即聚合酶鏈式反應（polymerase chainreaction，PCR），其基本原理是設計、合成兩條寡核苷酸，作為引物，對應於待測病原微生物某一段特異性序列的兩端，然後在體外模擬DNA體內復制的過程反復擴增，使靶序列放大上萬倍甚至上百萬倍而被檢測出來。一般選擇霍亂腸毒素(cholera enterotoxin，CT)基因ctx的保守序列作為靶基因。一些非產毒株(如環境來源的菌株)有可能通過基因水平轉移獲得毒力基因成為產毒株，若僅檢測ctx基因容易造成漏檢。因此，霍亂弧菌的其他重要基因，如毒力協同調節菌毛A基因(tcp A)、o抗原基因(rfb)、外膜蛋白基因(omp)以及毒力表達調控基因(toxR)等也被選用為PcR的靶基因，這大大提高了檢測的特異度.
2 ,多重PCR法
與常規PCR相比，多重PCR一次反應可檢測多個基因，節省了時間和成本。國內、外許多學者選用霍亂弧菌的毒素基因ctx、tcp與其他基因如ompW、rfb、hly進行組合，作為共同的靶基因，克服了由於毒力基因特異度不夠高而造成的假陽性。多重PcR同時可准確區分不同血清型的霍亂弧菌和快速鑒定其是否為產毒株，可謂一舉多得，大大提高了檢測效率。
3.熒光定量PCR法
熒光定量PCR自動化程度高、特異性強、無交叉污染，在霍亂弧菌的快速診斷中得到廣泛應用。尤其是近年來，隨著引物與探針的設計更精確、多通道熒光PCR儀的開發與廣泛使用，多重熒光定量PCR技術日臻成熟，並以其高通量、低成本、高效率等優點而廣泛應用於病毒、細菌、真菌等多種病原體的快速檢測，成為應用的熱點. 與PCR方法相比，基因晶元技術能同時獲得更多病原學、生物學方面的信息，從而更為全面地分析、掌握病原微生物的特徵。Vora等[12]運用基因晶元技術對多種致病性弧菌的毒力、毒素、耐葯基因及潛在的毒力基因進行全面分析，對掌握這些細菌的致病性及進行有效預防、控制等具有重要意義。但基因晶元成本較高，距離推廣應用尚需時間等待 。

2. 霍亂弧菌國家規定是否屬於強制性檢驗范圍，又是如何檢驗的（檢驗方法），在動物上是否有疫苗；

霍亂弧菌檢查常規方法是：直接塗片、染色檢查、動力觀察制動試驗。
檢查過程
(1)、增菌稱取檢樣25g，加入裝有225mL鹼性蛋白腖水(APW)的廣口瓶內。固體樣品應以均質器9000r/min-10000r/min打碎，或以剪刀充分剪碎。(36±1)℃培養6h-8h和16h-24h。如為牡蠣樣品，應同樣制備另一份檢樣，置於APW中，42℃培養6h-8h和16h-24h。(2)、分離以3mm-5mm接種環取6h-8h和16h-24h增菌培養液的表面生長物一環分別劃線家終於TCBS瓊脂平板至少各一個，於(36±1)℃培養18-24h。在TCBS瓊脂上，典型的霍亂弧菌菌落為大的，光滑，黃色，稍平，具有不透明中心和半透明的邊緣。(3)、初步鑒定① 用接種環挑取TCBS瓊脂平板上2-5個可疑菌落，劃線於T1N1瓊脂平板上，(36±1)℃培養12h-18h。② 以無菌白色濾紙沾取T1N1瓊脂表面培養物，滴加氧化酶試劑進行氧化酶試驗。③ 以無菌環取氧化酶陽性的培養物於0.5%去氧膽酸鈉液試劑滴中，進行粘絲試驗。④ 以接種針取氧化酶和粘絲試驗陽性的培養物，接種TSI、KIA和AGS，穿刺底層並劃線斜面。⑤ 以接種針取上項相同培養物接種T1N0和T1N3肉湯。⑥ 將TSI、KIA、AGS、T1N0和T1N3肉湯於(36±1)℃培養18h-24h。
目前正在接受WHO預審的兩種口服霍亂疫苗，均是滅活全細胞霍亂弧菌血清群O1疫苗：Shanchol疫苗還含有霍亂弧菌血清群O139；而Dukoral疫苗（Crucell）含有重組的霍亂毒素B亞單位。
實際應用中，Dukoral疫苗短期內（6個月）可提供84%的保護作用，並已在亞洲、非洲成功應用；而Shanchol疫苗效能僅在印度Kolkata試驗條件下檢驗過，其實際臨床應用的有效性仍待進一步確定，且該試驗是對疫苗的長期（接種後2、3和5年）保護作用進行評估，其接種後第一個月的免疫效果仍不清楚。