松材線蟲分子檢測方法有哪些

① 松材線蟲病的鑒別特徵

1、測量數據：雌⒇：L=1140µm；a=39.4；b=11.1；c=27.3；v=72.9%；st=15.2 µm；雄⒇：L=1070µm；a=47.6；b=11.0；c=31.3；st=15.1 µm；sp=29.8 µm 2、雌雄蟲都呈蠕蟲形，蟲體細長，長1mm左右。唇區高，縊縮顯著。口針細長，其基部微增厚。中食道球卵圓形，占體寬的2/3以上，瓣膜清晰。食道腺細長葉狀，覆蓋於腸背面。排泄孔的開口大致和食道與腸交接處平行，半月體在排泄孔後約2/3體寬處。卵巢單個，前伸；陰門開口於蟲體中後部73%處。上覆以寬的陰門蓋。後子宮囊長190µm，約為陰肛距的3/4。雌蟲尾亞圓錐形，末端寬圓，少數有微小的尾尖突。雄蟲交合刺大，弓狀，成對，喙突顯著，交合刺遠端膨大如盤。雄蟲尾似鳥爪，向腹面彎曲，尾端為小的卵狀交合傘包裹，退火的交合傘在光學顯微鏡下不易看見，交合傘（為翼）是尾的角質膜的延伸，在問短呈鏟狀，由於邊緣向內捲曲，從背面觀呈卵形，從側面觀呈尖圓形。病材中的幼蟲蟲體前部和成蟲相似，但其後部則因腸內積聚大量顆狀內含物，以至呈暗色並接結構模糊。幼蟲尾亞圓錐形。

② 擬松材線蟲與松材線蟲的形態區別

最主要的區別是尾部的尾尖突不同：

二者在形態上的區別專業描述

擬松材線蟲都有尾突，長度比松材線蟲略長，但實際操作中，這個特徵很難把握，近些年來逐步發展起來了許多新技術和方法，其中PCR技術被作為形態學鑒定的輔助手段，對於鑒定那些形態特徵不夠典型的松材線蟲或擬松材線蟲以及幼蟲有很大的幫助，有助於快速准確地鑒別松材線蟲。

由於分子檢測過程繁瑣，且需要專業的分子生物學技術基礎，集成了該檢測技術的松材線蟲自動化分子檢測系統可以自動檢測，避免人為因素影響檢測結果。

③ 松材線蟲的發生規律如何怎樣防治

（1）發生規律松材線蟲病多發生在每年7～9月份。高溫乾旱氣候適合病害發生和蔓延，低溫則能限制病害的發展；土壤含水量低，病害發生嚴重。傳播松材線蟲的主要媒介是松墨天牛。松墨天牛一般5月前後羽化，從罹病樹中羽化出來的天牛幾乎100%攜帶松材線蟲，天牛體內的松材線蟲均為耐久性幼蟲，這階段幼蟲抵抗不良環境能力很強，它們主要分布在天牛的氣管中，每隻天牛都可攜帶成千上萬條線蟲，最高可達28萬條。當天牛在樹上咬食作補充營養時，線蟲幼蟲就從天牛取食造成的傷口進入樹脂道，然後蛻皮成為成蟲。被松材線蟲侵染的松樹往往又是松墨天牛的產卵對象。翌年，在罹病松樹內寄主的松墨天牛羽化時又會攜帶大量線蟲，並「接種」到健康的樹上，導致病害的擴散蔓延。病原線蟲近距離由天牛攜帶傳播，遠距離則隨調運帶有松材線蟲的苗木、枝丫、木材及松木製品等傳播。松樹線蟲雌雄蟲交尾後產卵，每雌蟲產卵越100粒。蟲卵在溫度25℃下30小時孵化，幼蟲共4齡。在溫度30℃時，線蟲3天即可完成一個世代。松材線蟲生長繁殖的最適溫度為20℃，低於10℃時不能發育，28℃以上繁殖會受到抑制，在33℃以上則不能繁殖。（2）防治方法①嚴格檢測制度，禁止疫區的苗木、木材、木製品、枝丫、鋸片等運往非病區。
②清除病害的枯木或瀕於枯死的樹木，集中成堆，用塑料布密封，以溴甲烷熏蒸5～10小時，葯量為69～83克/米3，可殺滅天牛成蟲及幼蟲。樹丫集成小堆燒毀。也有用天牛化學引誘劑Ⅰ號誘殺天牛或養放腫腿蜂（Scleroderma guani）寄生天牛幼蟲誅殺。
③預防性噴葯，噴葯一次可持效2.5～3個月。可用25%殺螟松乳劑，每公頃3～3.6千克。

④ 在野外如何識別松材線蟲病，該病害在普查和調運檢疫中的取樣和鑒定方法

野外識別是看是否出現松樹枯死、針葉褪色、黃化、枯萎以及呈紅褐色等松針變色症狀等異常情況。取樣鑒定是否發生松材線蟲病。

取樣方法和鑒定方法具體參照最新《松材線蟲病防治技術方案》指導：

（三）取樣。

1.取樣對象。抽取尚未完全枯死或者剛枯死的松樹，不應當抽取針葉已全部脫落、材質已腐朽的枯死樹。可參照以下特徵選擇取樣松樹：

——針葉呈現紅褐色、黃褐色的松樹；

——整株萎蔫、枯死或者部分枝條萎蔫、枯死，但針葉下垂、不脫落的松樹；

——樹幹部有松褐天牛等媒介昆蟲的產卵刻槽、侵入孔的松樹；

——樹幹部松脂滲出少或者無松脂滲出的松樹。

2.取樣部位。一般在樹干下部（胸高處）、上部（主幹與主側枝交界處）、中部（上、下部之間）3個部位取樣。其中，對於僅部分枝條表現症狀的，在樹幹上部和死亡枝條上取樣。對於樹干內發現媒介昆蟲蟲蛹的，優先在蛹室周圍取樣。

3.取樣方法。在取樣部位剝凈樹皮，用砍刀或者斧頭直接砍取100-200克木片；或者剝凈樹皮，從木質部表面至髓心鑽取100-200克木屑；或者將枯死松樹伐倒，在取樣部位分別截取2厘米厚的圓盤。所取樣品應當及時貼上標簽，標明樣品號、取樣地點（需標明地理坐標）、樹種、樹齡、取樣部位、取樣時間和取樣人等信息。

4.取樣數量。對需調查疫情發生情況的小班進行取樣時，總數10株以下的要全部取樣；總數10株以上的先抽取10株進行取樣檢測，如沒有檢測到松材線蟲，應當繼續取樣檢測，直至全部取樣檢測為止。

5.樣品的保存與處理。採集的樣品應當及時分離鑒定，樣品分離鑒定後須及時銷毀。樣品若需短期保存，可將樣品裝入塑料袋內，扎緊袋口，在袋上扎若干小孔（若為木段或者圓盤無需裝入塑料袋），放入4℃冰箱。若需較長時間保存，要定期在樣品上噴水保濕，保存時間不宜超過1個月。

（四）分離鑒定。

1.分離。採用貝爾曼漏鬥法或者淺盤法分離松材線蟲，分離時間一般需12小時以上。將分離液體收集到試管或者燒杯中，通過自然沉澱或者使用離心機處理後進行鑒定。

2.鑒定。

（1）常規顯微鏡形態鑒定。僅適用於雌雄成蟲，以雌成蟲為主。將製作好的玻片置於顯微鏡下觀察其形態，判別是否為松材線蟲。若分離的線蟲為幼蟲，需培養至成蟲後進行鑒定。

（2）分子檢測（適用於各蟲態）。採用PCR檢測技術判別是否為松材線蟲。

松材線蟲分離、培養、檢測鑒定的具體方法可參照國家標准《松材線蟲病檢疫技術規程（GB/T 23476）》進行。

其中，PCR檢測技術通常是通過松材線蟲自動化分子檢測系統來完成的，這是能准確無誤測出松材線蟲的一種方法。