電泳技術性質檢測方法

A. 常用的蛋白質電泳方法有哪些

聚丙烯醯胺凝膠電泳:這是一種活性電泳，可以分析混合樣品，並且可用特異檢測手段檢測目標物條帶。
SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳:最常用的變性電泳，可以用來測定蛋白質分子量。比層析法測定要好。

B. 電泳的結果檢測

對於不同的目的，應採用不同的檢測方法。用染料和生物大分子結合形成有色的復合物是電泳後檢測最常用的方法.
（七）聚丙烯醯胺凝膠電泳結果不正常現象和對策
1．指示劑前沿呈現兩邊向上或向下的現象。向上的「微笑」現象說明凝膠的不均勻冷卻，中間部分冷卻不好，所以導致凝膠中分子有不同的遷移率所致。這種情況在用較厚的凝膠以及垂直電泳中時常發生。向下的「皺眉」現象常常是由於垂直電泳時電泳槽的裝置不合適引起的，特別是當凝膠和玻璃板組成的「三明治」底部有氣泡或靠近隔片的凝膠聚合不完全便會產生這種現象。
2．「拖尾」現象是電泳中最常見的現象。這常常是由於樣品溶解不佳引起的，克服的辦法是在加樣前離心，選用合適的樣品緩沖液和凝膠緩沖液，加增溶輔助試劑。另一方法是降低凝膠濃度。
3．「紋理」現象常常是由於樣品中不溶顆粒引起的，克服辦法是增加溶解度和離心除去不溶性顆粒。
4．蛋白帶偏斜常常是由於濾紙條或電極放置不平行所引起的，或由於加樣位置偏斜而引起。
5．蛋白帶過寬，與鄰近蛋白泳道的蛋白帶相連，這是由於加樣量太多或加樣孔泄漏引起的。
6．蛋白帶模糊不清和分辨不佳是由於多種原因引起的。雖然梯度凝膠可以提高解析度，但與其他方法相比，常規聚丙烯醯胺凝膠電泳是解析度較低的方法。為了提高解析度，不要加過多的樣品，小體積樣品可給出窄帶。加樣後應立即電泳，以防止擴散。選擇合適的凝膠濃度，使組分得以充分的分離。通常靠近前沿的蛋白帶解析度不佳，所以應根據分子量與凝膠孔徑的關系，灌制足夠長度的凝膠，以使樣品不會走出前沿。樣品的蛋白水解作用也引起擴散而使解析度降低。水解作用通常發生在樣品准備的時候，系統中的內源性蛋白酶會水解樣品蛋白，如果在緩沖液中加蛋白酶抑制劑可以減少這種情況的發生。

C. 電泳法簡介

目錄

• 1 拼音
• 2 英文參考
• 3 紙電泳法
• 4 醋酸纖維素薄膜電泳法
• 5 叄、瓊脂鋒猜糖凝膠電泳法
• 6 聚丙烯醯胺凝膠電泳法
• 7 SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳法

1 拼音

diàn yǒng fǎ

2 英文參考

electrophoresis

電泳法，是指帶電荷的供試品（蛋白質、核苷酸等）在惰性支持介質（如紙、醋酸纖維素、瓊脂糖凝膠、聚丙烯醯胺凝膠等）中，於電場的作用下，向其對應的電極方向按各自的速度進行泳動，使組分分離成狹窄的區帶，用適宜的檢測方法記錄其電泳區帶圖譜或計算其百分含量的方法。

各電泳法，除另有規定外，照下述方法操作。

3 一、紙電泳法

1.儀器裝置

包括電泳室及直流電源兩部分。

常用的水平式電泳室裝置如圖，包括兩個電泳槽A和一個可以密封的玻璃(或相應材料)蓋B；兩側的電泳槽均用有機玻璃（或相應材料）板C分成兩部分；外格裝有鉑電極(直徑0.5～0.8cm)D；里格為可放濾紙E的有機玻璃電泳槽架F，此架可從槽中取出；兩側電泳槽A內的鉑電極D經隔離導線穿過槽壁與外接電泳儀電源相連。

電源為具有穩壓器的直流電源，常壓電泳一般在100～500V，高壓電泳一般在500～10 000V。

2. 操作法

(1) 電泳緩沖液

枸櫞酸鹽緩沖液(pH3.0)

取枸櫞酸 (C6H8O7·H2O)39.04g與枸櫞酸鈉(C6H5Na3O7·2H2O)4.12g，加水4000ml，使溶解。

(2) 濾紙

取色譜濾紙置1mol/L甲酸溶液中浸泡過夜，次日取出，用水漂洗至洗液的pH值不低於4,置60℃烘箱烘乾，備用。可按需要裁成長27cm、寬18cm的濾紙，或根據電泳室的大小裁剪，並在距長度方向一端5～8cm處劃一起始線，每隔2.5～3cm處做一記號備點樣用。

(3) 點樣 有濕點法和干點法。濕點法是將裁好的濾紙全部浸入枸櫞酸鹽緩沖液(pH3.0)中，濕潤後，取出，用濾紙吸干多餘的緩沖液，置電泳槽架上，使起始線靠近陰極端，將濾紙兩端浸入緩沖液中，然後用微量注射器精密點加供試品溶液，每點10μl,共3點，並留2個空白位置。

干點法是將供試品溶液點於濾紙上，吹乾、再點，反復數次，直至點完規定段沖量的供試品溶液，然後用噴霧器將濾紙噴濕，點樣處最後噴濕，本法適用於稀的供試品溶液。

(4) 電泳

於電泳槽中加入適量電泳緩沖液,浸沒鉑電極，接通電泳儀穩壓電源擋,調整電壓梯度為18～20V/cm，電泳約1小時45分握基殲鍾，取出,立即吹乾,置紫外光燈(254nm)下檢視，用鉛筆劃出紫色斑點的位置。

(5) 含量測定

剪下供試品斑點和與斑點位置面積相近的空白濾紙，剪成細條，分別置試管中，各精密加入0.01mol/L鹽酸溶液5ml，搖勻，放置1小時，用3號垂熔玻璃漏斗濾過，也可用自然沉降或離心法傾取上清液，按各葯品項下的規定測定吸收度，並按吸收系數計算含量。

4 二、醋酸纖維素薄膜電泳法

1.儀器裝置

電泳室及直流電源同紙電泳。

2.試劑

(1) 巴比妥緩沖液(pH8.6)取巴比妥2.76g，巴比妥鈉15.45g，加水溶解使成1000ml。

(2) 氨基黑染色液

取0.5g的氨基黑10B,溶於甲醇50ml、冰醋酸10ml及水40ml的混合液中。

(3) 漂洗液

取乙醇45ml、冰醋酸5ml及水50ml，混勻。

(4) 透明液

取冰醋酸25ml，加無水乙醇75ml，混勻。

3.操作法

(1) 醋酸纖維素薄膜

取醋酸纖維素薄膜，裁成2cm×8cm的膜條，將無光澤面向下，浸入巴比妥緩沖液(pH8.6)中,待完全浸透，取出夾於濾紙中，輕輕吸去多餘的緩沖液後,將膜條無光澤面向上,置電泳槽架上,經濾紙橋浸入巴比妥緩沖液(pH8.6)中。

(2) 點樣與電泳

於膜條上距負極端2cm處，條狀滴加蛋白含量約5％的供試品溶液2～3μl,在10～12V/cm電位梯度下電泳。電泳區帶距離以4～5cm為宜。

(3) 染色

電泳完畢，將膜條取下浸於氨基黑染色液中，2～3分鍾後，用漂洗液浸洗數次，直至脫去底色為止。

(4) 透明

將洗凈並完全乾後的膜條浸於透明液中10～15分鍾，取出平鋪於潔凈的玻板上，干後即成透明薄膜，可於分光光度計上測定和作標本長期保存。

(5) 含量測定

未經透明處理的醋酸纖維素薄膜電泳圖可按各葯品項下規定的方法測定，一般採用洗脫法或掃描法，測定各蛋白質組分的相對百分含量。

洗脫法

將洗凈的膜條用濾紙吸干，剪下供試品溶液各電泳圖譜的電泳區帶，分別浸於1.6％的氫氧化鈉溶液中，振搖數次，至洗脫完全， 於一定波長下測定吸收度。同時剪取與供試品膜條相應的無蛋白部位，同法操作作對照。先計算吸收值總和，再計算各蛋白組分所佔百分率。

掃描法

將乾燥的醋酸纖維素薄膜用色譜掃描儀通過反射 （未透明薄膜） 或透射（已透明薄膜）方式在記錄器上自動繪出各蛋白組分曲線圖，橫坐標為膜條的長度，縱坐標為吸收度，計算各蛋白組分的百分含量。亦可用微機處理積分計算。

5 叄、瓊脂糖凝膠電泳法

1.儀器裝置

電泳室及直流電源同紙電泳。

2.試劑

(1) 醋酸－鋰鹽緩沖液(pH3.0)

取冰醋酸50ml，加水800ml混合後，用氫氧化鋰調節pH至3.0，再加水至1000ml。

(2) 甲苯胺藍溶液

取甲苯胺藍0.1g，加水100ml使溶解。

3.操作法

(1)制膠

取瓊脂糖約0.2g，加水10ml，置水浴中加熱使溶脹完全,加溫熱的醋酸－鋰鹽緩沖液(pH3.0)10ml，混勻，趁熱將膠液塗布於大小適宜(2.5cm×7.5cm或4cm×9cm)的玻璃板上，厚度約3mm，靜置，待凝膠結成無氣泡的均勻薄層，即得。

(2) 標准品溶液及供試品溶液的制備

照各葯品項下規定配製。

(3) 點樣與電泳

在電泳槽內加入醋酸－鋰鹽緩沖液(pH3.0),將凝膠板置於電泳槽架上，經濾紙橋浸入緩沖液。於凝膠板負極端分別點樣1μl，立即接通電源，在電壓梯度約30V/cm，電流強度1～2mA/cm的條件下，電泳約20分鍾，關閉電源。

(4) 染色與脫色

取下凝膠板，用甲苯胺藍溶液染色，用水洗去多餘的染色液至背景無色為止。

6 四、聚丙烯醯胺凝膠電泳法

1.儀器裝置

通常由穩流電泳儀和圓盤或平板電泳槽組成。其電泳室有上、下兩槽,每個槽中都有固定的鉑電極，鉑電極經隔離電線接於電泳儀穩流擋上。

2.試劑

(1)溶液A

取叄羥甲基氨基甲烷36.6g，四甲基乙二胺0.23ml,加0.1mol/L鹽酸溶液48ml，再加水溶解並稀釋至100ml,置棕色瓶內，在冰箱中保存。

(2)溶液B

取丙烯醯胺30.0g、次甲基雙丙烯醯胺0.74g，加水溶解並稀釋至100ml,濾過，置棕色瓶內，在冰箱中保存。

(3)電極緩沖液(pH8.3)

取叄羥甲基氨基甲烷6g、甘氨酸28.8g,加水溶解並稀釋至1000ml，置冰箱中保存，用前稀釋10倍。

(4)溴酚藍指示液

取溴酚藍0.1g,加0.05mol/L氫氧化鈉溶液3.0ml與90％乙醇5ml,微熱使溶解，加20％乙醇製成250ml。

(5)染色液

取0.25％(W/V)考馬斯亮藍G<[250]>溶液2.5ml，加12.5％(W/V)叄氯醋酸溶液至10ml。

(6)稀染色液

取上述染色液2ml，加12.5％(W/V)叄氯醋酸溶液至10ml。

(7)脫色液

7％醋酸溶液。

3.操作法

(1)制膠

取溶液A2ml，溶液B5.4ml，加尿素2.9g使溶解，再加水4ml，混勻，抽氣趕去溶液中氣泡， 加0.56％過硫酸銨溶液2ml，混勻製成膠液，立即用裝有長針頭的注射器或細滴管將膠液沿管壁加至底端有橡皮塞的小玻璃管(10×0.5cm)中,使膠層高度達6～7cm, 然後徐徐滴加水少量，使覆蓋膠面，管底氣泡必須趕走，靜置約30分鍾，待出現明顯界面時即聚合完畢，吸去水層。

(2)標准品溶液及供試品溶液的制備

照各葯品項下的規定。

(3)電泳

將已制好的凝膠玻璃管裝入圓盤電泳槽內，每管加供試品或標准品溶液50～100μl，為防止擴散可加甘油或40％蔗糖溶液1～2滴及0.04％溴酚藍指示液1滴,也可直接在上槽緩沖液中加0.04％溴酚藍指示液數滴，玻璃管的上部用電極緩沖液充滿，上端接負極、下端接正極。調節起始電流使每管為1mA，數分鍾後，加大電流使每管為2～3mA，當溴酚藍指示液移至距玻璃管底部1cm處，關閉電源。

(4)染色和脫色

電泳完畢，用裝有長針頭並吸滿水的注射器,自膠管底部沿膠管壁將水壓入，膠條即從管內滑出，將膠條浸入稀染色液過夜或用染色液浸泡10～30分鍾，以水漂洗干凈，再用脫色液脫色至無蛋白區帶凝膠的底色透明為止。

(5)結果判斷

將膠條置燈下觀察，根據供試品與標准品的色帶位置和色澤深淺程度進行判斷。

相對遷移率 供試品和標准品的電泳區帶有時可用相對遷移率(R''<[m]>)進行比較。其計算式如下：

進膠端到供試品或標准品區帶的距離

相對遷移率(R''<[m]>)＝─────────────────

進膠端到溴酚藍區帶的距離

掃描

將清晰的膠條置雙波長薄層掃描儀或凝膠電泳掃描儀中掃描並積分，由各組分的峰面積計算百分含量。

7 五、SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳法

SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳測定蛋白分子量,是根據大多數蛋白都能與陽離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)按重量比結合成復合物,使蛋白分子所帶的負電荷遠遠超過天然蛋白分子的負電荷，消除了不同蛋白分子的電荷效應,使蛋白分子相對遷移率(R''<[m]>)的大小完全取決於分子量的高低，因此可從已知分子量的標准蛋白的對數和相對遷移率所作的標准曲線中求出供試品的分子量。

1.儀器裝置

除另有規定外，同聚丙烯醯胺凝膠電泳。

2.試劑

(1)丙烯醯胺液溶

稱取丙烯醯胺22.2g與雙丙烯醯胺0.6g， 溶於100ml水中，貯於褐色瓶中低溫保存。

(2) 凝膠緩沖液

稱取磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)8.82g 、磷酸氫二鈉(Na2HPO4 ·12H2O)51.55g與十二烷基硫酸鈉2.0g，加水至1000ml(若有沉澱析出,可加溫至37℃溶解)。

(3)電泳緩沖液

將凝膠緩沖液稀釋1倍。

(4)染色液

稱取25mg考馬斯亮藍R<[250]>,溶於57％乙醇與9.2％醋酸混合液100ml中。

(5)脫色液

取無水乙醇75ml，加冰醋酸50ml，用水稀釋至1000ml。

3.操作法

除下列規定外，其他均同聚丙烯醯胺凝膠電泳。

(1)制膠

用丙烯醯胺溶液－凝膠緩沖液－水－1.6％過硫酸銨溶液四甲基乙二胺(需冷卻)(10.1∶15.0∶3.4∶1.5∶0.045) 配製而成。

(2)標准蛋白溶液及供試品溶液的制備

取標准蛋白，加水製成每1ml中含2～5mg的溶液，與水解液(取尿素21.6g和十二烷基硫酸鈉0.04g，溶於40ml水中)1∶3混合，置冰箱中過夜。供試品照上述方法配製。

(3)電泳

調節電流使每管為8mA。

4.相對遷移率和分子量計算

將電泳脫色後的區帶用卡尺或用掃描定位法測量染料移動的距離、染色前膠條長度、蛋白移動距離和脫色後的膠條長度。按下式計算相對遷移率：

蛋白移動的距離染色前的膠條長度

相對遷移率(R''<[m]>)＝──────────×──────────

脫色後的膠條長度染料移動的前沿距離

D. 常見的電泳方法

實驗室中常見的電泳方法有以下幾種：
一、紙電泳
指用濾紙作為支持載體的電泳方法。是最早使用的區帶電泳。
將濾紙條水平地架設在兩個裝有緩沖溶液的容器之間，樣品點於濾紙中央。當濾紙條被緩沖液潤濕後，再蓋上絕緣密封罩，即可由電泳電源輸入直流電壓（100V～1000V）進行電泳。
二、醋酸纖維素薄膜電泳
電泳時經過膜的預處理、加樣、電泳、染色、脫色與透明即可得到滿意的分離效果。此電泳的特點是分離速度快、電泳時間短、樣品用量少。因此特別適合於病理情況下微量異常蛋白的檢測。
三、凝膠電泳
由區帶電泳中派生出的一種用凝膠物質作支持物進行電泳的方式。
凝膠電泳中的瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯醯胺凝膠電泳是普通電泳中應用最多的兩種形式。
目前，這種辦法被廣泛用來分析蛋白質和核酸。
四、等電聚焦電泳
1．等電聚焦電泳過程
一種利用有pH值梯度的介質，分離等電點不同的蛋白質的電泳技術。
在一個穩定連續的線性pH梯度的溶液（兩性載體電解質）中進行分離，每一種被分離的兩性物質都移向與它的等電點相一致的pH位置，在那裡不再移動（稱為聚焦）。
2．等電聚焦電泳的特點
使用兩性載體電解質，在電極之間形成穩定、連續、線性的pH梯度；
由於「聚焦效應」，即使很小的樣品也能獲得清晰、鮮明的區帶界面；
電泳速度快;解析度高;
加入樣品的位置可任意選擇；
可用於測定蛋白質類物質的等電點;
適用於中、大分子量（如蛋白質、肽類、同工酶等）生物組分的分離分析。
五、等速電泳
採用兩種不同濃度的電解質，一種為前導電解質，充滿整個毛細管柱；另一種為尾隨電解質，置於一端的電泳槽中。前導電解質的遷移率高於任何樣品組分，尾隨電解質則低於任何樣品組分，被分離的組分按其不同的遷移率夾在中間，在強電場的作用下，各被分離組分在前導電解質與尾隨電解質之間的空隙中移動，實現分離。
六、雙向凝膠電泳（二維電泳）
第一向採用等電聚焦 根據復雜的蛋白質成分中各個蛋白質的PI的不同，將蛋白質進行分離。
第二向採用了十二烷基硫酸鈉一聚丙烯醯胺凝膠電泳 （SDS-PAGE）就是按蛋白質分子量的大小使其在垂直方向進行分離。其結果不再是條帶狀，而是呈現為斑點狀。
七、免疫電泳
免疫電泳是瓊脂平板電泳和雙相免疫擴散兩種方法的結合。將抗原樣品在瓊脂平板上先進行電泳，使其中的各種成分因電泳遷移率的不同而彼此分開；然後加入抗體做雙相免疫擴散，把已分離的各抗原成分與抗體在瓊脂中擴散而相遇，在二者比例適當的地方，形成肉眼可見的沉澱弧。