葯敏檢測方法

『壹』 請問怎樣搞葯敏試驗

葯敏試驗
葯敏試驗根據美國臨床標准委員會（NCCLS）推薦的K-B瓊脂法進行，葯敏紙片選擇中國生物製品鑒定所葯敏紙片，試驗所選擇葯物必須包括下列抗生素：氨苄西林（AMP），阿莫西林/克拉維酸（AMC），頭孢噻吩（CFT），頭孢噻肟（CTX），慶大黴素（GEN），萘啶酸（NAL），環丙沙星（CIP），四環素（TBT），利福平（RFA），復方新諾明（SMZ）。葯敏結果判定標准按照NCCLs手冊2005版。
1. 操作方法：
（1）將待檢菌接種於普通營養瓊脂平板，37℃培養16～18小時，然後挑取普通營養瓊脂平板上的純培養菌落，懸於3ml生理鹽水中，混勻後與菌液比濁管比濁。以有黑字的白紙為背景，調整濁度與比濁管（0.5麥氏單位）相同。
（2）用無菌棉拭子蘸取菌液，在管壁上擠壓去掉多餘菌液。用棉拭子塗布整個M-H培養基表面，反復幾次，每次將平板旋轉60度，最後沿周邊繞兩圈，保證塗均勻。
（3）待平板上的水分被瓊脂完全吸收後再貼紙片。用無菌鑷子取葯敏紙片貼在平板表面，紙片一貼就不可再拿起。每個平板貼5張紙片，每張紙片間距不少於24mm，紙片中心距平皿邊緣不少於15mm。在菌接種後15分鍾內貼完紙片。
（4）將平板反轉，孵育18～24小時後取出，用游標卡尺測量抑菌圈直徑，從平板背面測量最接近的整數毫米數並記錄（附表6）。抑菌環的邊緣以肉眼見不到細菌明顯生長為限。有的菌株可出現蔓延生長，進入抑菌環，磺胺葯在抑菌環內出現輕微生長，這些都不作為抑菌環的邊緣。結果判斷依據鑒定所葯敏紙片判定標准。
（5）每次葯敏試驗必須用ATCC 25922大腸桿菌做質控。只有當質控菌株的抑菌圈直徑在允許范圍內測試菌株的結果才可以報告。ATCC 25922的結果必須與測試菌株同時記錄和報告在附表6中。
0.5麥氏比濁管配製方法：
0.048M BaCL2 (1.17% W/V BaCL2 . 2H2O) 0.5ml
0.36N H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml
將二液混合，置螺口試管中，放室溫暗處保存。用前混勻。有效期為6個月。

2. 注意事項：
(1) 制備MH瓊脂平板應用直徑90mm平皿，在水平的實驗台上傾注。瓊脂厚為4±0.5mm（約25-30ml培養基），瓊脂凝固後塑料包裝放4℃保存，在5日內用完，使用前應在37℃培養箱烤乾平皿表面水滴。傾注平皿前應用pH計測pH值是否正確(pH應為7.3)。pH過低會導致氨基糖苷類，大環內酯類失效，而青黴素活力增強。
(2) 葯敏紙片長期儲存應於－20℃，日常使用的小量紙片可放在4℃，但應至於含乾燥劑的密封容器內。使用時從低溫取出後,放置平衡到室溫後才可打開，用完後應立即將紙片放回冰箱內的密封容器內。 過期紙片不能使用, 應棄去。
(3) 不穩定葯物如亞胺培南, 頭孢克洛, 克拉維酸復合葯等, 應冷凍保存, 最好在-40 ℃以下。
(4) 保證質控菌株不變異的簡便方法，將新得到的凍干菌株接種含血的M-H平板復活。然後每株細菌接種10支高層瓊脂管，放置冰箱保存。每月取出一支，傳出細菌供常規用。待用剩至最後一支，可傳種在M-H平板上，再接種一批高層瓊脂管備用。如此可保證原始菌種永不接觸抗菌素。
3.質量控制
質量控制方法 是用與常規實驗相同的操作方法，測定質控菌株的抑菌環。應使用新鮮傳代的菌種。接種菌液的塗布方法等均同常規操作，測定的抗菌素種類也應與常規測定的種類相同。

『貳』 葯敏試驗的具體操作方法

1葯敏實驗操作步驟:在超潔凈工作台內，先將滅菌好的培養基做好標記，無菌取病料（即：肝臟、心臟組織）一小塊，輕輕在滅菌的培養基上塗布幾下（不要突破培養基），然後用接種環再密集劃線。然後，將制備好的葯敏片分別按標記好的位置貼在培養基的表面。記錄好培養皿的標記及葯敏片的順序。最後，將培養皿放入37℃恆溫箱中培養8—12小時即可。
2葯敏實驗結果觀察:培養好後會發現細菌再培養基上均勻分布，同時會看到葯敏片周圍有不同程度的抑菌圈。抑菌圈越大，說明該雞群對這種葯物越敏感；抑菌圈小或沒有抑菌圈，說明該雞群對這種葯物不敏感或已經產生了耐葯性。若在培養皿中出現一團一團的細菌時說明培養皿中有雜菌感染。

『叄』 葯敏試驗結果怎麼看

葯物敏感試驗簡稱葯敏試驗（或耐葯試驗）。旨在了解病原微生物對各種抗生素的敏感（或耐受）程度，以指導臨床合理選用抗生素葯物的微生物學試驗。
一種抗生素如果以很小的劑量便可抑制、殺滅致病菌，則稱該種致病菌對該抗生素「敏感」。反之，則稱為「不敏感」或「耐葯」。為了解致病菌對哪種抗菌素敏感，以合理用葯，減少盲目性，往往應進行葯敏試驗。其大致方法是：從病人的感染部位採取含致病菌的標本，接種在適當的培養基上，於一定條件下培養；同時將分別沾有一定量各種抗生素的紙片貼在培養基表面（或用不銹鋼圈，內放定量抗生素溶液），培養一定時間後觀察結果。由於致病菌對各種抗生素的敏感程度不同，在葯物紙片周圍便出現不同大小的抑制病菌生長而形成的「空圈」，稱為抑菌圈。抑菌圈大小與致病菌對各種抗生素的敏感程度成正比關系。於是可以根據試驗結果有針對性地選用抗生素。近年已有自動化的葯敏試驗儀器問世，使試驗更加迅速、准確。目前濫用抗生素，致使抗葯菌增加，甚至因長期大量使用廣譜抗生素，殺傷體內正常微生物，失去微生物的相互制約作用，從而使一些少見的或一般情況下的非致病菌大量繁殖，引起所謂「二次感染」的情況屢有發生，給治療造成人為的困難。因此，提倡使用葯敏試驗，堅持合理用葯十分重要。

『肆』 怎麼葯敏測試

一、 紙片擴散法 該法是將含有定量抗菌葯物的濾紙片貼在已接種了測試菌的瓊脂表面上，紙片中的葯物在瓊脂中擴散，隨著擴散距離的增加，抗菌葯物的濃度呈對數減少，從而在紙片的周圍形成濃度梯度。同時，紙片周圍抑菌濃度范圍內的菌株不能生長，二抑菌范圍外的菌株則可以生長，從而在紙片的周圍形成透明的抑菌圈，不同的抑菌葯物的抑菌圈直徑因受葯物在瓊脂中擴散速度的影響而可能不同，抑菌圈的大小可以反映測試菌對葯物的敏感程度，並與該葯物對測試菌的MIC呈負相關。 二、稀釋法 稀釋法葯敏試驗可用於定量測試抗菌葯物對某一細菌的體外活性，分為瓊脂稀釋法和肉湯稀釋法。實驗時，抗菌葯物的濃度通常經過倍比（lg2）稀釋，能抑制待測菌肉眼可見生長的最低葯物濃度成為最小抑菌濃度（MIC），一個特定抗菌葯物的測試濃度范圍應該包含能夠檢測細菌的解釋性折點（敏感、中介和耐葯）的濃度，同時也應該包含質控參考菌株的MIC. 2.1 瓊脂稀釋法 首先制備含抗菌葯物的瓊脂稀釋平板。再接種待測菌株，然後是結果判讀。 2.2 肉湯稀釋法 三、抗生素濃度梯度法 四、自動化儀器法

『伍』 如何進行抗生素葯敏試驗

你好！
葯敏試驗
葯敏試驗根據美國臨床標准委員會（NCCLS）推薦的K-B瓊脂法進行，葯敏紙片選擇中國生物製品鑒定所葯敏紙片，試驗所選擇葯物必須包括下列抗生素：氨苄西林（AMP），阿莫西林/克拉維酸（AMC），頭孢噻吩（CFT），頭孢噻肟（CTX），慶大黴素（GEN），萘啶酸（NAL），環丙沙星（CIP），四環素（TBT），利福平（RFA），復方新諾明（SMZ）。葯敏結果判定標准按照NCCLs手冊2005版。
1. 操作方法：
（1）將待檢菌接種於普通營養瓊脂平板，37℃培養16～18小時，然後挑取普通營養瓊脂平板上的純培養菌落，懸於3ml生理鹽水中，混勻後與菌液比濁管比濁。以有黑字的白紙為背景，調整濁度與比濁管（0.5麥氏單位）相同。
（2）用無菌棉拭子蘸取菌液，在管壁上擠壓去掉多餘菌液。用棉拭子塗布整個M-H培養基表面，反復幾次，每次將平板旋轉60度，最後沿周邊繞兩圈，保證塗均勻。
（3）待平板上的水分被瓊脂完全吸收後再貼紙片。用無菌鑷子取葯敏紙片貼在平板表面，紙片一貼就不可再拿起。每個平板貼5張紙片，每張紙片間距不少於24mm，紙片中心距平皿邊緣不少於15mm。在菌接種後15分鍾內貼完紙片。
（4）將平板反轉，孵育18～24小時後取出，用游標卡尺測量抑菌圈直徑，從平板背面測量最接近的整數毫米數並記錄（附表6）。抑菌環的邊緣以肉眼見不到細菌明顯生長為限。有的菌株可出現蔓延生長，進入抑菌環，磺胺葯在抑菌環內出現輕微生長，這些都不作為抑菌環的邊緣。結果判斷依據鑒定所葯敏紙片判定標准。
（5）每次葯敏試驗必須用ATCC 25922大腸桿菌做質控。只有當質控菌株的抑菌圈直徑在允許范圍內測試菌株的結果才可以報告。ATCC 25922的結果必須與測試菌株同時記錄和報告在附表6中。
0.5麥氏比濁管配製方法：
0.048M BaCL2 (1.17% W/V BaCL2 . 2H2O) 0.5ml
0.36N H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml
將二液混合，置螺口試管中，放室溫暗處保存。用前混勻。有效期為6個月。

2. 注意事項：
(1) 制備MH瓊脂平板應用直徑90mm平皿，在水平的實驗台上傾注。瓊脂厚為4±0.5mm（約25-30ml培養基），瓊脂凝固後塑料包裝放4℃保存，在5日內用完，使用前應在37℃培養箱烤乾平皿表面水滴。傾注平皿前應用pH計測pH值是否正確(pH應為7.3)。pH過低會導致氨基糖苷類，大環內酯類失效，而青黴素活力增強。
(2) 葯敏紙片長期儲存應於－20℃，日常使用的小量紙片可放在4℃，但應至於含乾燥劑的密封容器內。使用時從低溫取出後,放置平衡到室溫後才可打開，用完後應立即將紙片放回冰箱內的密封容器內。 過期紙片不能使用, 應棄去。
(3) 不穩定葯物如亞胺培南, 頭孢克洛, 克拉維酸復合葯等, 應冷凍保存, 最好在-40 ℃以下。
(4) 保證質控菌株不變異的簡便方法，將新得到的凍干菌株接種含血的M-H平板復活。然後每株細菌接種10支高層瓊脂管，放置冰箱保存。每月取出一支，傳出細菌供常規用。待用剩至最後一支，可傳種在M-H平板上，再接種一批高層瓊脂管備用。如此可保證原始菌種永不接觸抗菌素。
3.質量控制
質量控制方法 是用與常規實驗相同的操作方法，測定質控菌株的抑菌環。應使用新鮮傳代的菌種。接種菌液的塗布方法等均同常規操作，測定的抗菌素種類也應與常規測定的種類相同。

『陸』 如何做葯敏試驗

用葯敏實驗進行葯物敏感度的測定，以便准確有效的利用葯物進行治療。但由於葯敏試驗要求比較嚴格，條件比較高，僅僅在大中專院校或科研單位有條件的可以操作，一些養殖廠或一些門診難有條件進行葯敏試驗的操作。針對這個問題，農業部動物檢疫所青島易邦生物工程有限公司動物疫病診療中心經過幾年的總結和實踐，逐漸總結出幾套適合基層進行葯敏試驗的操作方法。目前，臨床微生物實驗室進行葯敏試驗的方法主要有紙片擴散法，稀釋法（包括瓊脂和肉湯稀釋法），抗生素濃度梯度法（E-test法），和自動化儀器等。
紙片擴散法
該法是將含有定量抗菌葯物的濾紙片貼在已接種了測試菌的瓊脂表面上，紙片中的葯物在瓊脂中擴散，隨著擴散距離的增加，抗菌葯物的濃度呈對數減少，從而在紙片的周圍形成濃度梯度。同時，紙片周圍抑菌濃度范圍內的菌株不能生長，而抑菌范圍外的菌株則可以生長，從而在紙片的周圍形成透明的抑菌圈，不同的抑菌葯物的抑菌圈直徑因受葯物在瓊脂中擴散速度的影響而可能不同，抑菌圈的大小可以反映測試菌對葯物的敏感程度，並與該葯物對測試菌的MIC呈負相關。
稀釋法
稀釋法葯敏試驗可用於定量測試抗菌葯物對某一細菌的體外活性，分為瓊脂稀釋法和肉湯稀釋法。實驗時，抗菌葯物的濃度通常經過倍比（lg2）稀釋，能抑制待測菌肉眼可見生長的最低葯物濃度成為最小抑菌濃度（MIC），一個特定抗菌葯物的測試濃度范圍應該包含能夠檢測細菌的解釋性折點（敏感、中介和耐葯）的濃度，同時也應該包含質控參考菌株的MIC.

『柒』 怎樣做葯物敏感試驗

測定細菌對抗菌葯物敏感性的試驗稱為葯物敏感試驗或簡稱葯敏試驗。由於養雞業中抗菌葯物的廣泛使用，導致抗葯菌株越來越多，盲目用葯常常效果不佳。因此，進行葯物敏感試驗已成為正確使用抗菌葯物的必要手段。葯物敏感試驗的方法有多種，如紙片擴散法、試管法、挖洞法等。其中，紙片擴散法簡便易行，出結果快，是目前生產中最常見的方法，現將該種方法介紹如下：

（1）葯敏紙片的准備

常用抗菌葯敏紙片已有商品供應，一般可以買到，可直接利用。

（2）葯敏培養基的制備

①普通肉湯瓊脂：又稱營養瓊脂。蛋白腖10克、氯化鈉（NaCl）15克、磷酸氫二鉀（K₂HPO₄）1克、瓊脂20克、牛肉浸出液1000毫升（可用牛肉浸膏10克浸於1000毫升蒸餾水代替）。

牛肉浸出液的配製方法：取瘦牛肉去掉脂肪、腱膜等，絞碎或切碎，按500克牛肉加1000毫升蒸餾水混合，置4℃冰箱內過夜，取出後加熱到80～90℃，經1小時後，以數層紗布濾除肉渣並擠出肉水，再用脫脂棉過濾，量其體積並用蒸餾水補足1000毫升，分裝後20分鍾高壓蒸汽滅菌，即製成牛肉浸出液。

將以上其他成分加入到牛肉浸出液中，加熱溶解，冷卻後調pH至7.6，煮沸10分鍾，用濾紙過濾後分裝，再以10.4萬帕高壓蒸汽滅菌25分鍾，取出後冷卻至55℃左右，在90毫升直徑滅菌的平皿上傾注成4毫米厚的平板。做好的平板，密封包裝後可在冰箱中保存2～3周。使用前應將平皿置37℃溫箱中培養24小時，確認無菌後再用於試驗。

②鮮血瓊脂：將滅菌的營養瓊脂加熱融化，至45～50℃時加入無菌鮮血5%（每100毫升營養瓊脂中加入鮮血5～6毫升）傾注平皿。無菌鮮血，用無菌手術取健康動物（綿羊或家兔等）的血液，加入盛有無菌5%檸檬酸鈉溶液的容器中（血與5%檸檬酸鈉的比例為9∶1）混勻，置冰箱中保存備用。

（3）試驗方法

臨床上分離到的細菌進行純培養。用滅菌的接種環挑取被檢菌的純培養物劃線或塗布於平板上，並盡可能使其密而均勻。用滅菌鑷子將葯敏紙片平放於平板上並輕壓使其緊貼平板。直徑9.0厘米的平皿可貼7張紙片，紙片間距不少於24毫米，紙片與平皿邊緣距離不少於15毫米。貼好後將平板底部朝上置於37℃溫箱中培養24小時，取出觀察結果。

（4）結果判定

凡對被檢菌有抑制力的抗菌葯物，由於向周圍擴散，抑制細菌的生長，故在紙片周圍出現一個無細菌生長的圓圈，稱為抑菌圈。抑菌圈越大，說明該菌對此種葯物敏感度越高，反之越低。如果無抑菌圈，則說明該菌對此種葯物具有耐葯性。所以，判定結果時，以抑菌圈直徑的大小來作為細菌對該葯物敏感度高低的標准。

一般來說，抑菌圈直徑70毫米以上為極度敏感，15～20毫米為高度敏感，10～15毫米為中度敏感，10毫米以下為低敏感，無抑菌圈為不敏感。對多黏菌素的作用，抑菌圈在10毫米以上者為高度敏感，6～9毫米為低度敏感。

經葯敏試驗後，應該選擇極度敏感或高度敏感的葯物進行治療。

『捌』 葯敏試驗的實驗步驟

普通營養瓊脂培養基：可去生化試劑店購買，做不同細菌的葯敏試驗可選擇不同的培養基，如做大腸桿菌的葯敏試驗可選擇普通營養瓊脂或麥糠凱培養基。做沙門氏菌可選擇血清培養基。
葯敏試紙：購買或自製（詳見實驗准備）
細菌：待做葯敏試驗的細菌
儀器：接種環、酒精燈、打孔器、牛津杯、移液器、滴頭 2.1葯敏片的准備：購買或自製
2.1.1制備方法：取新華1號定性濾紙，用打孔機打成6毫米直徑的圓形小紙片。取圓紙片50片放入清潔乾燥的青黴素空瓶中，瓶口以單層牛皮紙包紮。經15磅15-20分鍾高壓消毒後，放在37℃溫箱或烘箱中數天，使完全乾燥。
2.1.2抗菌葯紙片製作：在上述含有50片紙片的青黴素瓶內加入葯液0.25毫升，並翻動紙片，使各紙片充分浸透葯液，翻動紙片時不能將紙片搗爛。同時在瓶口上記錄葯物名稱，放37℃溫箱內過夜，乾燥後即密蓋，如有條件可真空乾燥。切勿受潮，置陰暗乾燥處存放，有效期3-6個月。
2.2葯液的制備（用於商品葯的試驗）：按商品葯的使用治療量的比例配製葯液；如商品葯百病消按其說明量治療量0.01%飲水，可按這個比例配製葯液，可取10毫克加入10毫升的水中混勻。此稀釋液即為用於做葯敏試驗的葯液。 3.1葯敏片法
3.1.1在「超凈台」中，用經（酒精燈）火焰滅菌的接種環挑取適量細菌培養物，以劃線方式將細菌塗布到平皿培養基上。具體方式；用滅菌接種環取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點塗菌，以每點開始劃線塗菌至平皿的1/2。然後，找到第二點劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細菌均勻密布於平皿。（另：可挑取待試細菌於少量生理鹽水中製成細菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液塗布於平皿培養基表面。要求塗布均勻緻密，直接懸液法要把菌液濃度用生理鹽水或PBS調到0.5個麥氏標准再塗布均勻。）
3.1.2將鑷子於酒精燈火焰滅菌後略停，取葯敏片貼到平皿培養基表面。為了使葯敏片與培養基緊密相貼，可用鑷子輕按幾下葯敏片。為了使能准確的觀察結果，要求葯敏片能有規律的分布於平皿培養基上；一般可在平皿中央貼一片，外周可等距離貼若乾片（外周一般可貼七片），每種葯敏片的名稱要記住。
3.1.3將平皿培養基置於37℃溫箱中培養24小時後，觀察效果。
3.2牛津杯法
3.2.1在「超凈台」中，用經（酒精燈）火焰滅菌的接種環挑取適量細菌培養物，以劃線方式將細菌塗布到平皿培養基上。具體方式；用滅菌接種環取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點塗菌，以每點開始劃線塗菌至平皿的1/2。然後，找到第二點劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細菌均勻密布於平皿。（另：可挑取待試細菌於少量生理鹽水中製成細菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液塗布於平皿培養基表面。要求塗布均勻緻密。）
3.2.2以無菌操作將滅菌的不銹鋼小管（內徑6nm、外徑8nm、高10nm的圓形小管，管的兩端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培養基上，輕輕加壓，使其與培養基接觸無空隙，並在小管處標記各種葯物名稱。每個平板可放4-6支小管。待分鍾後，分別向各小管中滴加一定數量的各種葯液，勿使其外溢。置37℃培養8-18小時，觀察結果。
3.2.3將平皿培養基置於37℃溫箱中培養24小時後，觀察效果。
3.3打孔法：
該法較簡單，成本低，易操作，比較適用於商品葯物的檢測。
3.3.1在「超凈台」中，用經（酒精燈）火焰滅菌的接種環挑取適量細菌培養物，以劃線方式將細菌塗布到平皿培養基上。具體方式；用滅菌接種環取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點塗菌，以每點開始劃線塗菌至平皿的1/2。然後，找到第二點劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細菌均勻密布於平皿。（另：可挑取待試細菌於少量生理鹽水中製成細菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液塗布於平皿培養基表面。要求塗布均勻緻密。）
3.3.2以無菌操作將滅菌的不銹鋼小管（外徑為4毫米、孔徑與孔距均為3毫米，管的兩端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培養基上打孔，將孔中的培養基用針頭挑出，並以火焰封底，使培養基能充分的與平皿融合（以防葯液滲漏，影響結果）。
3.3.3加樣：按不同葯液加樣，樣品加至滿而不溢為止。
3.3.4將平皿培養基置於37℃溫箱中培養24小時後，觀察效果。

『玖』 葯敏試驗怎麼做

皮試

『拾』 葯敏試驗的判定標准

一、葯敏實驗的結果，應按抑菌圈直徑大小作為判定敏感度高低的標准。
表1葯物敏感實驗判定標准 抑菌圈直徑（毫米） 敏感度 20以上 極敏 15~20 高敏 10~14 中敏 10以下 低敏 0 不敏 具體對於不同的菌株，及不同的抗生素紙片需參照NCCLs的標准或者CLSI標准。
二、葯物敏感實驗判定標准參考表1，多黏菌素抑菌圈；在9毫米以上為高敏，6—9毫米為低敏，無抑菌圈為不敏。