常用葯敏檢測方法

⑴ 什麼是進行葯物敏感試驗的基礎

1 概述

測定細菌在體外抗菌葯物敏感性（以下稱葯敏試驗）的試驗方法很多。

絕大多數臨床實驗室以瓊脂擴散法作為常規方法測定常見的快速生長的病原菌。

本文介紹的是標准紙片擴散法。

本文提出的一系列建議有助於葯敏試驗的標准化。

具體地敘述了現行推薦方法的操作步驟，及其適應性和局槐慧限性。

本文還重溫了國際協作研究會（ICS）的有關建議和食品葯物管理局（FDA）的有關規定，並採納了其中的有關章節。

只根據是否出現抑菌環而不考慮其大小來判斷細菌對抗菌葯物敏感性的試驗方法，結果是不準確的。

紙片擴散法試驗必須遵循標準的方法學原理，並根據抑菌環與最低抑菌濃度的相關性，並結合臨床上已知敏感或耐葯菌株的狀況進行標准化，結果才能可靠。

要得到可靠結果，必須嚴格地按照本文鉛薯答的方法進行操作。

美國臨床實驗室標准化委員會（NCCLS）下設的紙片擴散法葯敏試驗分委員會推薦的標准方法，以Bauer等介紹的方法為基礎，是目前敘述最完整的試驗方法。

其中的解釋標準是綜合臨床和實驗室的數據發展而來，並得到證實。

本文介紹的是現行紙片擴散法葯敏試驗的操作、質量控制以及解釋標准。

當發現新問題並有所改進時，將並入新版本，以非正式文件補充發布。

紙片法抗菌葯物敏感實驗操作標准

2 做葯敏試驗的指證

任何細菌引起的感染均需要治療。

如果依細菌的種類不能預知其敏感性，就應做葯敏試驗。

通常，鑒定和葯敏試驗是同時進行的。

當致病菌屬於一種對一般常用抗菌葯物耐葯的細菌，最需要做葯敏試驗。

細菌耐葯機制包括：產生滅活葯物的酶，葯物耙位改變，或葯物進入細胞的方式發生變化。

有些細菌的抗菌葯物敏感性可以預知。

當感染由一種對某高效抗菌葯物敏感的細菌引起時，就不必做葯敏試驗（如，化膿性鏈球手察菌對青黴素專性敏感）。

但對青黴素過敏的病人，分離出的化膿性鏈球菌也許要測一下紅黴素和四環素的敏感性，以便發現有無耐葯性。

細菌耐葯性流行病學研究及新抗菌葯物的研究也需要做葯敏試驗。

做葯敏試驗，應從分離平板上挑選各種疑為致病菌的單個菌落，同時做菌種鑒定。

不同菌種不可在同一平板上做混合細菌葯敏試驗。

一般避免用臨床標本（如無菌體液和尿液）直接做葯敏，除非臨床上急需且革蘭氏染色只見到單一菌種，但隨後應再以標准方法重做。

對感染性質不同，標本中混有渾濁細菌或正常菌群的情況，其中的細菌也許與感染治療關系不大，常不必做葯敏，不然反會招致錯誤的引導。

3 常規測定葯物的選擇

要測定和報告給哪些葯物，須與感染科醫生、醫院的葯品委員會及感染控制委員會協商，然後由實驗室制定最合適的方案。

表1和表1A列出了治療各類細菌感染有效的葯物，其體外葯敏試驗結果也有助於感染的控制及流行病學研究。

3.1 常規報告

表1和表1A列出的抗菌葯物是我們目前認為比較適合的。

選葯時做了多方面考慮，包括微生物學、臨床葯理學因素及美國FDA認可的臨床適用性和療效。

為了避免誤導，給臨床醫生的報告應只包括治療上有用的葯物，如表1和表1A。

根據情況需要，可在此基礎上增減。

為了積累分類學和流行病學資料也可選擇用於治療以外的葯物，但結果僅限於實驗室內的感染控制醫生或醫院感染流行學專家用，不可報給臨床醫生。

3.2 使用認可的名稱

所有抗菌葯物均採用官方認可的名稱以避免混淆。

為了強調大多數現用抗生素之間的關系，按葯物的種類分組如下：

3.2.1 β－內醯胺類 所有β－內醯胺類葯物都具有相同的中央β－內醯胺環結構，並以抑制細胞壁合成為主要作用機理。

β－內醯胺環上的取代環結構或取代基決定了葯物屬於青黴素類、頭孢烯類、碳頭孢烯類、碳青黴烯類或單環類。

3.2.1.1 青黴素類 青黴素主要針對不產β－內醯胺酶的革蘭氏陽性菌和某些嬌嫩革蘭氏陰性菌。

醯胺類青黴素（氨苄西林和阿莫西林）和醯脲基青黴素（美洛西林和哌拉西林）對革蘭氏陰性菌的抗菌范圍更大，對很多假單胞菌有效。

耐青黴素酶的青黴素（氯唑西林、雙氯西林、假氧西林、乙氧西林和苯唑西林）主要針對革蘭氏陽性菌如產青黴素酶的葡萄球菌。

3.2.1.2 β－內醯胺類/β－內醯胺酶抑制合劑類 這類葯物由一種青黴素和一種抗菌活性小但可抑制某些β－內醯胺酶作用的物質組成合劑。

目前使用的抑制劑有三種：棒酸、舒巴坦和他唑巴坦。

合劑的抗菌效果不可僅靠合劑中青黴素葯敏試驗的結果預測。

3.2.1.3 頭孢烯類（包括頭孢菌素類）

3.2.1.4 碳青黴烯類 碳青黴烯類葯物在結構上與青黴素稍有不同，對β－內醯胺酶有更強抗水解力，對革蘭氏陽性和陰性菌的抗菌譜更廣。

3.2.1.5 單環類 單環類結構獨特，僅對須氧革蘭氏陰性菌有作用。

目前，氨曲南是美國FDA唯一通過的單環類葯物。

3.2.2 粘肽類 粘肽類化學結構復雜，主要抑制細胞壁合成，但作用位點不同於β－內醯胺類。

這類葯物主要針對革蘭氏陽性菌。

萬古黴素主要用於治療對青黴素過敏病人的革蘭氏陽性菌感染。

還用於治療β－內醯胺類葯物耐葯的革蘭氏陽性菌，如MSRA和某些腸球菌。

3.2.3 氨基糖苷類 這類葯物結構類似，在核糖體水平抑制蛋白質合成。

由於對氨基糖苷滅活酶的耐受性的差異，不同葯物的抗菌譜也有所不同。

此類葯物主要治療須氧革蘭氏陽性菌感染，或主要作用於細胞壁的抗生素聯合治療某些耐葯革蘭氏陽性菌，如腸球菌。

3.2.4 大環內脂類 此類葯物結構相似，在核糖體水平抑制蛋白質的合成。

此類中僅有幾種現仍用於測試革蘭氏陽性菌或柔嫩革蘭氏陽性菌。

3.2.5 四環素類 此類葯物在核糖體水平抑制某些革蘭氏陽性和陰性菌的蛋白質合成。

此類葯物極為相似，少有例外，常規測四環素即可。

3.2.6 喹諾酮類 此類葯物結構相似，主要是抑制許多革蘭氏陽性菌和陰性菌的DNA螺旋酶活性。

各葯的抗菌譜不完全一致，應分別測定。

3.2.7 磺胺類和甲氧苄氨嘧啶（TMP） 此類葯物包括幾種化療制劑，抗菌譜相同，可抑制細菌的葉酸代謝。

磺胺甲基異惡唑最常用，主要用於治療尿路感染。

葯敏試驗可選此葯。

磺胺甲基異惡唑常與TMP合用，它們分別在革蘭氏陽性菌和陰性菌葉酸代謝的兩個步驟中起抑製作用。

3.2.8 其他葯物 氯黴素、克拉黴素和利福平均是抑制蛋白質合成，但彼此在結構上沒有關系，均需作體外測試。

呋喃妥因在核糖體水平抑制蛋白質合成，此葯在體液中濃度極低，通常只用於泌尿系感染。

3.3 選葯指南

為使常規葯敏試驗合理，應限制測定葯物的數量。

表1和表1A足以滿足大多數臨床實驗室常規工作的需要。

該表按特定菌或菌群分若干組，將各種抗生素擇優次序排列，供常規實驗室選擇。

表中每格列的一組相似抗生素，療效相似，不必重復選擇。

以「或」相連的葯物，抗菌譜類似，表現為交叉耐葯。

因此，每格（一類或相關組）中的葯物只需選擇一種。

一般，每種葯物的葯敏結果必須經過測定後才能報告，個別情況可以根據另外的葯物的結果推測（如葡萄球菌對頭孢類的結果可根據苯唑西林的結果推測）。

選擇的葯物應與醫院常用葯物吻合。

3.4 常規報告和選擇性報告的原則

如表1和表1A所列，屬於A組的葯物，是常規首選葯物，對每一特定的菌類應做相應的報告。

B組包括了臨床上重要的葯物，特別是對院內感染，應該作為首選葯。

但是，報告是有條件的：只有當A組中同類葯物不敏感時才報告。

其他情況還有：特定的標本（如CSF中分離的腸桿菌應測三代頭孢菌素，或泌尿系菌株測TMP/SMZ）；混合感染；多部位感染；葯物敏感，明顯副作用，或對A組葯物治療失敗；為控制感染收集流行病學指標等。

C組包括替代或後備葯物，其適用的情況包括：治療某些地方或流行性疾病，或對首選葯物（特別是同類葯，如β－內醯胺類或氨基糖苷類葯物）多重耐葯的菌株；治療對首選葯物過敏的病人；治療不常見的菌種（如氯黴素治療沙門氏菌或某些假單胞菌）以及為控制感染收集流行病學資料（如產桿菌測氯黴素和卡那黴素）的等。

D組包括僅限於泌尿系感染使用的葯物（如呋喃妥因和有機酸類），其他部位感染的細菌無需測定。

每個實驗室都應決定哪些葯物（表1和表1A）作為常規（A組）報告，哪些只是作為選擇性報告（B組）報告，這需要與傳染科醫生、葯品委員會及醫院感染控制委員會成員共同商討。

選擇性報告須有助於對該報告的理解，並促進降低由於濫用抗菌葯物所造成的耐葯菌增加。

雖然B組葯物的試驗結果不作為常規報告，但是，一旦臨床需要應該及時提供，或者對特定的標本作為常規報告。

異常耐葯應該報告，如對二線葯物耐葯但對一線葯物敏感的現象。

4.0 試劑

4.1 Mueller-Hinton瓊脂

在現有的許多培養基中，我們認為Mueller-Hinton瓊脂最適合於常規敏感試驗，理由是：（1）產品批間試驗結果重復性好；（2）磺胺、甲氧苄氨嘧啶、四環素的抑制物含量低；（3）絕大多數致病菌生長較好；（4）大量有關敏感試驗的數據是由此培養基得出的。

盡管Mueller-Hinton瓊脂通常是可靠的，但是偶然產品也有批間差。

如果一批培養基不能很好地保證細菌生長，抑菌環則增大，超出質控范圍，造成錯誤結果。

只有按NCCLS M6-P做過試驗並符合規定的培養基才能使用。

4.1.1 制備Mueller-Hinton瓊脂

制備Mueller-Hinton瓊脂的步驟如下：（1）按產品說明用乾粉培養基制備；（2）高壓滅菌後立即放40－50℃水浴；（3）平皿置水平台上，新制備的培養基待涼後倒平板，瓊脂厚度為4mm。

內徑14cm的平皿需要培養基約60－70ml，內徑9cm平皿約需25－30ml。

玻璃或塑料平皿均可使用，但平皿底應平坦；（4）待平板冷至室溫，留下當日使用的，其他放入冰箱（2－8℃）保存；（5）平板許在7日內用完。

如用塑料袋包裹，水份不蒸發的可適當延長使用期。

過期培養基須以質控菌株按4.3節介紹的方法測定，合格者方可使用；（6）每批制備的平板，應抽樣30－35℃ 24小時以上，檢查是否無菌。

抽樣的平板不可再用。

4.1.2 pH值

每批Mueller-Hinton瓊脂，制備時應檢查pH值。

檢查方法依實驗室所具備的設備條件。

培養基的pH值室溫下應為7.2-7.4，測pH值應在瓊脂凝固後進行。

如果pH值偏低，某些葯的活性會下降（如氨基糖苷類和大環內脂類），另一些葯的活性可能會增強（如青黴素類）；如果pH值偏高，效果相反。

pH值測定方法有：（1）將pH電極浸入融化的瓊脂培養基中；（2）瓊脂放入燒杯中融化，然後使其凝固在pH電極上；（3）使用平面電極。

4.1.3 水份

使用前，瓊脂平板表面如有水份，須放恆溫箱（35℃），恆溫箱門半開，使水份蒸發（10－30分鍾）。

瓊脂表面應潮濕，但不應有水珠。

培養時，平皿蓋上也不應有水珠。

4.1.4 胸腺嘧啶核苷和胸腺嘧啶的作用

如培養基含有過量的胸腺嘧啶核苷和胸腺嘧啶，磺胺葯和甲氧苄氨嘧啶的活力被抵消，則抑菌環較小或不清楚，甚至無抑菌環，導致假耐葯的報告。

購買培養基時，應注意挑選無胸腺嘧啶核苷的Mueller-Hinton瓊脂。

可以用標準的質控菌株糞腸球菌ATCC29212或33186測試復方磺胺的紙片，評價新批號的Mueller-Hinton瓊脂。

培養基上出現直徑大於20mm的抑菌環為合格。

不合格的培養基上不出現抑菌環、環內有細菌生長或抑菌環小於20mm。

4.1.5 二價離子的影響

二價離子，主要是鎂和鈣離子，影響四環素、多粘菌素、氨基糖苷類葯物對綠膿假單胞菌的測定結果。

陽離子過量抑菌環變小，濃度過低抑菌環增大。

鋅離子可影響羧基青黴素的結果。

每批培養基都應測試，看是否符合表3的質量控制要求。

應細致觀察質控菌株的測定結果，觀察是否有由培養基引起的誤差。

4.1.6 被測菌株生長不好的解決辦法

只有能夠在未強化的Mueller-Hinton瓊脂培養基上生長良好的須氧菌或兼性厭氧菌才能在此培養基上做葯敏試驗。

某些嬌嫩細菌，如嗜血桿菌、淋病奈瑟氏菌、肺炎鏈球菌、草綠色鏈球菌、β溶血鏈球菌在未強化的Mueller-Hinton瓊脂培養基上生長不良。

這類細菌，需用經強化或另外的培養基，具體做法見第六節。

（另見表4）

4.2 葯敏紙片的保存

葯敏紙片應注意保存在乾燥環境。

按下法保存：（1）在8℃以下保存，或－14℃以下冷凍保存。

β－內醯胺類葯的紙片應密封冷凍保存，僅取少量作為日常使用，在冰箱里保存約一周。

有些不穩定的抗生素（如頭孢拉定、棒酸合劑）須冷凍保存，用時取出；（2）紙片應在使用前1－2小時從冰箱取出，暖至室溫再打開，以避免出現冷凝水；（3）紙片啟封後應放入可密封的有乾燥劑的容器中；（4）紙片只能在有效期內使用，過期應棄去。

4.3 標准比濁管

用硫酸鋇比濁管（0.5麥氏比濁標准），標定接種菌液濃度。

比濁管制備方法如下：（1）0.048mol/L BaCl2，（1.175% w/v BaCl2·2H2O）0.5ml，加到99.5ml的0.18 mol/L（0.36N）H2SO4（1％v/v）溶液中，製成比濁管；（2）用光徑為1cm的分光光度計測定光吸收來標定比濁管。

0.5麥氏標准比濁管在625nm波長的吸收光度應為0.08-0.1；（3）選管徑與制備菌液試管相同的螺口試管，每管分裝4－6ml；（4）將試管帽擰緊，放室溫暗處保存；（5）用前，將比濁管在旋轉振盪器上混勻。

如出現大顆粒，應更換；（6）每個月更換比濁管或復檢比濁管的濁度。

5 操作步驟

5.1 制備接種菌液

5.1.1 增菌法 步驟如下：（1）選瓊脂平板上形態相同的菌落至少4－5個，用接種環挑其頂部，移至4－5ml肉湯或大豆酪蛋白消化液中；（2）置35℃培養至菌液濃度達到或超過比濁管濃度（一般需2－6小時），濃度約1－2×108CFU/ml；（3）用生理鹽水或肉湯校正菌液濃度，與比濁管相同。

可用光電比濁。

目測比濁須在適當光照下以黑色線條為反襯。

5.1.2 直接菌懸液法 步驟如下：（1）做常規葯敏試驗，可直接用過夜培養的菌落（必須用無選擇性培養基平板，如普通瓊脂培養基）在鹽水或肉湯中制備接種菌液。

菌液濃度調至0.5麥氏管；(2)此法適用於在肉湯培養基中生長不好的細菌如嗜血桿菌、淋病奈瑟氏菌和鏈球菌及葡萄球菌的甲氧苯青黴素或苯唑青黴素的耐葯試驗；（3）當用此法做復方磺胺葯的試驗時，從平板上直接挑菌落時會攜帶相當量的拮抗劑，造成敏感菌株的抑菌環內出現輕微的生長菌膜。

5.2 接種平板 步驟如下：（1）校正的菌液須在15分鍾內使用。

用一無菌棉試子蘸取菌液並在上端管壁旋轉擠壓幾次，去掉過多的菌液；（2）用試子塗布整個瓊脂平板表面，反復塗布幾次，每次將平皿旋轉60度，保證塗布均勻。

（3）將平皿蓋打開3－5分鍾，使培養基表面的水份吸收掉。

然後貼葯敏紙片；（4）注意：避免用過濃的菌液，禁用未經稀釋菌或其他不標准菌液接種平板。

5.3 貼紙片 （1）接種平板後，貼上葯敏紙片。

用鑷子或針尖壓一下紙片使其與培養基表面貼牢。

紙片要貼得均勻，紙片與紙片中心距離不得小於24mm。

原則上，直徑150mm得平板貼12張紙片，直徑100mm平板貼5張紙片。

紙片貼後不應再移動，因為有些葯物會立即擴散；（2）貼上紙片15分鍾內，須把平板倒放在35℃恆溫箱中。

因為抑菌環解釋標準是在普通環境中標定的，所以除嗜血桿菌和淋病奈瑟氏菌外，平板不可放在高CO2的環境中。

CO2與某些因素作用可使抑菌環增大。

5.4 讀取結果 （1）經16－18小時培養後，觀察結果。

菌液濃度適合且塗得好，抑菌環規則，細菌呈融合生長。

如果出現單個菌落，說明接種量小，需重做試驗，測量抑菌環直徑須包含紙片直徑：手持平皿從背面目測檢查每快平板，借反射光（黑色無放光背景），用卡尺、普通尺或特製的模板量取抑菌環直徑，單位為毫米。

培養基中如果加了血液，須打開平皿蓋，借反射光，從正面量抑菌環。

如果是葡萄球菌或腸球菌，須培養24小時後，經投射光檢查苯唑青黴素和萬古黴素的抑菌環內有無耐葯菌株的生長。

抑菌環內有任何生長的表現都表明是耐葯菌株。

（2）肉眼見不到細菌明顯生長的區域為抑菌環邊緣，有很難辨認的細小菌落不算。

如抑菌環內有大量細菌生長，須再移植出來，重新鑒定，重新做葯敏試驗。

變形菌在某些抗菌葯物紙片周圍可彌漫生長到抑菌的區域內，當抑菌環邊緣清楚，彌漫生長不算。

甲氧苄氨嘧啶和磺胺葯的拮抗劑會支持細菌生長，因而測這類葯時可忽略輕微生長（80％以上受抑制），以濃密生長的區域作為抑菌環的界限。

用加血的培養基測鏈球菌，測量抑菌環時不包括溶血環。

（3）參照表2的標准對抑菌環的大小作出解釋，以敏感、中介或耐葯的形式解釋結果。

6 嬌嫩細菌

Mueller-Hinton培養基只適用於快速生長的細菌，一般不適於測定嬌嫩細菌。

嬌嫩細菌的葯敏試驗如果要用紙片法做，培養基、質量控制方法、解釋標准都須做修改以適合每種細菌。

以下介紹的紙片方法用於流感嗜血桿菌，淋病奈瑟氏菌和肺炎鏈球菌等嬌嫩細菌，結果是准確的。

其他細菌須用稀釋法測定。

厭氧菌不能用紙片擴散法測定抗菌葯物敏感性。

6.1 嗜血桿菌

6.1.1 培養基 紙片擴散法試驗適用的培養基稱為：嗜血桿菌試驗培養基（HTM），配方如下：（1）Mueller-Hinton瓊脂；（2）15μg/mlNAD；（3）15μg/ml牛血紅素；（4）5μg/ml酵母粉；（5）pH7.2-7.4；配製HTM，先配製血紅素貯存液：50mg血紅素加到100ml 0.01M熱NaOH液中，攪拌至粉末完全融解。

此貯存液30ml加入到1000mlM-H瓊脂中，再加入5g酵母粉。

高壓滅菌，冷卻後，加入3mlNAD貯存液（50mgNAD溶於10ml蒸餾水，過濾除菌）。

不能用巧克力M-H瓊脂做嗜血桿菌的葯敏試驗。

6.1.2 操作步驟 用過夜培養的巧克力平板上的菌落制備接種菌液，操作如下：（1）直接用過夜培養的巧克力平板上的菌落在M-H肉湯或生理鹽水中調制菌懸液，用光度儀與0.5麥氏比濁管比濁，校正濃度。

合格的菌液濃度為：1－4×108CFU/ml。

制備菌液應特別注意，菌液濃度過高可導致出現對某些β－內醯胺類葯物的假耐葯結果，特別是某些產β－內醯胺酶的流感嗜血桿菌。

菌液須在15分鍾內使用。

（2）其他步驟按5.2操作，不同處在於：直徑150mm平板至多貼9張紙片。

（3）平板放5－7％CO2環境，35℃過夜孵育16－18小時，測量抑菌環直徑。

6.1.3 抑菌環解釋標准 嗜血桿菌應測的葯物濃度見表1A，按表2A列出的抑菌環解釋標准判定結果。

除此之外無需測定其他葯物。

6.2 淋病奈瑟氏菌

6.2.1 培養基 測定淋病奈瑟氏菌的標准培養基是加有1％添加劑的GC瓊脂，不必補充其他添加劑，也不能用強化的巧克力瓊脂。

6.2.2 操作步驟 （1）直接用過夜培養的巧克力平板上的菌液在M-H肉湯或生理鹽水中調至菌懸液，用光度儀與0.5麥氏比濁管比濁，校正濃度。

菌液須在15分鍾內使用。

（2）其他步驟按5.2操作，不同之處在於：直徑150mm平板至多貼9張紙片，100mm平板至多貼4張。

（3）平板放5－7％CO2環境35℃孵育20－24小時後，測量抑菌環直徑。

6.2.3 抑菌環解釋標准 淋病奈瑟氏菌應測的葯物見表1A，按表2B列出的抑菌環解釋標准判斷結果。

除此之外無需測其他葯物。

註：在10U青黴素紙片周圍產生的抑菌環≤19mm的菌株，一般均產生β－內醯胺酶。

確認這種由質粒決定的耐葯性菌株，應當做β－內醯胺酶試驗。

質粒決定的對四環素耐葯的菌株，抑菌環直徑≤19mm（30μg四環素紙片）。

此外，由染色體決定的對青黴素和四環素耐葯的菌株所產生的抑菌環較大，解釋標准見表2B。

6.3 肺炎鏈球菌和其他鏈球菌

6.3.1 培養基 用加5％脫纖維羊血的M-H瓊脂做肺炎鏈球菌和其他鏈球菌的葯敏試驗。

6.3.2 操作步驟 （1）直接用過夜培養的血平板上的菌落在M-H肉湯或生理鹽水中調制菌懸液，用光度儀與0.5麥氏比濁管比濁，校正濃度。

菌液須在15分鍾內使用。

（2）其他步驟按5.2操作，不同處在於：直徑150mm平板至多貼9張紙片，100mm平板至多貼4張。

（3）平板放5％CO2環境35℃孵育20－24小時後，測量抑菌環直徑。

6.3.3 抑菌環解釋標准 肺炎鏈球菌和其他鏈球菌應測的葯物見表1A，按表2C列出的抑菌環解釋標准判定結果。

註：對青黴素敏感的菌株，苯唑西林抑菌環直徑≥20mm。

耐葯和相對耐葯的菌株抑菌環直徑≤19mm，不能報告對青黴素耐葯或中度耐葯，須測MIC。

苯唑西林葯敏結果只能推測肺炎鏈球菌對青黴素的葯敏，不能推測其他鏈球菌對青黴素的葯敏。

從無菌部位（如腦脊液、血液、骨髓等）分離的草綠色鏈球菌須測青黴素MIC。

草綠色鏈球菌的青黴素葯敏試驗不能用紙片法。

6.4 甲氧苯青黴素耐葯的葡萄球菌 仍有不少實驗室在檢測MRS時會遇到問題，為了更好檢出這種菌株，需了解以下幾點：（1）用苯唑西林紙片而不是甲氧西林或乙氧西林。

因此，用1μg苯唑西林紙片檢測甲氧西林/苯唑西林的耐葯性。

（2）直接用菌懸液法（5.1.2）接種。

（3）檢測MRS必須在35℃孵育滿24小時（而不是16－18小時）。

（4）借透射光仔細檢查苯唑西林紙片周圍抑菌環內有無細小菌落或輕微彌漫生長。

（5）MRS通常對多種抗生素耐葯，包括β－內醯胺類、氨基糖苷類、大環內脂類、氯黴素類和四環素類。

了解是否多重耐葯有助於推測對甲氧西林耐葯性。

（6）如果紙片法結果有疑問，需以篩選試驗驗證。

（7）甲氧西林耐葯金黃色葡萄球菌（MRSA）和甲氧西林耐葯凝固酶陰性葡萄球菌對所有頭孢菌素類和β－內醯胺類如阿莫西林/棒酸、阿莫西林/舒巴坦和依米配能耐葯，無論體外試驗結果如何。

因為，至今的文獻報道，β－內醯胺類葯物治療甲氧西林耐葯的感染效果很差，幾乎沒有治療成功的資料。

6.5 耐葯腸球菌

6.5.1 青黴素/氨苄西林葯敏試驗 腸球菌對青黴素和氨苄西林耐葯系因為產生低親和力的青黴素結合蛋白（PBPs），個別菌株是由於產生β－內醯胺酶。

紙片法葯敏試驗可准確測定PBPs改變的菌株，但對產β－內醯胺酶的菌株結果不可靠。

此類菌株應測β－內醯胺酶。

6.5.2 萬古黴素葯敏試驗 腸球菌的紙片法萬古黴素葯敏試驗，平板必須孵育24小時（而不是16－18小時），借投射光仔細檢查抑菌環內有無小菌落或彌漫生長。

紙片法結果為中介度時應測MIC.

6.5.3 氨基糖苷類高水平耐葯試驗 對氨基糖苷類葯物高水平耐葯，可提示不能用青黴素或粘肽類與氨基糖苷類聯合用葯治療腸球菌的感染。

用高濃度慶大黴素（120μg）和鏈黴素（300μg）紙片篩選這類耐葯菌株。

無抑菌環為耐葯，抑菌環≥10mm為非高水平耐葯。

抑菌環在7－9mm之間再用稀釋法篩選試驗測定。

特殊高濃度紙片的質控見表3。

不必測其他氨基糖苷類葯物，因為沒有比慶大黴素或鏈黴素更強的同類葯。

6.6 測定產超廣譜β－內醯胺酶的革蘭氏陽性桿菌 超廣譜β－內醯胺酶（ESBLs）是新認識的一類由質粒介導的β－內醯胺酶，如TEM-1、TEM-2、SHV-1。

ESBLS導致肺炎克雷白氏菌、產酸克雷白氏菌、大腸埃希氏菌和另外幾種腸桿菌出現對頭孢三嗪、頭孢他啶、氨曲南和廣譜青黴素類及結構相關的β－內醯胺類葯物的耐葯。

某些ESBLs導致高水平耐葯，須用紙片法檢測。

另有低水平耐葯株或只能用某個β－內醯胺類葯才能測出來。

這類菌株的MIC達不到NCCLS規定的耐葯分界點，但臨床治療無效。

克雷白氏菌和大腸埃希氏菌的臨床分離株如果對博拿黴素、頭孢他啶、氨曲南、頭孢胺噻肟或頭孢三嗪的抑菌環減小，提示具有ESBL。

細菌產生ESBL時，加入棒酸，抑菌環增大。

ESBL測定的可靠方法尚在研究中。

目前可參考表1和表4。

7 β－內醯胺酶試驗

7.1 目的 對嗜血桿菌、淋病奈瑟氏菌和卡他莫拉氏菌，快速β－內醯胺酶試驗比紙片法葯敏試驗的結果快。

對產β－內醯胺酶的腸球菌，這是唯一可靠方法。

β－內醯胺酶試驗陽性可推測：（1）淋病奈瑟氏菌、嗜血桿菌、卡他布蘭漢氏菌對青黴素、氨苄青黴素和羥氨苄青黴素的耐葯；（2）葡萄球菌對青黴素及氨基、羧基和醯尿基青黴素類葯物的耐葯性。

⑵ 如何進行抗生素葯敏試驗

你好！
葯敏試驗
葯敏試驗根據美國臨床標准委員會（NCCLS）推薦的K-B瓊脂法進行，葯敏紙片選擇中國生物製品鑒定所葯敏紙片，試驗所選擇葯物必須包括下列抗生素：氨苄西林（AMP），阿莫西林/克拉維酸（AMC），頭孢噻吩（CFT），頭孢噻肟（CTX），慶大黴素（GEN），萘啶酸（NAL），環丙沙星（CIP），四環素（TBT），利福平（RFA），復方新諾明（SMZ）。葯敏結果判定標准按照NCCLs手冊2005版。
1. 操作方法：
（1）將待檢菌接種於普通營養瓊脂平板，37℃培養16～18小時，然後挑取普通營養瓊脂平板上的純培養菌落，懸於3ml生理鹽水中，混勻後與菌液比濁管比濁。以有黑字的白紙為背景，調整濁度與比濁管（0.5麥氏單位）相同。
（2）用無菌棉拭子蘸取菌液，在管壁上擠壓去掉多餘菌液。用棉拭子塗布整個M-H培養基表面，反復幾次，每次將平板旋轉60度，最後沿周邊繞兩圈，保證塗均勻。
（3）待平板上的水分被瓊脂完全吸收後再貼紙片。用無菌鑷子取葯敏紙片貼在平板表面，紙片一貼就不可再拿起。每個平板貼5張紙片，每張紙片間距不少於24mm，紙片中心距平皿邊緣不少於15mm。在菌接種後15分鍾內貼完紙片。
（4）將平板反轉，孵育18～24小時後取出，用游標卡尺測量抑菌圈直徑，從平板背面測量最接近的整數毫米數並記錄（附表6）。抑菌環的邊緣以肉眼見不到細菌明顯生長為限。有的菌株可出現蔓延生長，進入抑菌環，磺胺葯在抑菌環內出現輕微生長，這些都不作為抑菌環的邊緣。結果判斷依據鑒定所葯敏紙片判定標准。
（5）每次葯敏試驗必須用ATCC 25922大腸桿菌做質控。只有當質控菌株的抑菌圈直徑在允許范圍內測試菌株的結果才可以報告。ATCC 25922的結果必須與測試菌株同時記錄和報告在附表6中。
0.5麥氏比濁管配製方法：
0.048M BaCL2 (1.17% W/V BaCL2 . 2H2O) 0.5ml
0.36N H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml
將二液混合，置螺口試管中，放室溫暗處保存。用前混勻。有效期為6個月。

2. 注意事項：
(1) 制備MH瓊脂平板應用直徑90mm平皿，在水平的實驗台上傾注。瓊脂厚為4±0.5mm（約25-30ml培養基），瓊脂凝固後塑料包裝放4℃保存，在5日內用完，使用前應在37℃培養箱烤乾平皿表面水滴。傾注平皿前應用pH計測pH值是否正確(pH應為7.3)。pH過低會導致氨基糖苷類，大環內酯類失效，而青黴素活力增強。
(2) 葯敏紙片長期儲存應於－20℃，日常使用的小量紙片可放在4℃，但應至於含乾燥劑的密封容器內。使用時從低溫取出後,放置平衡到室溫後才可打開，用完後應立即將紙片放回冰箱內的密封容器內。 過期紙片不能使用, 應棄去。
(3) 不穩定葯物如亞胺培南, 頭孢克洛, 克拉維酸復合葯等, 應冷凍保存, 最好在-40 ℃以下。
(4) 保證質控菌株不變異的簡便方法，將新得到的凍干菌株接種含血的M-H平板復活。然後每株細菌接種10支高層瓊脂管，放置冰箱保存。每月取出一支，傳出細菌供常規用。待用剩至最後一支，可傳種在M-H平板上，再接種一批高層瓊脂管備用。如此可保證原始菌種永不接觸抗菌素。
3.質量控制
質量控制方法 是用與常規實驗相同的操作方法，測定質控菌株的抑菌環。應使用新鮮傳代的菌種。接種菌液的塗布方法等均同常規操作，測定的抗菌素種類也應與常規測定的種類相同。

⑶ 葯物敏感試驗的實驗步驟

1.1普通營養瓊脂培養基：可去生化試劑店購買，做不同細菌的葯敏試驗可選擇不同的培養基，如做大腸桿菌的葯敏試驗可選擇普通營養瓊脂或麥糠凱培養基。做沙門氏菌可選擇血清培養基。
1.2葯敏試紙：購買或自製（詳見實驗准備）
1.3細菌：待做葯敏試驗的細菌
1.4接種環、酒精燈、打孔器、牛津杯
1.5移液器、滴頭 2.1葯敏片的准備：購買或自製
2.1.1葯敏片的制備：取新華1號定性濾紙，用打孔機打成6毫米直徑的圓形小紙片。取圓紙片50片放入清潔乾燥的青黴素空瓶中，瓶口以單層牛皮紙包紮。經15磅15-20分鍾高壓消毒後，放在37℃溫箱或烘箱中數天，使完全乾燥。
2.2.2抗菌葯紙片製作：在上述含有50片紙片的青黴素瓶內加入葯液0.25毫升，並翻動紙片，使各紙片充分浸透葯液，翻動紙片時不能將紙片搗爛。同時在瓶口上記錄葯物名稱，放37℃溫箱內過夜，乾燥後即密蓋，如有條件可真空乾燥。切勿受潮，置陰暗乾燥處存放，有效期3-6個月。各種常用葯的葯液配製詳見表-2
2.2葯液的制備（用於商品葯的試驗）：按商品葯的使用治療量的比例配製葯液；如商品葯百病消按其說明量治療量0.01%飲水，可按這個比例配製葯液，可取10毫克加入10毫升的水中混勻。此稀釋液即為用於做葯敏試驗的葯液。 3.1葯敏片法
3.1.1在「超凈台」中，用經（酒精燈）火焰滅菌的接種環挑取適量細菌培養物，以劃線方式將細菌塗布到平皿培養基上。具體方式；用滅菌接種環取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點塗菌，以每點開始劃線塗菌至平皿的1/2。然後，找到第二點劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細菌均勻密布於平皿。（另：可挑取待試細菌於少量生理鹽水中製成細菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液塗布於平皿培養基表面。要求塗布均勻緻密）
3.1.2將鑷子於酒精燈火焰滅菌後略停，取葯敏片貼到平皿培養基表面。為了使葯敏片與培養基緊密相貼，可用鑷子輕按幾下葯敏片。為了使能准確的觀察結果，要求葯敏片能有規律的分布於平皿培養基上；一般可在平皿中央貼一片，外周可等距離貼若乾片（外周一般可貼七片），每種葯敏片的名稱要記住。
3.1.3將平皿培養基置於37℃溫箱中培養24小時後，觀察效果。
3.2牛津杯法
3.2.1在「超凈台」中，用經（酒精燈）火焰滅菌的接種環挑取適量細菌培養物，以劃線方式將細菌塗布到平皿培養基上。具體方式；用滅菌接種環取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點塗菌，以每點開始劃線塗菌至平皿的1/2。然後，找到第二點劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細菌均勻密布於平皿。（另：可挑取待試細菌於少量生理鹽水中製成細菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液塗布於平皿培養基表面。要求塗布均勻緻密）
3.2.2以無菌操作將滅菌的不銹鋼小管（內徑6nm、外徑8nm、高10nm的圓形小管，管的兩端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培養基上，輕輕加壓，使其與培養基接觸無空隙，並在小管處標記各種葯物名稱。每個平板可放4-6支小管。待分鍾後，分別向各小管中滴加一定數量的各種葯液，勿使其外溢。置37℃培養8-18小時，觀察結果。
3.2.3將平皿培養基置於37℃溫箱中培養24小時後，觀察效果。
3.3打孔法：該法較簡單，成本低，易操作，比較適用於商品葯物的檢測。
3.3.1在「超凈台」中，用經（酒精燈）火焰滅菌的接種環挑取適量細菌培養物，以劃線方式將細菌塗布到平皿培養基上。具體方式；用滅菌接種環取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點塗菌，以每點開始劃線塗菌至平皿的1/2。然後，找到第二點劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細菌均勻密布於平皿。（另：可挑取待試細菌於少量生理鹽水中製成細菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液塗布於平皿培養基表面。要求塗布均勻緻密）
3.3.2以無菌操作將滅菌的不銹鋼小管（外徑為4毫米、孔徑與孔距均為3毫米，管的兩端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培養基上打孔，將孔中的培養基用針頭挑出，並以火焰封底，使培養基能充分的與平皿融合（以防葯液滲漏，影響結果）。
3.3.3加樣：按不同葯液加樣，樣品加至滿而不溢為止。
3.3.4將平皿培養基置於37℃溫箱中培養24小時後，觀察效果。

⑷ 葯物敏感試驗的葯物敏感試驗的方法

測定細菌對抗菌葯物敏感性的試驗稱為葯物敏感試驗或簡稱葯敏試驗。由於養雞業中抗菌葯物的廣泛使用，導致抗葯菌株越來越多，盲目用葯常常效果不佳。因此，進行葯物敏感試驗已成為正確使用抗菌葯物的必要手段。葯物敏感試驗的方法有多種，如紙片擴散法、試管法、挖洞法等。其中，紙片擴散法簡便易行，出結果快，是目前生產中最常見的方法，現將該種方法介紹如下：

（1）葯敏紙片的准備

常用抗菌葯敏紙片已有商品供應，一般可以買到，可直接利用。

（2）葯敏培養基的制備

①普通肉湯瓊脂：又稱營養瓊脂。蛋白腖10克、氯化鈉（NaCl）15克、磷酸氫二鉀（K₂HPO₄）1克、瓊脂20克、牛輪歲逗肉浸出液1000毫升（可用牛肉浸膏10克浸於1000毫升蒸餾水代替）。

牛肉浸出液的配製方法：取瘦牛肉去掉脂肪、腱膜等，絞碎或切碎，按500克牛肉加1000毫升蒸餾水混合，置4℃冰箱內過夜，取出後加熱到80～90℃，經1小時後，以數層紗布濾除肉渣並擠出肉水，再用脫脂棉過濾，量其體積並用蒸餾水補足1000毫升，分裝後20分鍾高壓蒸汽滅菌，即製成牛肉浸出液。

將以上其他成分加入到牛肉浸出液中，加熱溶解，冷卻後調pH至7.6，煮沸10分鍾，用濾紙過濾後分裝，再以10.4萬帕高壓蒸汽滅菌25分鍾，取出後冷卻至55℃左右，在90毫升直徑滅菌的平皿上傾注成4毫米厚的平板。做好的平雀乎板，密封包裝後可在冰箱中保存2～3周。使用前應將平皿置37℃溫箱中培養24小時，確認無菌後再用於試驗。

②鮮血瓊脂：將滅菌的營養瓊脂加熱融化，至45～50℃時加入無菌鮮血5%（每100毫升營養瓊脂中加入鮮血5～6毫升）傾注平皿。無菌鮮血，用無菌手術取健康動物（綿羊或家兔等）的血液，加入盛有無菌5%檸檬酸鈉溶液的容器中（血與5%檸檬酸鈉的比例為9∶1）混勻，置冰箱中保存備用。

（3）試驗方法

臨床上分離到的細菌進行純培養。用滅菌的接種環挑取被檢菌的純培養物劃線或塗布於平板上，並盡可能使其密而均勻。用滅菌鑷子將葯敏紙片平放於平板上並輕壓使其緊貼平板。直徑9.0厘米的平皿可貼7張紙片，紙片間距不少於24毫米，紙片與平皿邊緣距離不少於15毫米。貼好後將平板底部朝上置於37℃溫箱中培養24小時，取出觀察結果。

（4）結果判定

凡對被檢菌有抑制力的抗菌葯物，由於向周圍擴散，抑制細菌的生長，故在紙片周圍出現一個無細菌生長的圓圈，稱為抑菌圈。抑菌圈越大，說明該菌對此種葯物敏感度越高，反之越低。如果無抑菌圈，則說明該菌對此種葯物具有耐葯性。所以，判定結果時，以抑菌圈直徑的大小來作為細菌對該葯物敏感度高低的標准。

一般來說，抑菌圈直徑70毫米以上為極度敏感，15～20毫米為高度敏感，10～15毫米為中度敏感，10毫米以下為低敏感，無抑菌臘賣圈為不敏感。對多黏菌素的作用，抑菌圈在10毫米以上者為高度敏感，6～9毫米為低度敏感。

經葯敏試驗後，應該選擇極度敏感或高度敏感的葯物進行治療。

⑸ 葯敏試驗簡介

目錄

• 1 概述
• 2 葯敏試驗分類
• 2.1 紙片擴散法
• 2.2 稀釋法
• 2.2.1 瓊脂稀釋法
• 2.2.2 肉湯稀釋法
• 2.3 抗生素濃度梯度法
• 2.4 自動化儀器法
• 3 實驗步驟
• 3.1 實驗材料
• 3.1.1 葯敏試紙
• 3.1.2 細菌
• 3.1.3 儀器
• 3.2 實驗准備
• 3.3 實驗操作方法
• 3.3.1 葯敏片法
• 3.3.2 牛津杯法
• 3.3.3 打孔法
• 3.4 結果觀察
• 3.5 判定標准
• 3.6 影響葯敏結果的因素
• 3.6.1 培養基
• 3.6.2 細菌接種量
• 3.6.3 葯物濃度
• 3.6.4 培養時間
• 4 葯敏試驗的應用

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1 概述

葯敏試驗簡稱葯物敏感試驗（或耐葯試驗）。旨在了解病原微生物對各種抗生素的敏感（或耐受）程度，以指導臨床合理選用抗生素葯物的微生物學試驗。一種抗生素如果以很小的劑量便可抑制、殺滅致病菌，則稱該種致病菌對該抗生素「敏感」。反之，則稱為「不敏感」或「耐葯」。為了解致病菌對哪種抗菌素敏感，以合理用葯，減少盲目性，往往應進行葯物敏感試驗。其大致方法是：從病人的感染部位採取含致病菌的標本，接種在適當的培養基上，於一定條件下培養；同時將分別沾有一定量各種抗生素的紙片貼在培養基表面（或用不銹鋼圈，內放定量抗生素溶液），培養一定時間後觀察結果。由於致病菌對各種抗生素的敏感程度不同，在葯物紙片周圍便出現不同大小的抑制病粗虧菌生長而形成的「空圈」，稱為抑菌圈。抑菌圈大小與致病菌對各種抗生素的敏感程度成正比關系。於是可以根據試驗結果有針對性地選用抗生素。近年已有自動化的葯物敏感試驗儀器問世，使試驗更加迅速、准確。目前濫用抗生素，致使抗葯菌增加，甚至因長期大量使用廣譜抗生素，殺傷體內正常微生物，失去微生物的相互制約作用，從而使一些少見的或一般情況下的非致病菌大量繁殖，引起所謂「二次感染」的情況屢有發生，給治療造成人為的困難。因此，提倡使用葯物敏感試驗，堅持合理用葯十分重要。

2 葯物敏感試驗分類

2.1 紙片擴散法

該法是將含有定量抗菌葯物的濾紙片貼在已接種了測試菌的瓊脂表面上，紙片中的葯物在瓊脂中擴散，隨著擴散距離的增加，抗菌葯物的濃度呈對數減少，從而在紙片的周圍形成濃度梯度。同時，紙片周圍抑菌濃度范圍內的菌株不能生長，二抑菌范圍外的菌株則可以生長，從而在紙片的周圍形成透明的抑菌圈，不同的抑菌葯物的抑菌圈直徑因受葯物在瓊脂中擴散速度的影響而可能不同，抑菌圈的大小可以反映測試菌對葯物的敏感程度，並與該葯物對測試菌的MIC呈負相關。

2.2 稀釋法

稀釋法葯物敏感試驗可用於定量測試抗菌葯物對某一細菌的體外活性，分為瓊脂稀釋法和肉湯稀釋法。實驗時，抗菌葯物的濃度通常經過倍比（lg2）稀釋，能抑制待測菌肉眼可見生長的最低葯物濃度成為最小抑菌濃度（MIC），一個特定抗菌葯物的測試濃度范圍應該包含能夠檢測細菌的解釋性折點（敏感、中介和燃凳薯耐葯）的濃度，同時也應該包含質控參考菌株的MIC.

2.2.1 瓊脂稀釋法

首先制備含抗菌葯物的瓊脂稀釋平板。再接種待測菌株，然後是結果判讀。

2.2.2 肉湯稀釋法

2.3 抗生素濃度梯度法

2.4 自動化儀器法

3 實驗步驟

3.1 實驗材料

普通營養瓊脂培養基：可去生化試劑店購買，做不同細菌的葯物敏感試驗可選擇不同皮者的培養基，如做大腸桿菌的葯物敏感試驗可選擇普通營養瓊脂或麥糠凱培養基。做沙門氏菌可選擇血清培養基。

3.1.1 葯敏試紙

購買或自製（詳見實驗准備）

3.1.2 細菌

待做葯物敏感試驗的細菌

3.1.3 儀器

接種環、酒精燈、打孔器、牛津杯、移液器、滴頭

3.2 實驗准備

葯敏片的准備：購買或自製

制備方法：取新華1號定性濾紙，用打孔機打成6毫米直徑的圓形小紙片。取圓紙片50片放入清潔乾燥的青黴素空瓶中，瓶口以單層牛皮紙包紮。經15磅1520分鍾高壓消毒後，放在37℃溫箱或烘箱中數天，使完全乾燥。

抗菌葯紙片製作：在上述含有50片紙片的青黴素瓶內加入葯液0.25毫升，並翻動紙片，使各紙片充分浸透葯液，翻動紙片時不能將紙片搗爛。同時在瓶口上記錄葯物名稱，放37℃溫箱內過夜，乾燥後即密蓋，如有條件可真空乾燥。切勿受潮，置陰暗乾燥處存放，有效期36個月。

葯液的制備（用於商品葯的試驗）：按商品葯的使用治療量的比例配製葯液；如商品葯百病消按其說明量治療量0.01%飲水，可按這個比例配製葯液，可取10毫克加入10毫升的水中混勻。此稀釋液即為用於做葯物敏感試驗的葯液。

3.3 實驗操作方法

3.3.1 葯敏片法

在「超凈台」中，用經（酒精燈）火焰滅菌的接種環挑取適量細菌培養物，以劃線方式將細菌塗布到平皿培養基上。具體方式；用滅菌接種環取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點塗菌，以每點開始劃線塗菌至平皿的1/2。然後，找到第二點劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細菌均勻密布於平皿。（另：可挑取待試細菌於少量生理鹽水中製成細菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液塗布於平皿培養基表面。要求塗布均勻緻密）

將鑷子於酒精燈火焰滅菌後略停，取葯敏片貼到平皿培養基表面。為了使葯敏片與培養基緊密相貼，可用鑷子輕按幾下葯敏片。為了使能准確的觀察結果，要求葯敏片能有規律的分布於平皿培養基上；一般可在平皿中央貼一片，外周可等距離貼若乾片（外周一般可貼七片），每種葯敏片的名稱要記住。

將平皿培養基置於37℃溫箱中培養24小時後，觀察效果。

3.3.2 牛津杯法

在「超凈台」中，用經（酒精燈）火焰滅菌的接種環挑取適量細菌培養物，以劃線方式將細菌塗布到平皿培養基上。具體方式；用滅菌接種環取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點塗菌，以每點開始劃線塗菌至平皿的1/2。然後，找到第二點劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細菌均勻密布於平皿。（另：可挑取待試細菌於少量生理鹽水中製成細菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液塗布於平皿培養基表面。要求塗布均勻緻密。）

以無菌操作將滅菌的不銹鋼小管（內徑6nm、外徑8nm、高10nm的圓形小管，管的兩端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培養基上，輕輕加壓，使其與培養基接觸無空隙，並在小管處標記各種葯物名稱。每個平板可放46支小管。待分鍾後，分別向各小管中滴加一定數量的各種葯液，勿使其外溢。置37℃培養818小時，觀察結果。

將平皿培養基置於37℃溫箱中培養24小時後，觀察效果。

3.3.3 打孔法

該法較簡單，成本低，易操作，比較適用於商品葯物的檢測。

在「超凈台」中，用經（酒精燈）火焰滅菌的接種環挑取適量細菌培養物，以劃線方式將細菌塗布到平皿培養基上。具體方式；用滅菌接種環取適量細菌分別在平皿邊緣相對四點塗菌，以每點開始劃線塗菌至平皿的1/2。然後，找到第二點劃線至平皿的1/2，依次劃線，直至細菌均勻密布於平皿。（另：可挑取待試細菌於少量生理鹽水中製成細菌混懸液，用滅菌棉拭子將待檢細菌混懸液塗布於平皿培養基表面。要求塗布均勻緻密。）

以無菌操作將滅菌的不銹鋼小管（外徑為4毫米、孔徑與孔距均為3毫米，管的兩端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培養基上打孔，將孔中的培養基用針頭挑出，並以火焰封底，使培養基能充分的與平皿融合（以防葯液滲漏，影響結果）。

加樣：按不同葯液加樣，樣品加至滿而不溢為止。

將平皿培養基置於37℃溫箱中培養24小時後，觀察效果。

3.4 結果觀察

在塗有細菌的瓊脂平板上，抗菌葯物在瓊脂內向四周擴散，其濃度呈梯度遞減，因此在紙片周圍一定距離內的細菌生長受到抑制。過夜培養後形成一個抑菌圈，抑菌圈越大，說明該菌對此葯敏感性越大，反之越小，若無抑菌圈，則說明該菌對此葯具有耐葯性。其直徑大小與葯物濃度、劃線細菌濃度有直接關系。

3.5 判定標准

葯敏實驗的結果，應按抑菌圈直徑大小作為判定敏感度高低的標准。

表1葯物敏感實驗判定標准

抑菌圈直徑（毫米） 敏感度

20以上 極敏

15~20 高敏

10~14 中敏

10以下 低敏

0 不敏

葯物敏感實驗判定標准參考表

1，多黏菌素抑菌圈；在9毫米以上為高敏，6—9毫米為低敏，無抑菌圈為不敏。

3.6 影響葯敏結果的因素

3.6.1 培養基

應根據試驗菌的營養需要進行配製。傾注平板時，厚度合適（約56mm），不可太薄，一般90mm直徑的培養皿，傾注培養基1820ml為宜。培養基內應盡量避免有抗菌葯物的拮抗物質，如鈣、鎂離子能減低氨基糖苷類的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和對氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺葯和TMP的活性。

3.6.2 細菌接種量

細菌接種量應恆定，如太多，抑菌圈變小，能產酶的菌株更可破壞葯物的抗菌活性。

3.6.3 葯物濃度

葯物的濃度和總量直接影響抑菌試驗的結果，需精確配製。商品葯應嚴格按照其推薦治療量配製。

3.6.4 培養時間

一般培養溫度和時間為37℃ 818小時，有些抗菌葯擴散慢如多粘菌素，可將已放好抗菌葯的平板培養基，先置4℃冰箱內2~4小時，使抗菌葯預擴散，然後再放37℃溫箱中培養，可以推遲細菌的生長，而得到較大的抑菌圈。

4 葯物敏感試驗的應用

⑹ 葯敏試驗的具體操作方法

1葯敏實驗操作步驟:在超潔凈工作台內，先將滅菌好的培養基做好標記，無菌取病料（即：肝臟、心臟組織）一小塊，輕輕在滅菌的培養基上塗布幾下（不要突破培養基），然後用接種環再密集劃線。然後，將制備好的葯敏片分別按標記好的位置貼在培養基的表面。記錄好培養皿的標記及葯敏片的順序。最後，將培養皿放入37℃恆溫箱中培養8—12小時即可。
2葯敏實驗結果觀察:培養好後會發現細菌再培養基上均勻分布，同時會看到葯敏片周圍有不同程度的抑菌圈。抑菌圈越大，說明該雞群對這種葯物越敏感；抑菌圈小或沒有抑菌圈，說明該雞群對這種葯物不敏感或已經產生了耐葯性。若在培養皿中出現一團一團的細菌時說明培養皿中有雜菌感染。