檢測蛋白質種類多方法

Ⅰ 蛋白質含量的測定方法

蛋白質含量的十種測定方法如下：

三、雙縮脲法：

實驗原理：雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩個分子脲經180℃左右加熱，放出一個分子氨後得到的產物。在強鹼性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡合物，稱為雙縮脲反應。凡具有兩個醯胺基或兩個直接連接的肽鍵，或能過一個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應。

紫色絡合物顏色的深淺與蛋白質濃度成正比，而與蛋白質分子量及氨基酸成分無關，故可用來測定蛋白質含量。測定范圍為1~10mg蛋白質。干擾這一測定的物質主要有：硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等。

四、BCA法：

實驗原理：BCA檢測法是Lowry測定法的一種改進方法。與Lowry方法相比，BCA法的操作更簡單，試劑更加穩定，幾乎沒有干擾物質的影響，靈敏度更高（微量檢測可達到0.5μg/ml），應用更加靈活。蛋白質分子中的肽鍵在鹼性條件下能與Cu2+絡合生成絡合物，同時將Cu2+還原成Cu+。

二喹啉甲酸及其鈉鹽是一種溶於水的化合物，在鹼性條件下，可以和Cu+結合生成深紫色的化合物，這種穩定的化合物在562nm處具有強吸收值，並且化合物顏色的深淺與蛋白質的濃度成正比。故可用比色的方法確定蛋白質的含量。

五、Lowry法：

實驗原理：蛋白質在鹼性溶液中其肽鍵與Cu2+螯合，形成蛋白質一銅復合物，此復合物使酚試劑的磷鉬酸還原，產生藍色化合物，在一定條件下，利用藍色深淺與蛋白質濃度的線性關系作標准曲線並測定樣品中蛋白質的濃度。

六、考馬斯亮藍法：

實驗原理：考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度，是利用蛋白質―染料結合的原理，定量的測定微量蛋白濃度的快速、靈敏的方法。考馬斯亮藍G―250存在著兩種不同的顏色形式，紅色和藍色。它和蛋白質通過范德華力結合，在一定蛋白質濃度范圍內，蛋白質和染料結合符合比爾定律。

此染料與蛋白質結合後顏色有紅色形式和藍色形式，最大光吸收由465nm變成595nm，通過測定595nm處光吸收的增加量可知與其結合蛋白質的量。蛋白質和染料結合是一個很快的過程，約2min即可反應完全，呈現最大光吸收，並可穩定1h，之後，蛋白質―染料復合物發生聚合並沉澱出來。

七、凱氏定氮法：

實驗原理：凱氏定氮法用於測定有機物的含氮量,若蛋白質的含氮量已知時，則可用此法測定樣品中蛋白質的含量。當蛋白質與濃硫酸共熱時，其中的碳、氫兩元素被氧化成二氧化碳和水，而氮則轉變成氨，並進一步與硫酸作用生成硫酸銨。此過程通常稱為「消化」。

但是，這個反應進行得比較緩慢，通常需要加入硫酸鉀或硫酸鈉以提高反應液的沸點，並加入硫酸銅作為催化劑，以促進反應的進行。

八、Lowry法測定試劑盒：

Folin酚試劑法包括兩步反應：第一步是在鹼性條件下，蛋白質與銅作用生成蛋白質-銅絡合物；第二步是此絡合物將Folin試劑還原，產生深藍色，顏色深淺與蛋白質含量成正比。定量范圍為5～100μg/ml蛋白質。Folin試劑顯色反應由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此樣品中若含有酚類、檸檬酸和巰基化合物均有干擾作用。

此外，不同蛋白質因酪氨酸、色氨酸含量不同而使顯色強度稍有不同。

九、BCA法測定試劑盒：

鹼性條件下，蛋白將Cu2+還原為Cu+，Cu+與BCA試劑形成紫顏色的絡合物，測定其在562nm處的吸收值，並與標准曲線對比，即可計算待測蛋白的濃度。常用濃度的去垢劑SDS，TritonX-100，Tween不影響檢測結果，但受螯合劑(EDTA，EGTA)、還原劑（DTT，巰基乙醇）和脂類的影響。

實驗中，若發現樣品稀釋液或裂解液本身背景值較高，可試用Bradford蛋白濃度測定試劑盒。

十、分光光度計法。

1、取八支（或者更多）干凈的10ml離心管，標記上號。

2、取100ulBSA，加PBS2.4ml稀釋至終濃度為0.2mg/ml。

3、5×G250染色液使用前請顛倒3-5次混勻，取10ml5×G250染色液，加入40ml雙蒸水，混勻成1×G250染色液，此1×G250染色液可在4℃保存一周。

4、按下表加入試劑（以每孔5ml計，多餘的用來清洗比色皿）。

Ⅱ 蛋白質檢測方法

蛋白質檢測方法有凱氏定氮法、雙縮脲法、考馬斯亮藍法等。

1、凱氏定氮法

是一種模簡測定總氮含量的方法，可以在混合物或化合物中檢測。即在催化劑條件下，用濃硫酸消化標本，將標本中的裂早有機氮轉化為無機銨鹽，然後在鹼性環境下將無機銨鹽轉化為氨，用蒸汽蒸餾吸收硼酸溶液，然後用標准鹽酸滴定，計算氮含量。

2、雙縮脲法

是一種用於鑒定蛋白質的分析方法。雙縮脲試劑呈藍色，是一種鹼性含銅測試溶液，它由幾滴1%硫酸銅，1%氫氧化鉀和酒石酸鉀鈉製成。

2、蛋白質能夠幫助人體所需的催化人體內化學反應的酶進行調節，構成重要的生理活性物質。蛋白質也是人體一些重要細胞的基本構成物質之一，補充蛋白質也能夠幫助受傷後的傷口癒合。日常適量補充蛋白質對機體有益，但不宜補充過量，以免加重腸胃和腎臟負擔，引起身體不適。

Ⅲ 蛋白質的檢測方法有哪些

1、凱氏定氮法

凱氏弊余乎定氮法是測定化合物或混合物中總氮量的一種方法。即在有催化劑的條件下，用濃硫酸消化樣品將有機氮都轉變成無機銨鹽，然後在鹼性條件下將銨鹽轉化為氨，隨水蒸氣蒸餾出來並為過量的硼酸液吸收，再以標准鹽酸滴定，就可計算出樣品中的氮量。

由於蛋白質含氮量比較恆定，可由其氮量計算蛋白質含量，故此法是經典的蛋白質定量方法。

優點：可用於所有食品的蛋白質分析中；操作相對比較簡單；實驗費用較低；結果准確，是一種測定蛋白質的經典方法；用改進方法（微量凱氏定氮法）可測定樣品中微量的蛋白質。

缺點：凱氏定氮法只是一個氧化還原反應,把低價氮氧化並轉為氨鹽來測定,而不能把高價氮還原為氮鹽的形式,所以不可以測出物質中所有價態的氮含量。

2、雙縮脲法

雙縮脲法是一個用於鑒定蛋白質的分析方法。雙縮脲試劑是一個鹼性的含銅試液，呈藍色，由1%氫氧化鉀、幾滴1%硫酸銅和酒石酸鉀鈉配製。

當底物中含有肽鍵時（多肽），試液中的銅與多肽配位，配合物呈紫色。可通過比色法分析濃度，在紫外可見光譜中的波長為540nm。鑒定反應的靈敏度為5-160mg/ml。鑒定反應蛋白質單位1-10mg。

優點：測定速度較快，干擾物質少，不同蛋白質產生的顏色深淺相近。

缺點：①靈敏度差； ② 三羥甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等會干擾該反應。

3、酚試劑法

取6支試管分別標號，前5支試管分別加入不同濃度的標准蛋白溶液，最後一支試管加待測蛋白質溶液，不加標准蛋白溶液，在室溫下放置30分鍾，以未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照，於650nm波長處測定各管中溶液的吸光度值。

優點：靈敏度高，對水溶性蛋白質含量的測定很有效。

缺點：①費時，要精確控制操作時間；②酚法試劑的配製比較繁瑣。

4、紫外吸收法

大多數蛋白質在280nm波長處有特徵的最大吸收，這是由於蛋白質中租悉有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用於測定0.1～0.5mg/mL含量的蛋白質溶液。

取9支試管分別標號，前8支試管分別加入不同濃度的標准蛋白溶液，1號試管不加標准蛋白溶液，最後一支試管加待測蛋白質溶液，而不加標准蛋白溶液，每支試管液體總量通過加入蒸餾水補足而保持一致，將液體混合均勻，在280nm波長處進行比色，記錄吸光度值。

優點：簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，測定後能回收。 

缺點：①測定蛋白質含量的准確度較差，專一性差； ②干擾物質多，若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物質，會出現較大的干擾。

5、考馬斯亮藍法

考馬斯亮藍顯色法的基本原理是根據蛋白質可與考馬斯亮藍G-250 定量結合。當考馬斯亮藍 G-250 與蛋白質結合後，其對可見光的最大吸收峰從 465nm 變為 595nm。

在考馬斯亮藍 G-250 過量且濃度恆定的情況下，當溶液中的蛋白質濃度不同時，就會有不同量的考馬斯亮藍 G-250 從吸收峰為 465nm 的形式轉變成吸收峰為 595nm 的形式，而且這種轉變有一定的數量關系。

一般情況，當溶液中的蛋白質濃度增加時，顯色液在 595nm 處的吸光度基本能保持線性增加，因此可以用考馬斯亮藍 G-250 顯色法來測定溶液中蛋白質的含量。

優點：靈敏度高，測定快速、簡便，干擾物質少，不受酚類、游離氨基酸和緩沖劑、絡合劑的影響，適合大量樣品的測定。

缺點：由於各毀謹種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同,因此用於不同蛋白質測定時有較大的偏差。

Ⅳ 三種常見蛋白質含量測定方法

三種常見蛋白質含量測定方法如下：

3、Lowry法也是一種多功能性的定量方法，該方法能測定有機物中蛋白質、氨基酸等氮含量，以及各種物質中的親合體，操作過程簡單，精度也較高，比Kjeldahl法快7倍以上，Lowry法原理是蛋白質分解成其中的氨基酸，通過對色比色反應，底物絡合過程蘆磨自絡合金屬，再經冷醯麟處理，醯騰中色素降解，形成比色熒光，定量檢測氮含量，從而間接得到蛋白質含量。