抑肽酶鑒別方法

Ⅰ 蛋白質的分離純化技術有哪些

蛋白質的分離純化方法很多，主要有：
（一）根據蛋白質溶解度不同的分離方法
1、蛋白質的鹽析
中性鹽對蛋白質的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質的溶解度增加，此稱鹽溶；當鹽濃度繼續升高時，蛋白質的溶解度不同程度下降並先後析出，這種現象稱鹽析，將大量鹽加到蛋白質溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的 SO4 和 NH4)有很強的水化力，可奪取蛋白質分子的水化層，使之「失水」，於是蛋白質膠粒凝結並沉澱析出。鹽析時若溶液 pH 在蛋白質等電點則效果更好。由於各種蛋白質分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調節混合蛋白質溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質分段沉澱。
影響鹽析的因素有：（1）溫度：除對溫度敏感的蛋白質在低溫（4 度）操作外，一般可在室溫中進行。一般溫度低蛋白質溶介度降低。但有的蛋白質（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25 度）比 0 度時溶解度低，更容易鹽析。（2）pH 值：大多數蛋白質在等電點時在濃鹽溶液中的溶介度最低。（3）蛋白質濃度：蛋白質濃度高時，欲分離的蛋白質常常夾雜著其他蛋白質地一起沉澱出來（共沉現象）。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質含量在 2.5-3.0%。蛋白質鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。 其中應用最多的硫酸銨，它的優點是溫度系數小而溶解度大（25 度時飽和溶液為 4.1M，即 767 克/升；0 度時飽和溶解度為 3.9M，即 676 克/升），在這一溶解度范圍內，許多蛋白質和酶都可以鹽析出來；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質變性。硫酸銨溶液的 pH 常在 4.5-5.5 之間，當用其他 pH 值進行鹽析時，需用硫酸或氨水調節。蛋白質在用鹽析沉澱分離後，需要將蛋白質中的鹽除去，常用的辦法是透析，即把蛋白質溶液裝入秀析袋內（常
用的是玻璃紙），用緩沖液進行透析，並不斷的更換緩沖液，因透析所需時間較長，所以最好在低溫中進行。此外也可用葡萄糖凝膠 G-25 或 G-50 過柱的辦法除鹽，所用的時間就比較短。
2、等電點沉澱法
蛋白質在靜電狀態時顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小，各種蛋白質的等電點有差別，可利用調節溶液的 pH 達到某一蛋白質的等電點使之沉澱，但此法很少單獨使用，可與鹽析法結合用。
3、低溫有機溶劑沉澱法
用與水可混溶的有機溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數蛋白質溶解度降低並析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質較易變性，應在低溫下進行。
（二）根據蛋白質分子大小的差別的分離方法
1、透析與超濾
透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質分開。超濾法是利用高壓力或離心力，強使水和其他小的溶質分子通過半透膜，而蛋白質留在膜上，可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質。
2、凝膠過濾法
也稱分子排阻層析或分子篩層析，這是根據分子大小分離蛋白質混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠（Sephadex ged）和瓊脂糖凝膠（agarose gel）。
（三）根據蛋白質帶電性質進行分離
蛋白質在不同 pH 環境中帶電性質和電荷數量不同，可將其分開。
1、電泳法
各種蛋白質在同一 pH 條件下，因分子量和電荷數量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳，這是利用一種兩性電解質作為載體，電泳時兩性電解質形成一個由正極到負極逐漸增加的 pH 梯度，當帶一定電荷的蛋白質在其中泳動時，到達各自等電點的 pH 位置就停止，此法可用於分析和制備各種蛋白質。
2、離子交換層析法
離子交換劑有陽離子交換劑（如：羧甲基纖維素；CM-纖維素）和陰離子交換劑（二乙氨基乙基纖維素；DEAE?FONT FACE="宋體" LANG="ZH-CN">纖維素），當被分離的蛋白質溶液流經離子交換層析柱時，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質被吸附在離子交換劑上，隨後用改變 pH 或離子強度辦法將吸附的蛋白質洗脫下來。
（四）根據配體特異性的分離方法－親和色譜法
親和層析法（aflinity chromatography）是分離蛋白質的一種極為有效的方法，它經常只需經過一步處理即可使某種待提純的蛋白質從很復雜的蛋白質混合物中分離出來，而且純度很高。這種方法是根據某些蛋白質與另一種稱為配體(Ligand）的分子能特異而非共價地結合。其基本原理：蛋白質在組織或細胞中是以復雜的混合物形式存在，每種類型的細胞都含有上千種不同的蛋白質，因此蛋白質的分離（Separation），提純（Purification）和鑒定（Characterization）是生物化學中的重要的一部分，至今還沒的單獨或一套現成的方法能移把任何一種蛋白質
從復雜的混合蛋白質中提取出來，因此往往採取幾種方法聯合使用。

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Ⅱ 酶聯免疫試劑盒的試劑盒

自從Engvall和Perlman（1971）首次報道建立ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)（Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays, ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)）以來，由於ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)具有快速、敏感、簡便、易於標准化等優點，使其得到迅速的發展和廣泛應用 。盡管早期的ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)由於特異性不夠高而妨礙了其在實際中應用的步伐，但隨著方法的不斷改進、材料的不斷更新，尤其是採用基因工程方法制備包被抗原，採用針對某一抗原表位的單克隆抗體進行阻斷ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)試驗，都大大提高了ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)的特異性，加之電腦化程度極高的ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)檢測儀的使用，使ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)更為簡便實用和標准化，從而使其成為最廣泛應用的檢測方法之一。
目前ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)方法已被廣泛應用於多種細菌和病毒等疾病的診斷。在動物檢疫方面，ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)在豬傳染性胃腸炎、牛副結核病、牛傳染性鼻氣管炎、豬偽狂犬病、藍舌病等的診斷中已為廣泛採用的標准方法。 (一) 基本原理 ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)方法的基本原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價結合，此種結合不會改變抗體的免疫學特性，也不影響酶的生物學活性。此種酶標記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發生特異性結合。滴加底物溶液後，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無色的還原型變成有色的氧化型，出現顏色反應。因此，可通過底物的顏色反應來判定有無相應的免疫反應，顏色反應的深淺與標本中相應抗體或抗原的量呈正比。此種顯色反應可通過ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)檢測儀進行定量測定，這樣就將酶化學反應的敏感性和抗原抗體反應的特異性結合起來，使ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)方法成為一種既特異又敏感的檢測方法。
(二) 用於標記的酶 用於標記抗體或抗抗體的酶須具有下列特性：有高度的活性和敏感性；在室溫下穩定；反應產物易於顯現；能商品化生產。目前應用較多的有辣根過氧化物酶（HRP）、鹼性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以HRP應用最廣。
1.辣根過氧化物酶（HRP） 過氧化物酶廣泛分布於植物中，辣根中含量最高，從辣根中提取的稱辣根過氧化物酶（HRP），是由無色酶蛋白和深棕色的鐵卟啉構成的一種糖蛋白（含糖量18%），分子量約40 000，約由300個氨基酸組成，等電點為pH 3-9，催化反應的最適pH值因供氫體不同而稍有差異，一般多在pH 5左右。此酶溶於水和50%飽和度以下的硫酸銨溶液。酶蛋白和輔基的最大吸收光譜分別為275nm和403nm。
酶的純度以RZ表示：RZ=OD403/OD275
純酶的RZ多在3.0以上，最高為3.4。RZ在0.6以下的酶製品為粗酶，非酶蛋白約占 75%，不能用於標記。RZ在2.5以上者方可用於標記。HRP的作用底物為過氧化氫，催化反應時的供氫體有幾種：（1）鄰苯二胺（OPD），產物為橙色，可溶性，敏感性高，最大吸收值在490nm，可用肉眼觀察判別，容易被濃硫酸終止反應，顏色可在數小時內不改變,是目前國內ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)中最常用的一種；（2）聯大茴香胺（OD）,產物為橘黃色，最大吸收值在400nm，顏色較穩定；（3）5－氨基水楊酸（5－AS）：產物為深棕色，最大吸收值在450nm，部分溶解，敏感性較差；（4）鄰聯甲苯胺（OT）產物為藍色，最大吸收值在630nm，部分溶解，不穩定，不耐酸，但反應快，顏色明顯。
2.鹼性磷酸酶 系從小牛腸粘膜和大腸桿菌中提取，由多個同功酶組成。它們的底物種類很多，常用者為硝基苯磷酸鹽，廉價無毒性。酶解產物呈黃色，可溶，最大吸收值在400nm。酶的活性以在pH10反應系統中，37℃1分鍾水解1μg磷酸苯二鈉為一個單位。
(三) 抗體的酶標記方法及標記效果測定
1.標記方法 良好的酶結合物取決於兩個條件：即高效價的抗體和高活性的酶。抗體的活性和純度對制備標記抗體至關重要，因為特異性免疫反應隨抗體活性和純度的增加而增強。在酶標記過程中，抗體的活性有所降低，故需要純度高、效價高及抗原親和力強的抗體球蛋白，最好使用親和層析提純的抗體，可提高敏感性，而且可稀釋使用，減少非特異性吸附。
酶與抗體交聯，常用戊二醛法和過碘酸鹽氧化法。郭春祥建立的HRP標記抗體的改良過碘酸鈉法簡單易行，標記效果好，特別適用於實驗室的小批量制備。其標記程序為：將5μg HRP溶於0.5ml蒸餾水中，加入新鮮配製的0.06 mol/L的過碘酸鈉（NaIO4）水溶液0.5ml，混勻置4℃冰箱30分鍾 ， 取出加入0.16mol/L的乙二醇水溶液0.5ml，室溫放置30分鍾後加入含5(g純化抗體的水溶液1ml，混勻並裝透析袋，以0.05mol/L、pH9.5的碳酸鹽緩沖液於4℃冰箱中慢慢攪拌透析6小時（或過夜）使之結合，然後吸出，加硼氫化鈉（NaBH4）溶液（ 5(g/ml)0.2ml，置4℃冰箱2小時，將上述結合物混合液加入等體積飽和硫酸銨溶液，置4℃冰箱30分鍾後離心，將所得沉澱物溶於少許0.02mol/L、pH7.4PBS中，並對之透析過夜（4℃），次日離心除去不溶物，即得到酶標抗體，用0.02mol/L、pH7.4PBS稀至5ml，進行測定後，冷凍乾燥或低溫保存。
2.酶標抗體標記效果測定：測定內容包括酶和抗體活性、結合物中酶含量和IgG含量、酶與IgG摩爾比值以及結合率。
(1) 酶與抗體的活性 常用瓊脂擴散或免疫電泳法，使抗原與抗體形成沉澱線，經PBS漂洗1天，再以蒸餾水浸泡1小時，將瓊脂凝膠片浸於酶底物溶液中著色，如果出現應有的顏色反應，再用生理鹽水浸泡，顏色仍然不褪，表示結合物既有酶的活性，也有抗體活性。良好的結合物在顯色後，瓊擴滴度應在1:16以上。另一個測定方法是用系列稀釋的酶標抗體直接以ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)方法進行方陣滴定，此法不僅可以測定標記效果，還可以確定酶標抗體的使用濃度。
(2) 結合物的定量測定 一般是對結合物中的酶和IgG進行定量測定。常用紫外分光光度計於403nm和280nm進行測定，然後按下列公式計算：
酶量（mg/ml）=OD403×0.42
IgG量（mg/ml）=（OD280－OD403×0.4）×0.94×0.62
對於過碘酸鈉氧化法制備的標記抗體量，按下列公式計算：
IgG量（mg/ml）=（OD280－OD403×0.34）×0.62
已知酶量和IgG量後，即可計算出標記抗體的摩爾（mol）比值。
HRP/IgG摩爾比值=HRP（mg/ml）/IgG（mg/ml）×4
結合物中酶總量=HRP（mg/ml）×結合物溶液量
結合物產率=結合物中酶總量/標記時加入的酶量×100%
用於ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)的結合物的酶量為400(g/ml時效果一般，為500(g/ml時效果較好，達 1000(g/ml時效果最好。mol.比值由於結合物中含的IgG並不完全可靠，所以不能作為主要參數。一般認為mol.比值為0.7時效果一般，1.0時效果較好，1.5-2.0時最好。酶結合率為 7%時效果一般，為9%－10%較好，達30%以上時最好。(四) ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)方法的基本類型、用途及操作程序 1.間接ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒) 本法主要用於檢測抗體。以鴨病毒性肝炎（DVH）抗體的ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)為例，間接ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)的操作程序如下。
(1) 材料
① 包被液、洗滌液、保溫液、底物液、終止液；
② DVH包被抗原、酶標抗抗體、陰性及陽性DVH參考血清；待檢鴨血清；
③ ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)檢測儀、加樣器、聚苯乙烯微量板。
(2) 方法步驟
① 加抗原包被 → 4℃過夜，洗滌三次、拋干
② 加待檢血清 → 37℃ 2小時，洗滌三次、拋干
③ 加酶標抗體 → 37℃ 2小時，洗滌三次、拋干
④ 加底物液 → 37℃ 30分鍾，加終止液
⑤ 用ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)檢測儀測定OD值，並計算出P/N比值。
(3) 結果判定 已知陽性血清與已知陰性血清的比值（P/N）≥2.1，而且已知陽性血清的OD值≥0.4；在上述條件成立的情況下，如果待檢血清與已知陰性血清的比值（P/N）≥2.1，而且待檢血清的OD值≥0.4，則判為陽性，否則判為陰性。
2.雙抗體夾心ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒) 本法主要用於檢測大分子抗原。現以檢測雞傳染性法氏囊病病毒（IBDV）的雙夾心抗體ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)為例介紹本法的操作程序。
① 加抗體包被 → 4℃過夜，洗滌三次、拋干
② 加待檢抗原 → 37℃ 30分鍾，洗滌三次、拋干
③ 加酶標抗體 → 37℃ 30分鍾，洗滌三次、拋干
④ 加底物液 → 37℃ 15分鍾，加終止液
⑤ 用ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)檢測儀測定OD值。
3.雙夾心ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒) 此法與雙抗體夾心ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)的主要區別在於：它是採用酶標抗抗體檢查多種大分子抗原，它不僅不必標記每一種抗體，還可提高試驗的敏感性。此法的基本程序為：
① 加抗體（Ab-1）包被 → 4℃過夜，洗滌三次、拋干
② 加待檢抗原（Ag） → 37℃ 60分鍾，洗滌三次、拋干
③ 加用非同種動物生產的特異性抗體（Ab-2）→ 37℃ 60分鍾，洗滌三次、拋干
④ 加入酶標抗Ab-2抗體（AB-3）→ 37℃ 60分鍾，洗滌三次、拋干
⑤ 加底物液 → 37℃ 20分鍾，加終止液
⑥ 用ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)檢測儀測定OD值。
4.競爭ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒) 此法主要用於測定小分子抗原及半抗原，其原理類似於放射免疫測定。其基本程序為：
① 抗體包被 → 4℃過夜，洗滌三次、拋干
② 加入待檢抗原及一定量的酶標抗原（對照孔僅加酶標抗原）→ 37℃ 60分鍾，洗滌三次、拋干
③ 加底物液 → 37℃ 20分鍾，加終止液
④ 用ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)檢測儀測定OD值。
被結合的酶標抗原的量由酶催化底物反應產生有色產物的量來確定，如果待檢溶液中抗原越多，被結合的標記抗原的量就越少，有色產物就減少，這樣根據有色產物的變化就可求出未知抗原的量。此法的優點在於快速、特異性高、且可用於小分子抗原及半抗原的檢測；其主要不足在於每種抗原都要進行酶標記，而且因為抗原的結構不同，還需應用不同的結合方法。此外，試驗中應用酶標抗原的量較多。5.阻斷ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒) 本法主要用於檢測型特異性抗體。該方法現已成為豬傳染性胃腸炎（TGE）、豬偽狂犬病（PR）及豬胸膜肺炎（AP）的主要檢測方法。下面以AP2型抗體的阻斷ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)檢測法為例介紹其操作程序：
① 100μl AP2型工作量抗原包被 → 4℃過夜，洗滌三次、拋干
② 用200μl阻斷緩沖液進行封閉 → 37℃ 60分鍾，洗滌三次、拋干
③ 加工作量1:4稀釋被檢豬血清100μl → 37℃ 60分鍾，洗滌三次、拋干
④ 加100μl工作量兔抗AP2型血清 → 37℃ 30分鍾，洗滌三次、拋干
⑤ 加100μl工作量豬抗兔IgG-HRP → 37℃ 60分鍾，洗滌三次、拋干
⑥ 加100μl OPD底物液 → 37℃ 20分鍾，加終止液
⑦ 用ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)檢測儀測定OD值。
本試驗同時設標准陰、陽性血清對照、兔抗AP2型陽性對照、空白對照。
6.抗體捕捉ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒) 本法主要用於檢測IgM抗體。由於IgM抗體出現於感染早期，所以檢測出IgM，則可作為某種疾病的早期診斷。抗體捕捉ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)根據所用標記方式不同可分為標記抗原、標記抗體、標記抗抗體捕捉ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)等幾種，其中以標記抗原捕捉ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)比較有代表性，該方法的主要程序為：
① 用抗u鏈（抗IgM重鏈）抗體包被→37℃ 60分鍾後置4℃過夜，洗滌三次、拋干
② 加待檢血清 → 37℃ 2小時，洗滌三次、拋干
③ 加酶標抗原 → 37℃ 60分鍾，洗滌三次、拋干
④ 加底物液 → 37℃ 20分鍾，加終止液
⑤ 用ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)檢測儀測定OD值。
7.斑點ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)（Dot-ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)） 與常規的微量板ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)比較，Dot-ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)具有簡便、節省抗原等優點，而且結果可長期保存；但其也有不足，主要是在結果判定上比較主觀，特異性不夠高等。該方法的主要操作程序為：(1)載體膜的預處理及抗原包被 取硝酸纖維素膜用蒸餾水浸泡後，稍加乾燥進行壓圈。將陰性、陽性抗原及被檢測抗原適度稀釋後加入圈中，置37℃使硝酸纖維素膜徹底乾燥。每張7cm×2.3cm的膜一般可點加40－53個樣品，每個壓圈可加抗原液1－20μl。
(2) 封閉 將硝酸纖維素膜置於封閉液中，37℃感作15－30分鍾。封閉液多採用含有正常動物血清、pH7.2或pH7.4的PBS。
(3) 加被檢血清 可直接在抗原圈上加，也可剪下抗原圈、置於微量板孔中，再加入一定量適度稀釋的待檢血清，37℃反應一定時間，用洗滌液洗三次，每次1－3分鍾。洗滌液一般為一定濃度的PBS-Tween溶液。
(4) 加酶標抗體，37℃反應一定時間後，用洗滌液洗三次。
(5)顯色加入新鮮配製的底物液，37℃反應一定時間後，去掉底物液，加蒸餾水洗滌終止反應。
(6) 結果判定 以陽性、陰險血清作為對照，膜片中央出現深棕紅色斑點者為陽性反應，否則為陰性反應。
8.布ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)（C－ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)） C－ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)（Cloth-ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)）是加拿大學者Blais, B. W.等於1989年建立的一種新型免疫檢測技術。該方法是以疏水性聚脂布（Hydrophobic Polyester Cloth）即滌綸布為固相載體，這種大孔徑的的疏水布具有吸附樣品量大，可為免疫反應提供較大的表面積，提高反應的敏感性，且容易洗滌，不需特殊儀器等優點。其基本原理與Dot-ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)類似，只是載體不同。以對布氏桿菌抗原的檢測為例，C－ELISA(酶聯免疫吸附試驗,酶聯免疫試劑盒)的主要程序為：
(1) 首先把抗布氏桿菌的血清包被（吸附）在聚脂布上，並經洗滌及封閉；
(2) 加被檢樣品並於室溫下感作30分鍾，然後洗5次；
(3) 加酶標記的抗布氏桿菌抗體，於室溫下感作30分鍾，然後洗滌5次；
(4) 加入底物液顯色；
(5) 利用酶標儀測定OD值。 1 標本的採取和保存
可用作ELISA測定的標本十分廣泛，體液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、糞便）等均可作標本以測定其中某種抗體或抗原成份。有些標本可直接進行測定（如血清、尿液），有些則需經預處理（如糞便和某些分泌物）。大部分ELISA檢測均以血清為標本。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其他成份均同等於血清。制備血漿標本需藉助於抗凝劑，而血清標本只要待血清自然凝固、血塊收縮後即可取得。除特殊情況外，在醫學檢驗中均以血清作為檢測標本。在ELISA中血漿和血清可同等應用。血清標本可按常規方法採集，應注意避免溶血，紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質，以HRP為標記的ELISA測定中，溶血標本可能會增加非特異性顯色。
血清標本宜在新鮮時檢測。如有細菌污染，菌體中可能含有內源性HRP，也會產生假陽性反應。如在冰箱中保存過久，其中的可發生聚合，在間接法ELISA中可使本底加深。一般說來，在5天內測定的血清標本可放置於4℃，超過一周測定的需低溫冰存。凍結血清融解後，蛋白質局部濃縮，分布不均，應充分混勻宜輕緩，避免氣泡，可上下顛倒混和，不要在混勻器上強烈振盪。混濁或有沉澱的血清標本應先離心或過濾，澄清後再檢測。反復凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存。保存血清自採集時就應注意無菌操作，也可加入適當防腐劑。
2 試劑的准備
按試劑盒說明書的要求准備實驗中需用的試劑。ELISA中用的蒸餾水或去離子水，包括用於洗滌的，應為新鮮的和高質量的。自配的緩沖液應用pH計測量較正。從冰箱中取出的試驗用試劑應待溫度與室溫平衡後使用。試劑盒中本次試驗不需用的部分應及時放回冰箱保存。
3 加樣
在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標本，加酶結合物，加底物。加樣時應將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，並注意不可濺出，不可產生氣泡。
加標本一般用微量加樣器，按規定的量加入板孔中。每次加標本應更換吸嘴，以免發生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加樣。有此測定（如間接法ELISA）需用稀釋的血清，可在試管中按規定的稀釋度稀釋後再加樣。也可在板孔中加入稀釋液，再在其中加入血清標本，然後在微型震盪器上震盪1分鍾以保證混和。加酶結合物應用液和底物應用液時可用定量多道加液器，使加液過程迅速完成。
4 保溫
在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應，即加標本和加酶結合物後。抗原抗體反應的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育(incubation)，有人稱之為孵育，在ELISA中似不恰當。
ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結合只在固相表面上發生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標本，其中的抗原並不是都有均等的和固相抗結合的機會，只有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程，因此需經擴散才能達到反應的終點。在其後加入的酶標記抗體與固相抗原的結合也同樣如此。這就是為什麼ELISA反應總是需要一定時間的溫育。
溫育常採用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數抗原抗體結合的合適溫度。在建立ELISA方法作反應動力學研究時，實驗表明，兩次抗原抗體反應一般在37℃經1-2小時，產物的生成可達頂峰。為加速反應，可提高反應的溫度，有些試驗在43℃進行，但不宜採用更高的溫度。抗原抗體反應4℃更為徹底，在放射免疫測定中多使反應在冰箱中過夜，以形成最多的沉澱。但因所需時間太長，在ELISA中一般不予採用。
保溫的方式除有的ELISA儀器附有特製的電熱塊外，一般均採用水浴，可將ELISA板置於水浴箱中，ELISA板底應貼著水面，使溫度迅速平衡。為避免蒸發，板上應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時可讓反應板漂浮在水面上。若用保溫箱，ELISA板應放在濕盒內，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，最後將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應先放在保溫箱中預溫至規定的溫度，特別是在氣溫較低的時候更應如此。無論是水浴還是濕盒溫育，反應板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應，操作時的室溫應嚴格限制在規定的范圍內，標准室溫溫度是指20-25℃，但具體操作時可根據說明書的要求控制溫育。室溫溫育時，ELISA板只要平置於操作台上即可。應注意溫育的溫度和時間應按規定力求准確。為保證這一點，一個人操作時，一次不宜多於兩塊板同時測定。
5 洗滌
洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應步驟，但卻也決定著實驗的成敗。ELSIA?是靠洗滌來達到分離游離的和結合的酶標記物的目的。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結合的物質，以及在反應過程中非特異性地吸附於固相載體的干擾物質。聚苯乙烯等塑料對蛋白質的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應把這種非特異性吸附的干擾物質洗滌下來。可以說在ELISA操作中，洗滌是最主要的關鍵技術，應引起操作者的高度重視，操作者應嚴格按要求洗滌，不得馬虎。
洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動洗滌儀外，手工操作有浸泡式和流水沖洗式兩種，過程如下：
（1）浸泡式 a.吸干或甩干孔內反應液；b.用洗滌液過洗一遍（將洗滌液注滿板孔後，即甩去）；c.浸泡，即將洗滌液注滿板孔，放置1-2分鍾，間歇搖動，浸泡時間不可隨意縮短；d.吸干孔內液體。吸干應徹底，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液體後在清潔毛巾或吸水紙上拍干；e.重復操作c和d，洗滌3-4次（或按說明規定）。在間接法中如本底較高，可增加洗滌次數或延長浸泡時間。
微量滴定板多採用浸泡式洗滌法。洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質的結合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，其疏水基團與蛋白質的疏水基團借疏水鍵結合，從而削弱蛋白質與固相載體的結合，並藉助於親水基團和水分子的結合作用，使蛋白質回復到水溶液狀態，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%-0.2%之間，高於0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度。
（2）流水沖洗式 流水沖洗法最初用於小珠載體的洗滌，洗滌液僅為蒸餾水甚至可用自來水。洗滌時附接一特殊裝置，使小珠在流水沖擊下不斷地滾動淋洗，持續沖洗2分鍾後，吸干液體，再用蒸餾水浸泡2分鍾，吸干即可。浸泡式猶如盆浴，流水沖洗式則好比淋浴，其洗滌效果更為徹底，且也簡便、快速。已有實驗表明，流水沖洗式同樣也適用於微量滴定板的洗滌。洗滌時設法加大水流量或加大水壓，讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳。